SAIA 001柴胡种子DNA分子鉴定规程

ICS65.020.20

CCSB21

团体标准

T/SAIA001-2021

柴胡种子DNA分子鉴定规程

DNAMolecularIdentificationRulesofBupleurumSeed

（征求意见稿）

2021-xx-xx发布2021-xx-xx实施

山东省农业产业化促进会发布

T/SAIA001-2021

前言

本标准按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本部分由山东农业科学院生物技术研究中心提出。

本标准由山东省农业产业化促进会归口。

本部分起草单位：山东中医药大学、山东省农业科学院生物技术研究中心、恒德本草（中国）有

限公司、山东冰斛农林科技有限公司、山东百味堂中药饮片有限公司。

本部分主要起草人为：张全芳、高德民、步迅、崔彦伟、姜秀梅、陈雪燕、胡悦、曹海禄、范娅、

杜衎、刘丽、孙燕、刘国霞、刘艳艳、谭晴晴、范阳阳、葛存付、赵霞。

本部分附录A、B为规范性附录。

本标准为首次发布。

II

T/SAIA001-2021

柴胡种子DNA分子鉴定规程

1范围

本文件规定了柴胡种子DNA分子鉴定的实时荧光PCR技术原理方法和操作规程。

本文件适用鉴定中药材南、北柴胡种子的真实性。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRReal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

3.2

Ct值Cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

基于实时荧光PCR技术，建立多重实时荧光PCR检测体系，采用DNA条形码中的ITS基因序列

为靶基因，设计柴胡的通用引物与探针以及南柴胡和北柴胡的特异性引物和探针，通过对荧光聚合酶链

式反应反应体系和反应条件的优化筛选，建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法，在同一聚合酶链式

反应反应体系中可以同时鉴别南、北柴胡种子的源性成分。

5仪器设备及试剂

1

T/SAIA001-2021

5.1仪器设备

仪器设备见附录表A.1。

5.2试剂

5.2.1试剂见附录B.1。

5.2.2试剂的配制方法见附录B.2。

5.2.3除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

6检测引物和探针

引物序列和探针，见表1

表1引物和探针序列

扩增片段

引物探针名称序列(5'-3')特征

(bp)

BSFCAGAATCCCGTGAACCATCG

135南柴胡通用引物

BSRTAAACCAGCCGCACGACG

BSPJOE-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAG-BHQ2'南柴胡特异探针

BCFCGTCGTGCGGCTGGTTTA

113北柴胡通用引物

BCRTTGCTCACAGAGTAAACGGGCT

BCPFAM-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAAC-BHQ1北柴胡特异探针

BUFAAACGACTCTCGGCAACG

145柴胡属通用引物

BURCGTGCCCTCAGCCTAATG

BUPROX-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTG-BHQ2柴胡属特异探针

7DNA提取

每份材料混合取0.3g（大约200粒），用灭菌后的研钵在液氮状态下研磨成粉末。将含有2%β-

巯基乙醇的CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热；将研磨好的样品取0.15g置于2.0mL的离心管

中；加入700µL65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃保温30min，期间摇动3-4次；加入700µL氯仿

/异戊醇（24:1），轻轻颠倒使其充分混匀，12000r/min离心10min，吸取上清液转移至另一个离心管

中；将上清液转移到新的离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，将其充分混匀，置于-20℃30

