猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母高效表达及特异性单克隆抗体筛选与应用研究

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母高效表达及特异性单克隆抗体筛选与应用研究一、引言1.1研究背景与意义猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种对全球养猪业造成严重危害的急性传染病，其病原体为猪伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV），属于疱疹病毒科猪疱疹病毒属。PRV可感染包括猪、牛、羊在内的40多种家畜和野生动物，给养殖业带来了巨大的经济损失。在猪群中，该病可呈暴发性流行，能引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等症状。PRV病毒粒子呈球形，直径约为150纳米，主要由核心、衣壳和包膜三部分组成。其基因组为线性单股负链RNA，全长约15000个核苷酸，包含多个开放阅读框，分别编码病毒的不同蛋白质，这些蛋白在病毒的吸附、进入宿主细胞、复制、组装和释放等过程中发挥着关键作用。其中，gE蛋白作为PRV的主要囊膜糖蛋白之一，在病毒感染过程中扮演着重要角色。gE蛋白具有高度的免疫原性和良好的反应原性，其在病毒吸附和进入宿主细胞过程中起重要作用，能与细胞表面的特定受体结合，如N-乙酰神经氨酸酶受体，介导病毒的感染。同时，gE蛋白的缺失或变异常被作为区分自然感染与疫苗免疫猪的重要标记，因为目前广泛使用的伪狂犬疫苗多为gE基因缺失疫苗。通过检测猪体内是否存在针对gE蛋白的抗体，就可以准确判断猪只的感染状态，为疾病的防控提供科学依据。单克隆抗体（Monoclonalantibody,McAb）是由单一B淋巴细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。由于其具有高度特异性、均一性和可大量制备等优点，在疾病诊断、治疗以及科研等领域发挥着重要作用。在猪伪狂犬病的研究中，制备针对gE蛋白的单克隆抗体具有重要意义。一方面，它可以用于建立高灵敏度和特异性的检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光、胶体金免疫层析等，这些方法能够快速、准确地检测猪群中的PRV感染情况，有助于及时发现疫情，采取有效的防控措施，从而降低病毒传播风险，减少经济损失；另一方面，单克隆抗体还可用于深入研究gE蛋白的结构与功能，以及PRV的感染机制、致病过程和免疫逃逸机制等，为开发新型疫苗和抗病毒药物提供理论基础和技术支持。综上所述，本研究通过酵母表达系统表达猪伪狂犬病毒gE蛋白，并筛选其单克隆抗体，对于建立高效的猪伪狂犬病检测方法、深入了解病毒致病机制以及推动猪伪狂犬病的防控工作都具有重要的理论和实践意义。1.2国内外研究现状在猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达方面，国外起步较早，研究相对深入。一些科研团队利用巴斯德毕赤酵母表达系统，对gE蛋白进行了成功表达。通过优化表达条件，如调整培养基成分、培养温度以及诱导剂甲醇的添加量和添加时间等，有效提高了gE蛋白的表达水平和蛋白活性。他们还对表达出的gE蛋白进行了结构与功能的研究，发现酵母表达的gE蛋白在空间结构上与天然蛋白具有较高的相似性，能够较好地保持其免疫原性和生物学活性，为后续的诊断试剂和疫苗研发奠定了坚实基础。国内近年来也在该领域取得了显著进展。众多科研机构和高校纷纷开展相关研究，在酵母表达载体的构建、转化方法的优化以及表达产物的纯化等方面进行了大量探索。例如，通过对不同启动子和信号肽的筛选，构建了高效的酵母表达载体，提高了gE蛋白的分泌表达效率；在纯化工艺上，采用多种层析技术相结合的方法，获得了高纯度的gE蛋白，满足了后续实验和应用的需求。在猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备方面，国外的研究一直处于领先地位。早期便利用传统的杂交瘤技术，成功制备出针对gE蛋白的单克隆抗体，并将其应用于ELISA、免疫荧光等检测方法中，实现了对猪伪狂犬病毒感染的快速、准确诊断。随着技术的不断发展，又引入了噬菌体展示技术、基因工程抗体技术等新型技术手段，对单克隆抗体进行改造和优化，进一步提高了抗体的亲和力、特异性和稳定性，拓展了其在疾病治疗和病毒研究等领域的应用。国内在这方面的研究也紧跟国际步伐。科研人员不仅熟练掌握了传统杂交瘤技术，制备出多株具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体，还在新型技术的应用方面取得了突破。