简明生物化学原理 课件 第5章 酶化学-3 酶作用机制和活性调节

第5章酶化学-3

酶的作用机制简明生物化学原理主要内容酶的活性部位及其确定方法酶促反应机制酶活性的别构调节酶活性的共价调节同工酶一、酶的活性部位（一）基本概念：酶的活性中心(activecenter)是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是一级结构相隔很远，而三维结构比较靠近的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位：结合部位和催化部位。1．结合部位(Bindingsite)酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。2．催化部位(catalyticsite)酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。（二）酶活性部位的特点1、活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%。2、酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。

3、酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合(induced-fit)。4、酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙(crevice)内,裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。5、底物靠次级键较弱的力与酶结合。6、酶的活性部位具有柔性和可运动性。课后习题：如何确定酶的活性部位？P38511.2、酶促反应机制酶促反应中发生的最本质变化是什么？（一）基元催化的分子机制酶是最复杂的催化剂，它的催化作用包括若干基元催化。基元催化是由某些基团或小分子催化反应的，包括酸碱催化、共价催化、和金属离子催化等。这些小分子催化剂或催化基团不是亲电体就是亲核体，它们是电荷极化的结果。蛋白质的水解——酸碱催化与共价催化生物体内每时每刻都在发生着蛋白质的水解反应但是，生理pH下，没有催化剂时，肽键极难水解。（为什么？）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间具有共振作用，形成共振杂化体，阻止了水对羰基的亲核进攻。从化学的角度，如何帮助水实现对羰基的亲核进攻？1、酸碱催化（acid-basecatalysis）酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，以稳定过渡态，达到降低反应活化能的一种催化机制。酶分子中可作为酸碱催化的功能基团影响酸碱催化反应的因素包括酸碱强度及质子传递的速率。His咪唑基的解离常数约6.0，咪唑基解离下来的质子浓度与水中的[H+]相近，在中性条件下，一半以酸形式存在，一半以碱形式存在;同时，咪唑基接受质子和供出质子的速率十分迅速，半衰期小于10-10秒。所以，His是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。2、共价催化（Covalentcatalysis）共价催化包括亲核催化和亲电催化。但由于参与共价催化的主要是亲核基团，所以共价催化也称为亲核催化。胰凝乳蛋白酶的Asp102、His57、Ser195组成了催化三联体结构（thecatalytictriad）通过Asp102、His57、Ser195组成的质子传递链，使Ser195失去质子，生成强亲核基团-O-底物结合(step1),S195羟基对底物羰基碳发动亲核进攻。(step2).底物羰基氧附近的酰胺区域可以稳定氧负离子氧离子洞在His57帮助下，H2O对酯基的羰基碳发动亲核进攻。同样通过四面体中间体，生成羧基，离开活性中心。胰凝乳蛋白酶催化蛋白质的水解丝氨酸蛋白酶的催化机制共价催化是由亲核催化剂加速反应的，催化剂向反应物的亲电中心提供电子，形成共价配位键，并产生一个不稳定的共价中间物。中间物的反应性比原来的反应物更大，将受到第二底物，如H2O分子进攻，生成最终产物应用举例：有机磷杀虫剂3、金属离子催化１）需要金属的酶分类：

