2027届高三生物一轮复习课件：第10单元　第40讲　第一课时　基因工程的基本工具与操作程序

第40讲第一课时基因工程的基本工具与操作程序课标要求1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的2.阐明重组DNA技术的三种基本工具3.阐明基因工程的基本操作程序命题趋势1.基本工具:重原理、强辨析——考查在具体情境中对工具工作原理的深度理解与辨析2.操作程序:熟步骤、精设计——目的基因的获取与引物设计、基因表达载体的构建(核心)、目的基因的检测与鉴定3.实验探究与前沿技术:强整合、善迁移——关注PCR相关实验和基因编辑技术考点一考点二目录索引

高考真题•演练考点三考点一重组DNA技术的基本工具必备知识•精读教材1.基因工程的概念理解

目的基因基因重组受体分子2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”核苷酸序列磷酸二酯键一种特定的脱氧核苷酸序列黏性末端(2)DNA连接酶——“分子缝合针”(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”质粒稳定保存限制酶切割位点关键能力•练透考法1.(2025·江苏卷改编)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的是(

)A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型相同C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定D解析

基因A突变为致病基因a是由碱基对T—A被G—C替换造成的,A项错误。用Hind

Ⅲ限制酶酶切A基因后会形成黏性末端,用AluⅠ限制酶酶切A基因后,形成的是平末端,B项错误。用AluⅠ限制酶切割a基因有3个酶切位点,而Hind

Ⅲ酶切位点只有2个,所以两种限制酶分别酶切a基因产生的片段大小不同,C项错误。用Hind

Ⅲ限制酶对基因a进行酶切,产生的片段与对基因A的酶切结果不同,通过电泳显示可以进行鉴定诊断,D项正确。2.(2026·重庆模拟)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。图1

酶切位点图

图2

电泳结果示意图

下列叙述错误的是(

)A.两种限制性内切核酸酶识别的核苷酸序列不同,限制酶的识别序列越短,则该DNA被该酶切割的概率越高B.泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物C.若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA片段后电泳,会同时得到泳道①②对应条带D.电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带,离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射C解析

酶具有专一性,不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列,限制酶的识别序列越短,则该DNA被该酶切割的概率越高,A项正确。分析图1可知,限制酶XhoⅠ有两处切割位点,切割后产生3个DNA片段,泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物,B项正确。泳道①②是分别用SalⅠ和XhoⅠ切割DNA分子电泳得到的结果,若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA片段后电泳,应该在一个泳道里出现6种条带,C项错误。电泳条带染色是通过化学或荧光染料与分离后的分子(如DNA、RNA、蛋白质)特异性结合,使其在凝胶中显现,以便观察、分析和记录的关键步骤。因此电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带,离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射,D项正确。【以题悟道】

限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,防止破坏目的基因,如图不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点,而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。

(3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。3.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(

)A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet(四环素)的培养基中能形成菌落D解析

用一种限制酶切割,目的基因在质粒上可以正向或反向插入,进而导致基因转录产物的不同,A项正确。用PvuⅠ酶切,氨苄青霉素抗性基因被破坏,用含四环素的培养基培养,能生长的受体菌可能含重组质粒、正常质粒及自身环化的质粒,B项正确。SphⅠ酶切会在重组质粒上产生特定的片段,通过DNA凝胶电泳技术可以分离和检测这些片段,从而确定重组质粒是否构建成功,C项正确。根据质粒图示,携带目的基因的受体菌需要同时具有AmpR和TetR基因才能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因(TetR),D项错误。考点二基因工程的基本操作程序必备知识•精读教材1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变

或获得

等的基因。主要是指

的基因。

(2)筛选目的基因①从相关的已知

清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

②利用测序技术、

和序列比对工具等进行筛选。

受体细胞性状预期表达产物编码蛋白质结构和功能序列数据库(3)目的基因的获取①人工合成目的基因。a.逆转录法:主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:目的基因的mRNA双链DNA(目的基因)b.化学合成法:依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列