如利用噬菌体展示技术构建了大容量的噬菌体抗体库，从中筛选出了具有独特性能的单克隆抗体；通过基因工程技术对抗体基因进行修饰和改造，获得了人源化的单克隆抗体，降低了抗体的免疫原性，为其在临床治疗中的应用提供了可能。同时，国内还积极开展单克隆抗体在猪伪狂犬病诊断试剂盒研发、免疫病理机制研究等方面的应用研究，取得了一系列有价值的成果。1.3研究目标与内容本研究的目标是通过酵母表达系统高效表达猪伪狂犬病毒gE蛋白，并筛选出具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体，在此基础上建立一种灵敏、准确的猪伪狂犬病检测方法，为猪伪狂犬病的诊断和防控提供技术支持和理论依据。具体研究内容如下：猪伪狂犬病毒gE基因的克隆与酵母表达载体的构建：从猪伪狂犬病毒基因组中扩增gE基因，通过基因工程技术将其克隆到酵母表达载体上，构建重组表达质粒。对重组质粒进行测序验证，确保gE基因序列的准确性。gE蛋白在酵母中的表达与优化：将构建好的重组表达质粒转化到酵母细胞中，利用酵母表达系统表达gE蛋白。通过优化表达条件，如培养基成分、培养温度、诱导剂甲醇的浓度和诱导时间等，提高gE蛋白的表达水平和活性。采用SDS-PAGE、Westernblot等方法对表达产物进行鉴定和分析，确定最佳表达条件。gE蛋白的纯化与鉴定：利用亲和层析、离子交换层析等方法对表达的gE蛋白进行纯化，获得高纯度的gE蛋白。通过蛋白质测序、质谱分析等技术对纯化后的gE蛋白进行鉴定，确定其氨基酸序列和分子质量，验证其为目标蛋白。同时，采用ELISA、免疫荧光等方法检测gE蛋白的免疫活性，为后续单克隆抗体制备提供优质抗原。gE蛋白单克隆抗体的制备与筛选：以纯化后的gE蛋白为抗原，免疫Balb/c小鼠，使其产生免疫应答。取免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞。通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化培养，利用间接ELISA方法筛选出能稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对筛选出的杂交瘤细胞株进行扩大培养，制备大量单克隆抗体。单克隆抗体的鉴定与特性分析：对制备的单克隆抗体进行全面鉴定，包括抗体的效价、亚类、亲和力、特异性等。采用ELISA、Westernblot、免疫荧光等方法检测单克隆抗体与gE蛋白的结合活性和特异性，确保其能够准确识别gE蛋白。通过竞争ELISA等方法分析单克隆抗体识别的抗原表位，为深入研究gE蛋白的结构与功能提供依据。基于单克隆抗体的猪伪狂犬病检测方法的建立：利用制备的单克隆抗体，建立一种快速、灵敏、特异的猪伪狂犬病检测方法，如双抗体夹心ELISA、胶体金免疫层析等。对建立的检测方法进行性能评估，包括灵敏度、特异性、重复性等指标的测定。通过检测临床样本，验证检测方法的准确性和可靠性，为猪伪狂犬病的诊断和疫情监测提供有效的技术手段。1.4研究方法与技术路线本研究综合运用多种实验技术与方法，从基因克隆、蛋白表达、抗体筛选到检测方法建立，逐步深入开展相关研究。具体研究方法如下：基因克隆技术：采用PCR技术从猪伪狂犬病毒基因组中扩增gE基因。根据GenBank中公布的gE基因序列，设计特异性引物，并在引物两端引入合适的限制性内切酶位点。提取猪伪狂犬病毒基因组DNA作为模板，进行PCR扩增反应。通过优化PCR反应条件，如退火温度、延伸时间等，确保扩增出特异性强、纯度高的gE基因片段。将扩增得到的gE基因片段与克隆载体进行连接，转化至感受态大肠杆菌细胞中，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，筛选出阳性克隆，并进行测序验证，确保gE基因序列的准确性。酵母转化技术：将构建好的酵母表达重组质粒通过电击转化法或化学转化法导入酵母细胞中。电击转化法是利用高压电脉冲在酵母细胞膜上形成瞬间小孔，使重组质粒能够进入细胞内；化学转化法则是利用化学试剂如LiAc（醋酸锂）等处理酵母细胞，改变细胞膜的通透性，促进重组质粒的摄入。转化后的酵母细胞在含有相应抗生素的培养基上进行筛选培养，获得阳性转化子。蛋白表达与优化：将阳性转化子接种到合适的培养基中进行摇瓶培养，通过控制培养条件，如温度、pH值、溶氧等，进行gE蛋白的诱导表达。在诱导表达过程中，添加甲醇作为诱导剂，诱导酵母细胞表达gE蛋白。通过调整甲醇的添加浓度和添加时间，优化表达条件，提高gE蛋白的表达水平。定期取发酵液样品，采用SDS-PAGE、Westernblot等方法对表达产物进行分析鉴定，检测gE蛋白的表达情况和表达量。蛋白纯化技术：利用亲和层析技术对表达的gE蛋白进行初步纯化。根据gE蛋白的特性，选择合适的亲和层析介质，如镍柱（针对带有His标签的gE蛋白）等。将发酵液离心收集上清，通过亲和层析柱，使gE蛋白与亲和介质特异性结合，然后用洗脱液洗脱，收集含有gE蛋白的洗脱峰。