min或过夜，12000r/min离心15min，收集沉淀；加入700µL70%无水乙醇漂洗，12000r/min离心2min，

弃掉上清液，此步骤重复一遍；室温下或超净工作台中自然风干DNA（不可太干）5-10min；加入50µL

2

T/SAIA001-2021

的双蒸水或TE缓冲液，涡旋振荡充分混匀，12000r/min离心2min，4℃保存备用或置于-20℃保存。

也可用相关植物提取试剂盒进行柴胡种子DNA的提取。

8核酸浓度及纯度测定

用Nanodrop紫外分光光度计对提取的DNA进行核酸浓度与纯度检测，OD260 nm和OD280 nm处测定

其吸光值，OD260/280比值在1.7～1.9，说明提取种子DNA纯度为佳。DNA浓度控制在0.1～50 ng/µL

之间，可作相应稀释以调整其浓度。

注：用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.5，如低于1.5则重新进行DNA的提取。

9实时荧光PCR扩增

9.1反应体系

按照表2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入基因组DNA

模板，8000r/min离心1min，取出PCR管放入荧光定量PCR仪中。每个PCR反应设置3个平行。

表2实时荧光PCR反应体系

组分名称加量（μL）终浓度

TaqManMasterMix101×

BCF/R(10 µmol/L)10.50 µmol/L

BSF/R(10 µmol/L)10.50 µmol/L

BUF/R(10 µmol/L)10.50 µmol/L

BCP（FAM）（0.4 µmol/L）10.02 µmol/L

BSP（JOE）（5 µmol/L）10.25 µmol/L

BUP（ROX）（1 µmol/L）10.05 µmol/L

基因组DNA模板(0.1 ng/µL～20.0 ng/µL)20.2 ng～40.0 ng

双蒸水补至20 μL

9.2实时荧光PCR反应程序

95℃1min；45个循环，95℃5s，60℃35s，在此收集荧光信号，以上参数可根据不同型号

实时荧光PCR仪作调整。

10结果分析与判定

3

T/SAIA001-2021

10.1PCR的有效性判定

在试样PCR反应的同时，设置如下阴性对照、空白对照和阳性对照。

——阴性对照：以三岛柴胡作为阴性对照。PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOX，相应Ct值>

40.0，有通用探针ROX的荧光信号，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。

——空白对照：以水作为阴性对照。PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOX、ROX，说明PCR体

