现代遗传学教程-从基因到表型的剖析（第4版）课件 第6章基因突变

第6章基因突变GeneMutation中山大学《遗传学》2025版授课老师：XXXXXX@基因突变的类型03诱变剂的检测05基因突变的防护与修复01202基因突变的分子基础04基因突变的检出06反向遗传学和基因的人工改造3学习要点概念掌握基因突变彷徨实验碱基替换抑制因子突变反向遗传学CRISPR/Cas9Ames测验直接修复切除修复重组修复理解规律

青霉素富集法的原理，定点突变技术的原理，CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理了解应用

1.诱变剂的检测有哪些常用的方法？2.基因突变的常规和分子遗传学检测方法有哪些？3.定点突变技术的应用。4.CRISPR/Cas9技术的应用。

基因突变的类型01SECONE45基因突变孟德尔遗传定律杂交，性状观察染色体畸变显微镜观察基因突变分子生物学检测6基本概念组成基因物质的DNA分子中核苷酸的改变。这种改变无法用显微镜直接观察，只能通过化学反应或遗传实验来证明。基因突变(genemutation)7各种类型的变异除了染色体畸变和基因突变，还有其他变异吗？表观遗传变异8基本概念组成基因物质的DNA分子中核苷酸的改变。这种改变无法用显微镜直接观察，只能通过化学反应或遗传实验来证明。基因突变(genemutation)指在基因的DNA序列不发生改变的情况下，在基因表达时发生的可遗传的变化，这种变化同样导致表型的改变。（第11章）表观遗传变异(epigeneticvariation)基因组中含有两类遗传信息，一类是传统意义上由DNA序列所提供的遗传信息，另一类是表观遗传信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。注意9突变是如何发生的？基因突变是进化的必需的遗传变异来源基因突变是随机发生的还是选择压力的结果？10Luria-Delbruck波动实验（彷徨实验）实验结果显示，A组的方差远小于B组，这表明抗噬菌体的突变株在接触噬菌体之前就已经存在，即突变是自发发生的，而不是由环境因素引起的。11基因突变的类型—碱基替换一个碱基对被另一碱基对代替，如GC对替换成AT对。碱基替换时，如果嘌呤被嘌呤代替，嘧啶被嘧啶代替，叫做转换(transition)；而嘌呤被嘧啶代替，嘧啶被嘌呤代替，则叫颠换(transversion)。碱基替换(base-pairsubstitutions)嘌呤嘧啶胞嘧啶C鸟嘌呤G腺嘌呤A胸腺嘧啶T转换转换颠换12基因突变的类型—碱基替换碱基替换的后果错义突变(missensemutation)：密码子的改变引起一个与原来完全不同的氨基酸的改变。无义突变(nonsensemutation)：当碱基替换使mRNA上的密码子成为终止密码子时，就出现无义突变。如无义突变出现在基因中间，翻译进行到无义密码子时，肽链停止伸长，因而无义突变通常产生较大的表型效应。同义突变(silentmutation)：也叫沉默突变。虽然由于突变密码子不同了，但它们仍然编码相同的氨基酸，这样蛋白质的结构并没有发生改变。中性突变(neutralmutation)：虽然由于突变产生了不同的氨基酸，但这个氨基酸与原来的氨基酸有类似的结构和性质，因而并没有改变蛋白质的性质和功能。另外，中性突变也可能是由于发生突变的氨基酸对蛋白质的功能并没有重要的作用，因而也就没有引起表型改变。13基因突变的类型—插入和缺失增加或减少一个或几个碱基，使得编码蛋白序列发生改变。插入或缺失突变(deletion/insertionmutation)插入或缺失的碱基非3的倍数：产生移码突变，蛋白质序列发生改变，产生的蛋白质将失去活性。插入或缺失的碱基为3的倍数：蛋白质中增加或缺失相应的氨基酸，有时导致蛋白质失去功能。插入或缺失的后果基因突变的分子基础02SECTWO1415自发突变（1）DNA复制错误引起的基因突变突变率：在单位时间内某种突变发生的概率，即每代每对核苷酸的突变概率或每代每个基因的突变概率。DNA聚合酶复制1010个核苷酸仅一个会发生错误，人类基因组的30亿个碱基对中，每分裂三次才会有一次错误发生，而且这些突变中仅有一小部分是可见的，因为它们大部分发生在非基因区或为沉默突变，因而自发突变的几率很低。但考虑到一个个体发育，如人体是由1016个细胞组成，那么累计起来的突变也就不少了。16碱基的互变异构引起的错误碱基配对碱基本身存在着交替的化学结构，称为互变异构体。当碱基以它罕见的形式出现时就可能和错误的碱基形成碱基对。这种碱基化学结构的改变过程称为互变异构移位。由于互变异构移位导致在DNA复制时可能产生碱基的错配，如A和C配对。17碱基的互变异构引起的错误碱基配对TTAT18DNA环出或跳格（slippage）在DNA复制中发生的另一种错误形式是DNA环出，这导致移码突变、小的缺失或增加小的重复单位等19碱基的错误跳格产生的碱基的插入和缺失20DNA环出引起碱基热点突变在DNA复制中环出所引起的E.coli