进一步采用离子交换层析、凝胶过滤层析等技术对初步纯化的gE蛋白进行精细纯化，去除杂质，提高蛋白纯度。通过蛋白质定量方法如BCA法（二喹啉甲酸法）等测定纯化后gE蛋白的浓度，采用SDS-PAGE、质谱分析等技术对纯化后的gE蛋白进行纯度和分子量鉴定。单克隆抗体制备与筛选技术：以纯化后的gE蛋白为抗原，与佐剂混合后免疫Balb/c小鼠。按照既定的免疫程序，多次免疫小鼠，使小鼠产生免疫应答。在最后一次免疫后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，采用聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合方法，促进两种细胞的融合。融合后的细胞在HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷）选择性培养基中进行培养，筛选出杂交瘤细胞。通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化培养，利用间接ELISA方法筛选出能稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对筛选出的杂交瘤细胞株进行扩大培养，制备大量单克隆抗体。单克隆抗体鉴定技术：采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，确定抗体的浓度和活性；使用SBAClonotypingTMSystem/HRP亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类；通过ELISA竞争抑制试验等方法分析单克隆抗体识别的抗原表位；利用Westernblot、免疫荧光等方法检测单克隆抗体与gE蛋白的结合活性和特异性，确保其能够准确识别gE蛋白。检测方法建立技术：利用制备的单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA检测方法。将捕获抗体包被在酶标板上，加入待检样品，使样品中的抗原与捕获抗体结合，然后加入酶标记的检测抗体，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”夹心结构。通过加入底物显色，利用酶标仪测定吸光值，根据标准曲线判断样品中是否含有猪伪狂犬病毒抗原以及抗原的含量。对建立的检测方法进行性能评估，包括灵敏度、特异性、重复性等指标的测定。通过检测临床样本，验证检测方法的准确性和可靠性。本研究的技术路线如图1-1所示：开始||--提取猪伪狂犬病毒基因组DNA||--设计引物，PCR扩增gE基因||--gE基因与克隆载体连接，转化大肠杆菌||--筛选阳性克隆，测序验证||--gE基因与酵母表达载体连接，构建重组表达质粒||--重组表达质粒转化酵母细胞||--筛选阳性转化子，摇瓶培养诱导表达gE蛋白||--SDS、Westernblot鉴定表达产物||--优化表达条件||--亲和层析、离子交换层析等方法纯化gE蛋白||--蛋白质测序、质谱分析鉴定纯化蛋白||--gE蛋白免疫Balb/c小鼠||--取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合||--HAT培养基筛选杂交瘤细胞||--有限稀释法克隆化培养，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株||--扩大培养阳性杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体||--间接ELISA测定抗体效价，亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚类||--ELISA竞争抑制试验分析抗原表位，Westernblot、免疫荧光检测抗体特异性||--利用单克隆抗体制备双抗体夹心ELISA检测方法||--检测方法性能评估，检测临床样本验证准确性和可靠性|结束图1-1技术路线图二、猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达2.1材料与方法2.1.1实验材料菌株与载体：猪伪狂犬病毒毒株（购自中国兽医药品监察所），大肠杆菌Top10感受态细胞（购自天根生化科技有限公司），巴斯德毕赤酵母菌株X-33（购自Invitrogen公司），酵母表达载体pPICZαA（购自Invitrogen公司）。