目的基因的核苷酸序列

目的基因②利用PCR

和扩增

。

获取目的基因引物脱氧核苷酸耐高温温度两种引物耐高温的DNA聚合酶指数形式琼脂糖凝胶电泳③通过构建

来获取目的基因。

基因文库2.基因表达载体的构建

基因工程的核心内容(1)构建基因表达载体的目的:使目的基因在受体细胞中

,并且可以

给下一代,并能够

和发挥作用。

(2)基因表达载体的组成稳定存在遗传表达(3)基因表达载体的构建过程

3.将目的基因导入受体细胞

生物类型受体细胞常用方法转化过程植物体细胞花粉管通道法①用微量注射器直接注入

;

②借助花粉管通道进入

子房胚囊农杆菌转化法生物类型受体细胞常用方法转化过程动物

受精卵显微注射技术生物类型受体细胞常用方法转化过程微生物原核细胞感受态细胞法

能够吸收外界DNACa2+处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定

目的基因杂交带易错排查(1)用PCR反应扩增目的基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,用DNA连接酶将两者连接。(2023·广东卷)(

)(2)随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索基因文库获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。(2023·浙江卷)(

)(3)为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(2022·辽宁卷)(

)(4)基因表达载体中,抗生素抗性基因作为标记基因,可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞,终止子可终止翻译,使翻译在需要的地方停下来。(2022·广东卷)(

)√√××科学思维•教考衔接PCR扩增过程如图所示,若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环,得到2n个DNA分子。

(1)完善下表中相关内容:含引物的DNA分子数

含引物A(或B)的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数消耗引物数量含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子数含等长脱氧核苷酸链的DNA分子数

(2)要得到等长的双链DNA分子,至少需要经过

次循环。

32n2n-12n-22n+1-22n2n-2n关键能力•练透考法命题角度一

基因工程的操作程序1.(2026·湖北模拟)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(

)A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0或1个游离的磷酸基团B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因,确保目的基因正确插入D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白C解析

质粒为环状DNA分子,SmaⅠ切割后形成线性DNA,含2个游离磷酸基团,A项错误。基因工程的核心是构建基因表达载体,B项错误。PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接,C项正确。PCR检测目的基因是否导入,抗原—抗体杂交检测是否翻译出目标蛋白,D项错误。2.(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题。(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是

。将培养后的菌液混匀并充分

,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。

在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大稀释(2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有

酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是________________________________________________。

重组质粒连接BamHⅠ

处的序列不再是原来的限制酶识别序列限制酶的识别序列和切割位点如下:图1(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是

,随后在含

和

的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。

(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第

位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是________________________________________________________________________________________________________________________。

使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态卡拉胶四环素44该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小图2解析

(1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大,因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。(2)E.coli

DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4

DNA连接酶,因此为保证连接准确性和效率,切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶,即不能选择EcoRⅤ和SmaⅠ。而SpeⅠ与XbaⅠ切割后形成的黏性末端相同,若选择SpeⅠ与XbaⅠ切割,会出现质粒和目的基因的自连甚至目的基因倒接,因此切割质粒时SpeⅠ与XbaⅠ中只能选择一个,而另一个限制酶需要选择BamHⅠ。又由于转录的方向是由启动子→终止子,mRNA形成的方向是5'端→3'端,且mRNA与DNA的模板链方向相反,因此基因模板链的3'端应靠近启动子,故为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有BamHⅠ酶切位点。由于限制酶的识别序列具有专一性,若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列,则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4

DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶,使其菌落周围形成透明圈,且重组质粒上含有四环素抗性基因,因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。(4)据图可知,虚线长度代表氨基酸间的空间距离,由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小,因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。命题角度二

PCR技术3.(2026·河北模拟)荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量,其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子,即DNA每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如图),荧光监测系统随时接收荧光信号变化。下列叙述错误的是(

)A.图示引物与胞内DNA复制所用引物的化学本质不同B.耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5'端→3'端C.一段待扩增的DNA经过4次循环后,等长目标片段所占比例为1/3D.反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数,与样本DNA浓度呈负相关C解析