lacI基因中的4碱基CTGG热点突变DNA环出可导致STR（shorttandemrepearts，短串联重复）特征序列的产生。这种特征性序列也被称为微卫星标记（详见教材P379）。21人类中DNA跳格突变导致的疾病遗传性智力迟钝，男性发病率为1/1200-1/2500，女性发病率为1/1650-1/5000。这种病患者是由于X染色体上脆性位点随机重复的三核苷酸序列CGG的数目的增加引起的，推测是由于DNA跳格加工引起的。此外，患者除了重复单位不同外，X染色体上还存在缺失或点突变。脆性X染色体综合征(fragile-Xsyndrome)22（2）自发化学改变引起的基因突变自发突变的另一种类型是由于化学变化所引起的，其中两种最为常见的化学变化是碱基脱嘌呤（depurination）和脱氨基（deamination）作用。脱嘌呤由于碱基和脱氧核糖间的糖苷键受到破坏，从而引起一个鸟嘌呤或腺嘌呤从DNA分子上脱落下来。脱氨基在一个碱基上除掉氨基，通常是C和5mC脱氨基后分别变成U和T。胞嘧啶(C)和5-甲基胞嘧啶(5mC)脱氨基后分别变成尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)23自发化学改变引起的基因突变脱嘌呤的后果DNA复制时，在无嘌呤位点没有碱基特异互补，而是随机选择一个碱基插进去。脱氨基的后果U如果不被修复，在DNA的复制中它将和A配对，结果使原来的C:G对转变成一个T:A对，产生了碱基转换突变。24（3）转座子和插入序列引起的基因突变生物体内含有一类能从一个位点跳到另一个位点的可移动的DNA序列，称为转座子(transposon)或插入序列(insertionsequence)。它们插入基因序列中经常引起基因功能的失活。如果该基因编码一种重要的产物，那么就会引起一个突变表型的产生。25转座子和插入序列引起基因突变的机制插入前插入前插入后26诱发突变的分子基础常用的两类诱变剂是射线和化学物质。等离子体诱变：在高压交变电场作用下，空气介质形成等离子体。等离子体中含有氮正离子、原子态氧、OH自由基等活性成分，可使微生物的细胞壁（膜）受损，增加通透性。此类活性粒子进入细胞后，使DNA和蛋白质等生物大分子受损，同时激发细胞自身的修复机制。在此过程中，微生物将产生大量随机性突变。射线诱发的突变由于当波长减少时能量增大，因此紫外线比可见光的能量要高一些，离子射线比非离子射线的能量大，γ射线比X射线能量大。电离射线可诱导基因突变和染色体的断裂。应用于生产，提高经济效益27（1）紫外诱变-最常用的诱变手段紫外诱变的原理DNA中的嘌呤和嘧啶有很强的吸收光的能力，特别是对波长为254-260nm的UV。这种波长的UV能通过DNA光化学变化初步诱导基因突变，使DNA合成延伸衰减。UV诱变最明显的变异是引起DNA同一链上的两个嘧啶核苷酸共价连接，形成嘧啶二聚体，其中最常见的是T=T。28紫外诱变原理紫外线照射形成二聚体从而引起突变29（2）化学物质诱发的突变30碱基类似物诱发的突变当一种化合物的分子结构很像天然化合物时，在某个化学反应中就可能取代天然化合物。在DNA复制中，少数碱基类似物可以代替这种或那种天然碱基，引起配对错误，由一种碱基代替另一不同碱基对，从而引发基因突变。例如：5-溴脱氧尿苷(-bromodeoxyuridine,BrdU)跟胸腺嘧啶T结构很相似，它有两种异构体：一种是酮式，另一种是烯醇式，它们可分别与A及G配对。31碱基类似物诱发的突变32叠氮胸苷（AZT）AZT在病毒RNA-DNA的阶段是反转录酶的底物，但在细胞中它却不是DNA聚合酶的合适底物。是一种治疗艾滋病的药物。它是一种碱基类似物，能作为T的类似物掺入DNA中。因此是一种选择性药物，可以抑制病毒DNA的合成，从而阻断新的病毒的产生。33莫那比拉韦（Molnupiravir）它是一种核苷类似物，其作用机制是破坏新冠病毒的RNA复制，使其产生突变，从而抑制病毒繁殖。是美国默克公司开发的全球第一款用于治疗成人轻度至中度新冠感染的口服药物。（2021年11月4日上市）在III期临床试验中，该药可将轻、中症新冠患者住院/死亡风险降低约50%，对变异毒株也显示出一致的疗效。但它不是一种选择性药物，科学家们很担忧它对人体的DNA复制或RNA转录产生影响，导致机体正常细胞发生基因突变。34碱基修饰剂碱基的修饰剂改变DNA化学结构从而导致突变有的诱变剂并不是掺入到DNA中，而是通过直接地修饰碱基的化学结构，改变其性质而导致诱变，如亚硝酸、羟胺、烷化剂（芥子气、甲基甲黄酸和亚硝基胍等）等。35碱基修饰剂的作用三种碱基修饰剂的作用亚硝酸的氧化脱氨作用：C突变成U，与A配对A突变成I，与C配对羟胺使C上的氨基氮羟基化：与A配对烷化剂使碱基烷基化：烷基化的G、T分别与T、G配对36DNA插入剂主要包括吖啶类染料，如吖啶橙、原黄素、黄素等。它们大小与碱基对差不多，通过插入到DNA双螺旋双链或单链的两个相邻的碱基之间，起到插入诱变的作用。37DNA插入剂引起移码突变的机制插入剂引起移码突变若这类物质插在DNA模板上，新链合成时随机插入一个碱基在插入剂对应的位置上，从而引起移码突变；若这类物质插在新合成的ＤＮＡ链上取代了一个碱基，在下一轮复制前该插入剂又丢失了的话，那么这一轮复制将会减少一个碱基。从而引起移码突变。38诱导突变的化学物质碱基类似物碱基修饰剂DNA插入剂“猜猜我是谁？”“我是警察蜀黍！”“我也要提款！”诱变剂的检测03SECTHREE3940诱变剂的检测在我们的日常生活中，存在着大量的化学品，这些化学品中有许多具有诱变剂作用，可引起人类的癌症。因此建立灵敏、高效的诱变剂检测手段对人类是非常重要的。411.AmesTest（埃姆斯测验）California大学的B.Ames在20世纪70年代早期发展的一种方法，称为AmesTest(埃姆斯测验)。原理在组氨酸营养缺陷型(his-)的沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)培养物中加入诱变剂，观察统计从his-回复到his+的回复突变率，从而获得有关诱变剂的诱变强度信息。42Ames测验检测诱变剂的诱变强度信息因为动物摄取的食物通常由肝内的酶进行解毒和降解，然而通过这种解毒机制却也有时使无毒的化合物产生了有毒或致癌的化合物。加入肝脏解毒酶是为了模拟动物体内的代谢反应。模拟体内代谢反应432.彗星电泳技术原理：完整的染色体DNA分子量非常大，无法在琼脂糖凝胶中泳动DNA发生双链或单链断裂后，产生的DNA片段可以在琼脂糖凝聚中泳动，形成“彗星尾巴”443.利用诱导植物细胞组织变异的特性