工具酶与试剂：限制性内切酶XhoI、EcoRI（购自TaKaRa公司），T4DNA连接酶（购自TaKaRa公司），PrimeSTARHSDNAPolymerase（购自TaKaRa公司），质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司），酵母转化试剂盒（购自Invitrogen公司），甲醇（分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司），酵母氮源基础培养基（YNB）、生物素、酵母提取物、蛋白胨（购自BD公司），His-BindResin亲和层析介质（购自Novagen公司），考马斯亮蓝染色液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司），PVDF膜（购自Millipore公司），HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），PRV阳性血清（实验室保存），PRV阴性血清（实验室保存）。仪器设备：PCR扩增仪（购自Bio-Rad公司），核酸电泳仪（购自北京六一仪器厂），凝胶成像系统（购自Bio-Rad公司），恒温培养箱（购自上海一恒科学仪器有限公司），恒温摇床（购自上海智城分析仪器制造有限公司），离心机（购自Eppendorf公司），超声破碎仪（购自宁波新芝生物科技股份有限公司），蛋白纯化仪（购自GEHealthcare公司），酶标仪（购自ThermoFisherScientific公司）。2.1.2实验方法gE基因克隆：根据GenBank中猪伪狂犬病毒gE基因序列（登录号：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，上游引物P1：5'-CCGCTCGAGATGGTGAAAGCCTTCTAC-3'（下划线部分为XhoI酶切位点），下游引物P2：5'-CCCAAGCTTCTAGTTGCTGGTGATGGT-3'（下划线部分为EcoRI酶切位点）。以提取的猪伪狂犬病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：PrimeSTARHSDNAPolymerase2.5U，10×PCRBuffer5μL，dNTPMixture（2.5mMeach）4μL，上游引物P1（10μM）2μL，下游引物P2（10μM）2μL，模板DNA1μL，ddH₂O补足至50μL。PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。重组质粒构建：将回收的gE基因片段和酵母表达载体pPICZαA分别用XhoI和EcoRI进行双酶切，酶切体系（20μL）：DNA1μg，10×Buffer2μL，XhoI1μL，EcoRI1μL，ddH₂O补足至20μL，37℃酶切3h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA胶回收试剂盒分别回收目的片段和载体片段。将回收的gE基因片段和载体片段按摩尔比3:1混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将转化后的细胞涂布于含有Zeocin（25μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送测序公司测序，测序正确的重组质粒命名为pPICZαA-gE。酵母转化：采用电转法将重组质粒pPICZαA-gE转化巴斯德毕赤酵母X-33。将巴斯德毕赤酵母X-33接种于5mLYPD液体培养基中，30℃、220r/min振荡培养过夜，当OD₆₀₀值达到1.0-1.5时，取1mL菌液转接至100mLYPD液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值达到1.3-1.5。将菌液于4℃、5000r/min离心5min，收集菌体，用预冷的无菌水洗涤菌体3次，再用1mL预冷的1M山梨醇重悬菌体，将菌体悬液转移至预冷的1.5mL离心管中，4℃、12000r/min离心1min，弃上清，用50μL预冷的1M山梨醇重悬菌体。取5-10μg线性化的重组质粒pPICZαA-gE加入到50μL酵母感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预冷的0.2cm电转杯中，冰浴5min。在1.5kV、25μF、200Ω的条件下进行电转，电转后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，将细胞悬液转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养1h。将转化后的细胞涂布于含有Zeocin（100μg/mL）的YPD平板上，30℃培养3-5天，直至长出单菌落。阳性克隆筛选：挑取YPD平板上的单菌落，接种于5mL含有Zeocin（100μg/mL）的BMGY液体培养基中，30℃、220r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到2.0-6.0。