系有效性。

——阳性对照：以南柴胡/北柴胡DNA（50ng/µL）作为阳性对照。PCR体系对应的反应孔中均有

FAM、ROX、JOX，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。

注：每个PCR反应设置3次平行。

10.2DNA提取有效性判定

在同时进行的空白对照、阴性对照和阳性对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有相应荧光信

号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，满足Ct值≤35。

10.3样品检测结果分析和判定

在符合10.2的情况下，使用PCR反应体系对南、北柴胡种子源性成分鉴定：

——当羧基荧光素FAM和罗丹染料ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明

检出北柴胡种子源性成分；当JOE、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明检出南

柴胡种子源性成分。

——当只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为伪品柴胡种子；

如Ct值>40.0，则判定为未检出相应的源性成分；

——如35.0<Ct值≤40.0，则需要重复实验，再次扩增后的Ct值仍<40，且阴性对照和阳性对

照结果正常，则判定该样品检出南柴胡或北柴胡种子源性成分；再次扩增后Ct值≥40，且阴性对照和

阳性对照结果正常，则判定该样品未检出南柴胡或北柴胡种子源性成分。

11检测过程中防止交叉污染的措施

按照GB/T27403-2008规定执行。

4

T/SAIA001-2021

附录A

（规范性附录）

仪器设备

仪器设备，见表A.1。

表A.1仪器设备

序号名称规格要求备注

1实时荧光PCR仪4通道以上（应能检测JOE、FAM和ROX荧光）

2紫外分光光度计波长190 nm~900 nm

3电子天平感量0.1 g

4台式离心机最高转速12000 r/min

5高压灭菌锅

6pH计

7磁力搅拌器

5

T/SAIA001-2021

附表B

（规范性附录）

试剂及试剂的配置

试剂见表B.1。

试剂的配置见表B.2。

表B.1试剂

序号试剂名称备注

1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）

2氯仿/异戊醇（24:1）

3乙二胺四乙酸二钠（EDTA）

β-巯基乙醇

4B.42%

5氢氧化钠（NaOH）

6浓盐酸

7氯化钠（NaCl）

8Tris碱

9异丙醇

10无水乙醇

表B.2试剂的配置

序号试剂名称配置方法备注

170%乙醇溶液取70ml无水乙醇，加水定容至100ml。

称取12.11gTris碱，溶于800mL的双蒸水中，用浓盐酸溶液调PH至

1mol/LTris-HCl溶液

28.0（约需4.2ml浓盐酸），加水定容至100mL，在103.4kPa、121℃条

（pH8.0）

件下，灭菌20min后使用。

称取40g氢氧化钠（NaOH）溶于80mL的双蒸水中，搅拌，定容至

310mol/L氢氧化钠溶液

100mL，待用。

0.5mol/L乙二胺四乙酸称取二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O）18.61g加入80mL

4二钠盐（EDTA）溶液双蒸水，不断搅拌，加入7mL10mol/L氢氧化钠溶液，PH调至8.0，

（pH8.0）最后加入双蒸水定容到100mL，高温灭菌20min。

6

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表B.2（续）

称取氯化钠（NaCl）29.22g，将其溶于90mL的双蒸水中，加热

55mol/L氯化钠溶液使其溶解，冷却，然后用双蒸水定容至100mL，高温灭菌20min，

待用。

称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）10g，溶解于80mL

10%十六烷基三甲

6双蒸水，加热加速溶解，双蒸水定容至100mL，室温保

基溴化铵溶液

存。

取10%CTAB溶液30mL（4.2.7），1mol/LTris-HCl溶

液（PH8.0）10mL（4.2.3），0.5mol/LEDTA（PH8.0）

7CTAB提取缓冲液

4mL（4.2.5），5mol/L氯化钠溶液28mL（4.2.6），定

容至100mL，高温灭菌20min，β-巯基乙醇现配现用。

在80mL水中依次加入1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL、

8TE缓冲液0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2mL，加水定容至100mL，

高压灭菌。

7

T/SAIA001-2021

目次

前言................................................................................................................................................................II

1范围....................................................................................................................................................................1

2规范性引用文件................................................................................................................................................1

3术语和定义........................................................................................................................................................1

4原理....................................................................................................................................................................1

5仪器设备及试剂................................................................................................................................................1

5.1仪器设备................................................................................................................................................2

5.2试剂........................................................................................................................................................2

6检测引物和探针................................................................................................................................................2

7DNA提取.............................................................................................................................................................2

8核酸浓度及纯度测定........................................................................................................................................3

9实时荧光PCR扩增............................................................................................................................................3

9.1反应体系.................................................................................................................................................3

9.2实时荧光PCR反应程序........................................................................................................................3

10结果分析与判定..............................................................................................................................................3

10.1PCR的有效性判定...............................................................................................................................4

10.2DNA提取有效性判定...........................................................................................................................4

10.3样品检测结果分析和判定..................................................................................................................4

11检测过程中防止交叉污染的措施...................................................................................................................4

附录A（规范性附录）仪器设备.........................................................................................................................5

附表B（规范性附录）试剂及试剂的配置.........................................................................................................6

表B.1试剂...................................................................................................................................................6

表B.2试剂的配置.......................................................................................................................................6

I

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柴胡种子DNA分子鉴定规程

1范围

本文件规定了柴胡种子DNA分子鉴定的实时荧光PCR技术原理方法和操作规程。

本文件适用鉴定中药材南、北柴胡种子的真实性。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRReal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

3.2

Ct值Cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

基于实时荧光PCR技术，建立多重实时荧光PCR检测体系，采用DNA条形码中的ITS基因序列

为靶基因，设计柴胡的通用引物与探针以及南柴胡和北柴胡的特异性引物和探针，通过对荧光聚合酶链

式反应反应体系和反应条件的优化筛选，建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法，在同一聚合酶链式

反应反应体系中可以同时鉴别南、北柴胡种子的源性成分。

5仪器设备及试剂

1

T/SAIA001-2021

5.1仪器设备

仪器设备见附录表A.1。

5.2试剂

5.2.1试剂见附录B.1。

5.2.2试剂的配制方法见附录B.2。

5.2.3除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合