染色体畸变法监测：植物根尖有丝分裂染色体畸变表型检测基因突变：基因突变引起植物表型改变紫露草微核监测：紫露草花粉母细胞减数分裂对诱变剂敏感，会产生染色体断片。当新细胞形成时，染色体断片就形成了大小不等的微核，分布在主核的周围。454.现在科研中常用的其他检测方法DNA损伤标志物检测：DNA损伤过程中可形成某些特定的损伤产物，如磷酸化H2AX、8-OHdG等，通过检测这些损伤产物来评估DNA损伤。DNA损伤信号通路的激活：DNA损伤后，会激活DNA损伤响应，产生信号传导和修复蛋白的募集，使得DNA修复通路被激活。通过检测这些修复通路的激活情况，可以评估DNA损伤的程度。基因突变的检出04SECFOUR4647基因突变的检出传统检出方法微生物突变检测：利用抗生素抗性和营养缺陷型筛选果蝇突变检测：Muller-5品系和果蝇平衡致死系统分子遗传学检出方法48营养缺陷型突变的检出：青霉素富集法青霉素富集法（PenicillinEnrichment）把含有突变型和野生型的细胞接种到含有青霉素的液体基本培养基中，青霉素能阻止细胞壁成分的合成，因而对扩增的细胞(野生型)是致死的。突变型由于代谢缺陷不能在基本培养基上扩增，因而对青霉素具有抗性。49青霉素富集法的原理通过青霉素富集筛选营养缺陷型影印基本培养基突变体不长残留的野生型生长含青霉素的基本培养基生长的野生型死亡突变体不增殖，存活补充营养物的培养基突变体生长残留的野生型生长涂布在补充不同营养物质的培养基上，获得相应的营养缺陷型。50果蝇突变的检测果蝇的Muller-5品系(用于X染色体突变的检测)平衡致死系统(用于2号染色体突变的检测)51Muller-5品系可检出果蝇X连锁隐性突变用Muller-5品系检出果蝇X连锁隐性致死突变或隐性可见突变51野生型：无突变突变型：隐性可见突变无该果蝇：隐性致死突变F1代自交观察F2代雄性性状诱变雄果蝇与Muller-5雌果蝇杂交52平衡致死系统平衡致死系(balancedlethalsystem)或永久杂种(permanenthybrid)，指一对同源染色体的两个成员分别带有一个座位不同的隐形致死基因，这两个致死基因始终处在个别染色体上，以杂合状态保存不发生分离。平衡致死系统利用倒位的交换抑制效应可以保存带有致死基因的品系。53平衡致死系统—例子Cy:翻翅，显性；纯合致死(Cy/Cy)