将菌液于4℃、5000r/min离心5min，收集菌体，用适量的BMMY液体培养基重悬菌体，使OD₆₀₀值为1.0，转移至新的摇瓶中，添加甲醇至终浓度为0.5%，30℃、220r/min诱导表达。每隔24h添加甲醇至终浓度为0.5%，继续诱导表达。分别于诱导表达0h、24h、48h、72h取1mL菌液，12000r/min离心1min，收集上清，用于SDS-PAGE和Westernblot分析。以未转化的巴斯德毕赤酵母X-33诱导表达上清作为阴性对照，筛选出表达量高且稳定的阳性克隆。诱导表达：将筛选出的阳性克隆接种于50mL含有Zeocin（100μg/mL）的BMGY液体培养基中，30℃、220r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到2.0-6.0。将菌液于4℃、5000r/min离心5min，收集菌体，用适量的BMMY液体培养基重悬菌体，使OD₆₀₀值为1.0，转移至500mL摇瓶中，添加甲醇至终浓度为0.5%，30℃、220r/min诱导表达。每隔24h添加甲醇至终浓度为0.5%，并于诱导表达0h、24h、48h、72h、96h分别取1mL菌液，12000r/min离心1min，收集上清，用于SDS-PAGE和Westernblot分析，确定最佳诱导表达时间。蛋白纯化：将诱导表达后的菌液于4℃、8000r/min离心30min，收集上清。将上清通过0.45μm滤膜过滤后，上样到预先用BindingBuffer平衡好的His-BindResin亲和层析柱上，流速为1mL/min。用10倍柱体积的BindingBuffer洗脱杂蛋白，再用含有不同浓度咪唑（50mM、100mM、200mM、500mM）的ElutionBuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。将收集的洗脱峰进行SDS-PAGE分析，确定含有目的蛋白的洗脱峰，将其合并后用超滤管浓缩，浓缩后的蛋白用PBS缓冲液透析过夜，去除咪唑等杂质，得到纯化的gE蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。2.2实验结果2.2.1重组质粒构建结果以提取的猪伪狂犬病毒基因组DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-1所示。在约1500bp处出现一条特异性条带，与预期的gE基因大小相符，表明成功扩增出gE基因片段。将扩增得到的gE基因片段和酵母表达载体pPICZαA分别进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，成功回收目的片段和载体片段。将两者连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，结果显示在约1500bp处出现特异性条带（图2-2），表明重组质粒构建成功。将阳性克隆送测序公司测序，测序结果与GenBank中公布的gE基因序列进行比对，同源性达到99%以上，进一步验证了重组质粒pPICZαA-gE构建的准确性。123M|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||###2.3结果分析与讨论在gE基因克隆与重组质粒构建过程中，成功扩增出预期大小的gE基因片段，并通过双酶切、连接及转化等步骤，构建了重组质粒pPICZαA-gE。测序结果表明，gE基因序列准确无误，这为后续的酵母表达奠定了坚实基础。在酵母表达过程中，通过电转法将重组质粒成功转入巴斯德毕赤酵母X-33中，经筛选获得了阳性克隆。诱导表达结果显示，gE蛋白在酵母中得到了成功表达，SDS-PAGE和Westernblot分析表明，表达产物的大小与预期相符，且能与PRV阳性血清发生特异性反应，这表明表达的gE蛋白具有良好的免疫活性。影响gE蛋白在酵母中表达的因素众多。首先，培养基成分对蛋白表达有显著影响。BMGY培养基作为酵母的生长培养基，其丰富的营养成分，如酵母提取物、蛋白胨、酵母氮源基础培养基（YNB）等，为酵母细胞的生长提供了必要的碳源、氮源和微量元素，促进了酵母细胞的增殖，从而为gE蛋白的表达提供了充足的细胞数量基础。而BMMY培养基作为诱导表达培养基，在BMGY的基础上，通过添加甲醇作为诱导剂，启动了gE基因的表达。甲醇不仅是酵母细胞的碳源，还能诱导酵母细胞中醇氧化酶基因（AOX1）的表达，而gE基因的表达受AOX1启动子的调控，从而实现了gE蛋白的诱导表达。培养温度也是影响gE蛋白表达的重要因素。巴斯德毕赤酵母的最适生长温度为30℃，在这个温度下，酵母细胞的代谢活动最为活跃，细胞生长速度快，有利于提高gE蛋白的表达量。若培养温度过高，可能会导致酵母细胞的蛋白质合成系统受到抑制，甚至引起蛋白质变性，从而降低gE蛋白的表达水平和活性；若温度过低，酵母细胞的代谢速率减慢，生长周期延长，同样不利于gE蛋白的高效表达。诱导剂甲醇的浓度和诱导时间对gE蛋白表达也至关重要。