（1）金属酶－metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+

（2）金属-激活酶（metal-activatedenzyme):含松散结合的金属离子，如Na+K+Mg2+Ca2+2）金属离子的催化作用：通过结合底物为反应定向。通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。通过静电稳定或屏蔽静电荷。金属离子对于某些酶分子的结构十分重要金属离子催化的例证：烯醇化酶（二）酶具有高催化能力的原因1、底物和酶的邻近效应与定向效应邻近效应:在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应。定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。使底物靠拢使底物分子产生应力使底物分子电荷变化咪唑催化对-硝基苯酚乙酸酯的水解反应实验结果表明，分子内咪唑基参与的水解反应速度比相应的分子间反应速度大24倍。说明咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。轨道定向(orbital-steering)假说示意图Rateenhancementbyentropyreduction.Shownherearereactionsofanesterwithacarboxylategrouptoformananhydride.TheRgroupisthesameineachcase.2、诱导契合（inducedfit）和底物的形变（distortion）酶-底物复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。诱导契合模型与底物的形变第4个糖残基D环因空间原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式构象。因此糖苷键的稳定性降低，键容易从此断裂。酶需要在正确的时间和正确的地点有活性四、酶活性的调节机制P211不合适的表达或激活导致细胞的癌变或死亡！如何控制特定的生化反应?控制已有的酶的活性控制酶浓度控制酶的位置（一）酶活性的别构调节生物体内酶催化反应的调节可以通过改变酶结构而使其催化活性发生改变，也可以通过改变酶含量来改变其催化速率，还可以通过以不同形式的酶在不同组织中的分布差异来调节代谢活动。酶结构的调节是通过对现有酶分子结构的影响来改变酶的催化活性。这是一种快速调节方式。分为别构调控和共价调控两种机制。（一）酶活性的别构调节别构调控别构调节:很多寡聚酶，当它们的亚基上的配体结合部位与配体非共价可逆结合时，将发生构象变化并影响同一酶分子上的其它亚基上的空活性部位的亲和力，这一现象称为酶的别构调节（allostericregulation）。酶的别构效应包括涉及酶与底物结合时催化部位和催化部位之间的相互作用即同促效应，和涉及酶与调节物结合时调节部位与活性部位之间的相互作用即异促效应。别构酶:具有这种调节作用的酶称为别构酶(allosericenzyme)。酶活性的别构调节凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)或别构剂。因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positiveeffector)或别构激活剂，反之称为负效应物(negativeeffector)或别构抑制剂。当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂）结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别构酶的协同效应。别构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键酶进行调节，常见的为负反馈调节。ABCDPE1E2E3En酶活性的反馈抑制别构调节最多出现在代谢途径中的反馈抑制，它是指一条代谢途径（通常是合成代谢途径）的终产物作为别构抑制剂抑制代谢途径前面限速酶的活性，因此也被称为终产物抑制。典型的别构酶－天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）ATCase的一个最有效的抑制剂是代谢途径的终产物胞嘧啶三磷酸（CTP），而ATP是酶的激活剂。在E.coli中ATCase催化由氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸。N-氨基甲酰磷酸与天冬氨酸的结合是协同的，协同结合使底物浓度只在一个很窄的范围内开启N-氨甲酰天冬氨酸的合成。底物分子本身对别构酶的调节作用称为同促效应。别构激活别构抑制V0[S]底物敏感区CTP在不影响酶的Vmax的情况下，通过降低酶与底物的亲和性来抑制ATCase；ATP可增强酶与底物的亲和性，也不影响Vmax。这种非底物分子的调节物对酶的调节作用，称为异促效应。别构激活别构抑制V0[S]底物敏感区别构酶的基本性质别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成。因别构酶有协同效应，故其[S]对v的动力学曲线不符合米氏方程。效应物可分为K型和V型两种类型。别构酶经加热或化学试剂处理，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏作用。多亚基调节亚基催化亚基协同效应别构激活剂别构抑制剂正协同负协同Back别构酶的动力学[S]对v的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。2米氏曲线1负协同3正协同321V0[S]V正协同效应：底物或调节物的结合大大增加了酶对后续底物分子的亲和性。（S型曲线）负协同效应：底物浓度较小的范围内，酶活力上升很快，随后底物浓度虽有较大提高，但反应速率升高很小，表现为负协同。（表观双曲线）饱和比值（Rs）可用来鉴别不同的协同作用以及协同的程度。典型的米氏类型的酶Rs=81

具有正协同效应的别构酶Rs<81，Rs正协同效应具有负协同效应的别构酶Rs>81，Rs负协同效应意义：在很小的浓度（底物、调节物）范围内严格控制酶活力，因此是生物代谢中许多代谢途径的关键酶。别构激活别构抑制V0[S]底物敏感区2米氏曲线1负协同3正协同321V0[S]VBackK型效应物和V型效应物BackK型V型别构模型齐变模型（WMC）别构酶的所有亚基，或全部呈坚固紧密的，不利于结合底物的“T”状态，或者全部是松散的，有利于结合底物的"R"状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都是同时的，齐步发生的。"T"状态中亚基的排列是对称的，变成"R"状态后亚基的排列仍然是对称的。序变模型（KNF）酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构象状态。

Back（二）酶活性的共价调节共价调节即利用蛋白质共价结构的变化调节酶的活性，包括不可逆共价变化（酶原激活）和可逆共价变化（如磷酸化）两种形式。（一）不可逆共价调节——酶原的激活处于无活性状态的酶的前体物质就称为酶原。酶原在一定条件下转化为有活性的酶的过程称为酶原的激活。酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改变。酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子空间结构的改变，使催化活性中心得以形成，故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。举例：消化系统蛋白酶原的激活，凝血机制。胰蛋白酶原的激活过程甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS活性中心肠激酶/胰蛋白酶酶原激活的机制为：酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子空间结构的改变，使催化活性中心得以形成，故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。酶原激活的生理意义在于：保护自身组织细胞不被酶水解消化。凝血机制某些凝血因子的水解激活（二）可逆共价调控酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生可逆共价修饰，从而导致酶活性的改变，称为可逆共价修饰调节。共价调节酶的两个主要特点：

1、通过可逆的共价修饰调节酶活性；

2、导致级联式放大反应。酶可逆共价修饰的几种形式共价修饰的主要方式是磷酸化和脱磷酸化。蛋白质蛋白质－npi蛋白激酶蛋白磷酸酶酶蛋白的磷酸化修饰与去修饰-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶

ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr酶蛋白-O-PO32-几种蛋白酶的水解激活共价修饰调节的常见方式：共价修饰调节一般与激素的调节相联系，其调节方式为级联反应(cascadereaction)。腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（有活性）

ATPcAMP↑

激素（胰高血糖素、肾上腺素等）+受体

PKA(无活性)

PKA(有活性)

糖原合酶

糖原合酶-P磷酸化酶b激酶

磷酸化酶b激酶-P

共价修饰酶的级联反应3．共价修饰调节的特点：⑴酶以两种不同修饰和不同活性的形式存在；⑵有共价键的变化；⑶受其他调节因素（如激素）的影响；⑷一般为耗能过程；⑸存在放大效应。

五、寡聚酶、同工酶及诱导酶（一）寡聚酶酶蛋白由二个以上的亚基组成，有四级结构。大部分别构酶是寡聚酶。（二）同工酶催化同一种化学反应，