S:星状眼，显性，纯合致死(S/S)翻翅果蝇与待保留致死基因S果蝇杂交

Cy+×Cy++S+SCy+Cy++SCy++S+S

死亡保存死亡果蝇2号染色体Cy所在的区域发生倒位，重组受到抑制。54平衡致死系统可检测果蝇常染色体突变

用平衡致死系统检出果蝇2号染色体上的基因突变×P♂♀F1待检定的野生型平衡致死系×平衡致死系翻翅杂合体F2♂♀♂♀F3纯合致死翻翅杂合体翻翅杂合体54在F1中选取翻翅果蝇，与平衡致死系配对交配（传递待测2号染色体）F2中选取翻翅个体自交(目的是为了产生纯合的突变染色体)待检2号染色体上不带有致死基因和突变，则有33%的野生型带有隐性可见突变，则有33%表现为突变型带有隐性致死基因，则只有翻翅果蝇？×待检果蝇与平衡致死系杂交55果蝇突变的检测果蝇的Muller-5品系(用于X染色体突变的检测)；平衡致死系统(用于2号染色体突变的检测)。为什么使用这两个品系？检测过程中的交配不能产生重组，否则就无法断定突变的来源。Muller-5品系的X染色体存在一些倒位，使得Muller-5品系的X染色体与其它X染色体的交换受到抑制，从而不会发生重组。平衡致死系统中的Cy基因位于倒位段内，使重组受到抑制。56基因突变的分子遗传学检出方法PCR技术为基因突变检测带来了巨大的发展，大部突变分检测技术都基于PCR技术。基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测57基因突变的分子遗传学检出方法原理经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，然后于一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当DNA发生点突变时，会造成单链三级构象的改变，在凝胶上的电泳迁移率表现出差异，即多态性，由此来判断突变。特点

对DNA长度敏感，不超过300bp的DNA可达80%以上的检出率，大于400bp检出率只有50%。检测率无法达到100%，没有新条带并不说明分析对象无突变，需用其他方法进一步验证。

基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测58直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型/野生型DNA双链。该杂合双链在错配处形成突起，在凝胶电泳时产生不同于野生型的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。

基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测基因突变的分子遗传学检出方法59用于检测限制性酶切位点突变（突变前后酶切位点消失或者增加），使用受限。例如，K-ras