细胞内DNA复制时,引物为RNA,而PCR反应中所需的引物为DNA,二者化学本质不同,A项正确。耐高温的DNA聚合酶将脱氧核苷酸连接在引物的3'端,故耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5'端→3'端,B项正确。一段待扩增的DNA经过4次循环后,共得到24=16(个)DNA分子,等长目标片段在第3次循环才开始出现,第3次循环产生2个等长目标片段,第4次循环产生22+2=6(个)等长目标片段,经过4次循环后等长目标片段共有8个,所占比例为8/16=1/2,C项错误。由荧光定量PCR技术原理“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,并且每扩增一次,就有一个荧光分子生成”推测,反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关,反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数,与样本DNA浓度呈负相关,D项正确。4.(2025·广东揭阳模拟)利用PCR获得目的基因后,用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析,正确的是(

)A.通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物1和引物4进行PCRC.若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高PCR复性的温度D.DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5'端连接脱氧核苷酸A解析

引物结合在模板链的3'端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3,A项正确。引物结合在模板链的3'端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2和引物4进行PCR,B项错误。若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低PCR复性的温度,以便引物与模板链结合,C项错误。DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸,D项错误。考点三实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定必备知识•精读教材1.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理酒精NaCl溶液2mol/L蓝色(2)实验步骤

研磨上清液95%一个方向2mol/L二苯胺5min蓝色2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础

相反大小和构象(2)PCR实验操作步骤和电泳鉴定

微量移液器离心管底部(3)DNA的测定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为

的紫外灯下被检测出来。

300nm易错排查(1)配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(2024·河北卷)(

)(2)利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果。(2024·河北卷)(

)(3)在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶。(

)(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(

)×√√×关键能力•练透考法命题角度一

DNA的粗提取与鉴定1.(2026·辽宁模拟)某小组以菜花为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定实验,同时进行DNA片段的扩增及电泳鉴定。下列叙述正确的是(

)

A.DNA可溶于95%的冷酒精或2mol/L的NaCl溶液B.可用二苯胺试剂在沸水浴的条件下鉴定DNAC.DNA的电泳速率与凝胶浓度无关D.同等长度的DNA,电泳时的迁移速率一定相同B解析

DNA能溶于2

mol/L的NaCl溶液,但在95%的冷酒精中会因溶解度降低而析出,A项错误。二苯胺试剂可在沸水浴条件下与DNA反应生成蓝色复合物,此方法常用于DNA鉴定,B项正确。DNA电泳时,凝胶浓度影响孔隙大小,浓度越高,大片段DNA迁移越慢,因此DNA的电泳速率与凝胶浓度有关,C项错误。相同长度的DNA若构象不同(如线状、环状或超螺旋),电泳时的迁移速率可能不同,D项错误。命题角度二

DNA片段的扩增及电泳鉴定2.(2024·黑吉辽卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(

)A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来A解析

琼脂糖凝胶的密度对其中DNA分子的迁移和分辨率有影响。根据所需分离的DNA片段大小,通常会选择适当浓度的琼脂糖凝胶。对于大型DNA片段(如基因组DNA或质粒DNA),一般选择低浓度琼脂糖凝胶,以便实现高效迁移所需较大孔径;对于小型DNA片段(如PCR产物或酶切片段),则需要选择高浓度琼脂糖凝胶以提供更好的分辨率和分离效果,A项正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是用于确定样品迁移的位置,B项错误。在琼脂糖凝胶电泳中,施加电场后,会使得DNA片段向正极方向迁移,同时,DNA片段的迁移速率与其长度呈负相关,即越长的DNA片段,迁移速率越慢,C项错误。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300

nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。高考真题•演练1.(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(

)

A.限制酶失活,更换新的限制酶B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶B解析

限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确。酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B项错误。质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C项正确。质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。2.(2025·江西卷)为了获得抗白叶枯病的水稻品种,研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图),通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织,最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(

)A.水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子B.在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达C.农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素D.愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株B解析

将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后,若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状,那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别,A项错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,并能够驱动基因转录出mRNA,最终表达出蛋白质。由题图可知,重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游,因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达,B项正确。当农杆菌侵染愈伤组织后,T-DNA整合到水稻细胞染色体的DNA上,