甲醇浓度过低，无法有效诱导gE基因的表达；而甲醇浓度过高，可能会对酵母细胞产生毒性，影响细胞的生长和代谢，进而降低gE蛋白的表达量。本研究中，通过优化甲醇浓度，确定了0.5%的甲醇浓度为最佳诱导浓度。在诱导时间方面，随着诱导时间的延长，gE蛋白的表达量逐渐增加，但当诱导时间超过一定限度时，由于酵母细胞的衰老、营养物质的消耗以及代谢废物的积累等因素，gE蛋白的表达量不再增加，甚至可能出现下降趋势。本研究结果显示，诱导表达72h时，gE蛋白的表达量达到峰值，之后表达量略有下降。为进一步提高gE蛋白的表达水平，可从以下几个方面进行优化。在培养基优化方面，可以尝试调整培养基中各种成分的比例，如碳氮比等，以满足酵母细胞生长和gE蛋白表达的最佳需求。同时，还可以添加一些促进蛋白表达的添加剂，如甘氨酸、脯氨酸等，这些添加剂可以改善酵母细胞的生理状态，提高蛋白表达水平。在培养条件优化方面，可以采用分批补料培养或连续培养等方式，及时补充营养物质，维持酵母细胞的生长活力，从而提高gE蛋白的表达量。此外，还可以通过优化诱导策略，如采用脉冲式诱导、分段诱导等方法，进一步提高gE蛋白的表达效率。在蛋白纯化过程中，利用His-BindResin亲和层析介质成功对gE蛋白进行了纯化。通过SDS-PAGE分析可知，经过亲和层析纯化后，gE蛋白的纯度得到了显著提高，杂蛋白明显减少。进一步用BCA法测定蛋白浓度，结果表明获得了较高浓度的纯化gE蛋白，满足了后续单克隆抗体制备等实验的需求。##三、猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的筛选###3.1材料与方法####3.1.1实验材料-**免疫动物**：6-8周龄雌性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房，自由采食和饮水，环境温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-60%。-**细胞株**：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养于含10%胎牛血清（FBS，购自Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（购自Solarbio公司）的RPMI1640培养基（购自Gibco公司）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。-**试剂**：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司），聚乙二醇（PEG，分子量4000，购自Sigma公司），次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）、次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷（HT）（购自Sigma公司），HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），SBAClonotypingTMSystem/HRP亚类鉴定试剂盒（购自SouthernBiotech公司），ProteinA亲和层析介质（购自GEHealthcare公司），BCA蛋白定量试剂盒（购自碧云天生物技术有限公司），PRV阳性血清（实验室保存），PRV阴性血清（实验室保存），猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清（购自中国兽医药品监察所），其他常规试剂均为国产分析纯。-**仪器**：CO₂细胞培养箱（购自ThermoFisherScientific公司），超净工作台（购自苏州净化设备有限公司），倒置显微镜（购自Olympus公司），酶标仪（购自ThermoFisherScientific公司），离心机（购自Eppendorf公司），细胞融合仪（购自BTX公司），96孔细胞培养板、24孔细胞培养板（购自Corning公司）。####3.1.2实验方法-**动物免疫**：将纯化后的gE蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，采用背部多点皮下注射的方式免疫Balb/c小鼠，每只小鼠注射100μg蛋白。首次免疫后，每隔2周用gE蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化后进行加强免疫，共免疫3次。在最后一次免疫后3-5天，眼眶采血，分离血清，用间接ELISA方法检测血清抗体效价，选择抗体效价高的小鼠用于细胞融合。-**细胞融合**：取免疫后抗体效价高的Balb/c小鼠，脱颈椎处死，无菌取出脾脏，制备脾细胞悬液。