基因第12密码子的BstNI位点，第13密码子有BglⅡ位点发生突变。可用连续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras

第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测基因突变的分子遗传学检出方法60等位基因特异性扩增法（allele-specificPCR,ASPCR）,也称扩增阻碍突变系统（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）。用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。在两个PCR反应体系中，如果模板发生突变，则含有野生型引物的PCR被阻滞，含有突变型引物的PCR扩增。反之亦然。基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测基因突变的分子遗传学检出方法61等位基因特异性寡核苷酸分析法（ASO）

是以杂交为基础对已知突变的检测技术。针对突变位点设计一段20bp左右的寡核苷酸探针，包括野生型探针和突变型探针。将探针与固定在膜上的经PCR扩增的待测DNA杂交。检测哪一组探针具有杂交信号则可以判断是否发生突变。ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测基因突变的分子遗传学检出方法62将与野生型或突变型DNA互补配对的寡核苷酸探针按顺序固定在芯片阵列上，将荧光标记的待测DNA与芯片上的探针进行杂交，通过扫描荧光信号的位置判断待测DNA含有何种突变。基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测基因突变的分子遗传学检出方法63应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置。一代测序：Sanger测序法，双脱氧链终止法。准确，相对较慢。二代测序：高通量测序，边合成边测序，通过捕捉新添加碱基所携带的荧光信号来识别DNA序列。通量高，但是读长短。三代测序：单分子测序技术，相较于前两代技术，具有显著的长读长优势，这使得它在解析基因序列中的复杂重复区域和进行高质量基因组组装方面提供了新的技术手段。基于电泳的检测技术：单链构象异构多态性（SSCP）异源双链分析法(HA)基于PCR的检测技术：突变体富集PCR法等位基因特异性扩增法(ASPCR)基于杂交的检测技术：等位基因特异性寡核苷酸杂交DNA芯片技术基于测序的检测技术：大规模基因突变检测基因突变的分子遗传学检出方法基因突变的防护与修复05SECFIVE6465基因突变的防护123密码子的结构：密码子的简并性以及具有类似性质的氨基酸常有类似的密码子。抑制因子突变回复突变：突变有时是可逆的，从突变型回复到野生型或假野生型的表型叫回复突变(reversemutationorbackmutation)。在回复突变中有时并不是精确地回复到原来的序列，而是第二个突变掩盖了原来突变型的表型，这样的回复突变叫抑制因子突变（suppressormutation）。抑制因子突变可以部分或全部地恢复基因产物的活性，它可以是发生在正向突变的同一基因或同一顺反子内，也可以发生在正向突变的基因或顺反子外。66基因突变的防护45二倍体和多倍体高等生物的多倍体具有几套染色体组，每个基因都有几份，故能比二倍体和低等生物表现更强的保护作用。致死和选择一个突变可能是致死的。在这种情况下，含有此突变的细胞将被选择所淘汰。无义突变介导的mRNA降解无义突变或移码突变可形成提前终止密码子。细胞能识别并降解该mRNA，避免异常蛋白产生。667基因突变的修复除了防护机制，生物体还有一套修复机制来减少突变对机体的损伤。常见的修复机制分为三大类：68基因突变的修复：直接修复利用修复酶直接修复突变的碱基。如光解酶(photolyase)利用可见光提供的能量将突变的嘧啶二聚体切开成单体，使DNA回复正常。这个过程叫做光修复(lightrepair)或光复活作用(photoreactivation)。光修复主要是低等生物的一种修复形式。烷基转移酶、甲基转移酶将G上的烷基或者甲基去掉。69基因突变的修复：切除修复切除修复切除突变链，利用互补链合成新的DNA链。切除修复过程中不需要光的存在，因此这个系统也称为暗修复。(暗修复是在黑暗中进行的DNA的修复机制？)6970切除修复的四个步骤(1)切开，即由一种修复内切酶识别DNA的损伤部位，并在损伤碱基两侧位点切割。(4)在连接酶的作用下，将新合成的DNA片段和原来的链之间的缺口连接起来，从而完成修复过程。(2)由外切酶切去错误的DNA序列。(3)由DNA聚合酶以互补链为模板合成一条新的DNA链，此新链将取代原来含有损伤的DNA片段。