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞按1:5-1:10的比例混合于50mL离心管中，1200r/min离心10min，弃上清。轻轻弹匀沉淀，逐滴加入预热至37℃的50%PEG溶液1mL，边加边轻轻搅拌，作用1-2min后，缓慢加入10mL预热至37℃的无血清RPMI1640培养基，终止PEG作用，1200r/min离心10min，弃上清。用含20%FBS、HAT的RPMI1640培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。-**杂交瘤细胞筛选**：细胞融合后第7-10天，用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞。将gE蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜。弃包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育1h。弃封闭液，用PBST洗涤3次，每次3min。加入杂交瘤细胞培养上清，每孔100μL，37℃孵育1h。弃上清，用PBST洗涤3次，每次3min。加入HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h。弃上清，用PBST洗涤3次，每次3min。加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光显色10-15min。加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μL，用酶标仪测定450nm处的吸光值（OD₄₅₀）。以OD₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的杂交瘤细胞孔为阳性孔。对阳性孔进行有限稀释法克隆化培养，直至获得能稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。-**单克隆抗体鉴定**：-**抗体效价测定**：采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价。将gE蛋白包被酶标板，将单克隆抗体腹水或细胞培养上清进行倍比稀释，按上述间接ELISA方法进行检测，以能使OD₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的最高稀释倍数作为抗体效价。-**抗体亚类鉴定**：按照SBAClonotypingTMSystem/HRP亚类鉴定试剂盒说明书进行操作，鉴定单克隆抗体的亚类。-**亲和力测定**：采用ELISA竞争抑制试验测定单克隆抗体的亲和力。将gE蛋白包被酶标板，加入不同浓度的未标记抗原（gE蛋白）和固定浓度的单克隆抗体，37℃孵育1h后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，继续孵育1h，洗涤后加入TMB底物显色液显色，测定OD₄₅₀值。以未标记抗原浓度的对数为横坐标，OD₄₅₀值为纵坐标绘制竞争抑制曲线，计算半数抑制浓度（IC₅₀），IC₅₀值越小，表明抗体的亲和力越高。-**特异性鉴定**：采用Westernblot和间接免疫荧光试验（IFA）鉴定单克隆抗体的特异性。Westernblot：将纯化的gE蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1h后，加入单克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，洗涤后用ECL化学发光试剂显色，观察结果。IFA：将PRV感染的猪肾细胞（PK-15）接种于24孔板中，待细胞长成单层后，弃上清，用PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛固定15min，再用0.2%TritonX-100透化10min。用5%BSA封闭1h后，加入单克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤后加入FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，洗涤后用DAPI染核，在荧光显微镜下观察结果。同时，以PRV阴性血清和正常小鼠血清作为阴性对照，以PRV阳性血清作为阳性对照。###3.2实验结果####3.2.1动物免疫效果经过3次免疫后，小鼠血清抗体效价逐渐升高。末次免疫后3-5天采血检测，结果显示小鼠血清抗体效价最高可达1:12800，表明免疫效果良好，小鼠产生了较强的免疫应答，为后续的细胞融合提供了高质量的脾细胞来源。####3.2.2杂交瘤细胞筛选细胞融合后，在HAT培养基中培养，7-10天后用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞。结果显示，共筛选出15个阳性杂交瘤细胞孔，这些阳性孔的OD₄₅₀值均大于阴性对照2.1倍。对阳性孔进行有限稀释法克隆化培养，经过3次克隆化培养后，最终获得了5株能稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D5、2B3、3C7、4F6、5H8。####3.2.3单克隆抗体鉴定结果-**抗体效价**：采用间接ELISA方法测定5株单克隆抗体的效价，结果见表3-1。其中，腹水抗体效价最高的为2B3，可达1:512000；细胞培养上清抗体效价最高的为3C7，可达1:3200。**表3-1单克隆抗体效价测定结果**|杂交瘤细胞株|腹水抗体效价|细胞培养上清抗体效价||||||1D5|1:256000|1:1600||2B3|1:512000|1:2400||3C7|1:128000|1:3200||4F6|1:128000|1:1600||5H8|1:256000|1:2000|-**抗体亚类**：利用SBAClonotypingTMSystem/HRP亚类鉴定试剂盒对5株单克隆抗体进行亚类鉴定，结果表明，1D5、2B3、3C7属于IgG1亚类，轻链均为κ型；4F6、5H8属于IgG2a亚类，轻链均为κ型。-**亲和力**：通过ELISA竞争抑制试验测定单克隆抗体的亲和力，计算出各株单克隆抗体的IC₅₀值，结果见表3-2。其中，2B3的IC₅₀值最小，为0.12μg/mL，表明其亲和力最高；5H8的IC₅₀值最大，为0.56μg/mL，亲和力相对较低。**表3-2单克隆抗体亲和力测定结果**|杂交瘤细胞株|IC₅₀（μg/mL）|||||1D5|0.25||2B3|0.12||3C7|0.28||4F6|0.35||5H8|0.56|-**特异性**：Westernblot结果显示，5株单克隆抗体均能与纯化的gE蛋白在约60kDa处出现特异性条带，而与PRV阴性血清和正常小鼠血清无特异性条带出现，表明5株单克隆抗体均能特异性识别gE蛋白。间接免疫荧光试验（IFA）结果表明，5株单克隆抗体均能与PRV感染的PK-15细胞产生特异性荧光，而与未感染PRV的PK-15细胞无荧光产生，且以PRV阳性血清作为阳性对照时，可观察到明显的特异性荧光，以PRV阴性血清和正常小鼠血清作为阴性对照时，均无荧光出现，进一步验证了5株单克隆抗体对gE蛋白的特异性。###3.3结果分析与讨论在动物免疫过程中，多次免疫策略使得小鼠能够产生高滴度的抗体。首次免疫时，抗原与弗氏完全佐剂混合，弗氏完全佐剂中的卡介苗等成分能够强烈刺激机体的免疫系统，激活抗原呈递细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，这些细胞摄取抗原后，将其加工处理并呈递给T淋巴细胞和B淋巴细胞，启动初次免疫应答。随着加强免疫次数的增加，小鼠体内的记忆B细胞不断增殖分化，产生更多的浆细胞，从而分泌大量的特异性抗体，使得血清抗体效价逐渐升高。细胞融合是单克隆抗体制备的关键步骤之一。在融合过程中，PEG作为细胞融合剂，通过改变细胞膜的理化性质，促使脾细胞和骨髓瘤细胞紧密接触并融合。合适的细胞比例对于融合效率至关重要，本研究中采用的脾细胞与骨髓瘤细胞1:5-1:10的比例，能够在保证一定融合率的同时，减少未融合细胞和多核细胞的产生，提高杂交瘤细胞的质量。经过HAT培养基筛选，只有融合成功的杂交瘤细胞能够存活并增殖，因为骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），在HAT培养基中不能利用次黄嘌呤进行DNA合成，而脾细胞在体外培养条件下存活时间较短，只有杂交瘤细胞可以利用脾细胞提供的HGPRT，在HAT培养基中正常生长，从而实现了对杂交瘤细胞的筛选。通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，能够快速、灵敏地检测出分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。该方法基于抗原-抗体特异性结合的原理，将gE蛋白包被在酶标板上，当加入杂交瘤细胞培养上清后，若上清中含有抗gE蛋白的单克隆抗体，抗体就会与包被的gE蛋白结合，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，形成“gE蛋白-单克隆抗体-HRP标记的羊抗鼠IgG”复合物，通过底物显色，利用酶标仪测定吸光值，从而判断杂交瘤细胞是否分泌特异性抗体。经过多次克隆化培养，获得的5株能稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为后续单克隆抗体的大量制备和应用奠定了基础。单克隆抗体的鉴定结果具有重要意义。抗体效价反映了抗体的浓度和活性，