基因突变的修复：切除修复71切除修复模式图E.Coli切除修复的关键酶E.Coli：DNA聚合酶I哺乳动物：DNA聚合酶β基因突变的修复：切除修复72切除修复酶的缺陷—着色性干皮病人群中患病率约1:65000～1:100000。患者体内缺乏修复机制，暴露部位皮肤出现色素沉着、干燥、角化、萎缩及癌变等，其皮肤和眼部肿瘤的发生率是正常人的1000倍。大部分患者在30岁前死于皮肤癌。73特异切除修复途径当单个嘌呤或嘧啶自发脱落后，这个无嘌呤或无嘧啶的位点就叫做AP位点。所有细胞都具有一种核酸内切酶能对AP位点进行修复。这种酶通过剪切AP位点上的磷酸二酯键，从而打断DNA链，启动了由外切酶、DNA聚合酶I和DNA连接酶作用的切除修复过程。AP核酸内切酶修复途径7374DNA糖基化酶(DNAglycosylase)修复途径DNA糖基化酶切开突变位点的N-糖苷键，释放出突变碱基，产生一个无嘌呤或无嘧啶的AP位点，然后该位点再由AP内切酶切割磷酸二酯键，及由DNA聚合酶和连接酶等作用系统修复。特异切除修复途径75基因突变的修复：重组修复有些DNA损伤需要完全新的DNA来修复遗传信息，对它们的修复可以通过修复后由分离DNA分子上的同源片段的连接来完成，这种修复机制叫重组修复(recombinationalrepair)。76重组修复的主要步骤321含嘧啶二聚体结构的DNA复制，越过嘧啶二聚体，子DNA链在损伤部位出现裂隙。复制后的DNA链重组。重组产生一没有损伤的野生型DNA分子和一带有两个损伤区域的分子。77突变修复的特点1.修复过程在生物体内是普遍存在的，是一种正常的生理过程。2.不是任何损伤都能修复，否则生物就不会发生突变了。反向遗传学和基因的人工改造06SECSIX7879反向遗传学离体定向诱发突变先对某个基因进行定向突变，然后用一定方法导入细胞或生物体，观察和分析其表型的变化，以探讨正常基因的功能，这样的遗传分析途径与经典遗传学的方法正好相反，即通过对某个基因进行突变来研究其功能(表型)的改变，这种方法也称为反向遗传学。传统遗传学是从表型的改变来研究基因突变的过程。80反向遗传学技术与反向遗传学相关的研究技术称为反向遗传学技术(reversegeneticmanipulation)。反向遗传学技术主要包括基因敲除、RNAi、基因过量表达、基因体外转录、基因定点突变、DNA重组表达技术和基因编辑（CRISPR/Cas9）等。81（1）定点突变无论是人工诱变还是自然突变都是随机的过程，带有一定的盲目性。利用分子克隆技术，在体外进行定点突变，定向地改造已知的DNA序列，特异地产生实验所设计的突变，这种方法叫体外定点突变。这项技术的建立者是加拿大的M.Smith,他于1993年获得诺贝尔化学奖。在进行科学研究的过程中，要善于进行反向思维。82基因定点突变试剂盒原理突变引物设计一对包含突变位点的引物(正、反向引物)，和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺口的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。83（2）基因编辑技术基因编辑（geneediting），是一种新兴的比较精确的能对生物体含有遗传信息的基因序列进行插入、删除、替换等修改的一种技术。84基因编辑技术—2020年诺贝尔化学奖2020年10月7日，瑞典皇家科学院将2020年诺贝尔化学奖授予法国的埃曼纽尔·卡彭蒂耶(EmmanuelleCharpentier)和美国的詹妮弗·杜德纳(JenniferA.Doudna)，以表彰她们“开发了一种基因组编辑的方法”。卡彭蒂耶和杜德纳开发了基因技术中最锐利的工具之一：CRISPR/Cas9—一种基因剪刀。利用这项技术，研究人员科研极其精确地改变动物、植物和微生物的DNA。这项技术对生命科学产生了革命性的影响，科研帮助研究者开发新的癌症疗法，并使治愈遗传疾病的梦想成为现实。85应用最广泛的基因编辑技术—CRISPR/Cas9CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵。该系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，该系统被开发成一种高效的基因编辑工具。86CRISPR/Cas9如何工作？CRISPR基因座：①前导序列：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游，被认为是CRISPR序列的启动子。②重复序列：长度约20–50bp碱基且包含5–7bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构，稳定RNA的整体二级结构。③间隔序列：是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于