苹果常见病虫害及其防治方法

摘要当今社会，人们对水果质量的要求越来越高。而农药残留是水果质量安全备受关注的话题。苹果是世界四大水果之一，苹果防治病虫害的重要措施便是施用化学农药。然而，大量施用化学农药会带来一定的卫生安全隐患，重则会引起人体慢性中毒。有研究表明，心脑血管病、早老性痴呆、帕金森病等疾病的发生率升高都与农药残留的食用有直接关系。本文就苹果中5种农药残留的性状、性质、危害、检测现状、以及检测方法进行阐述。关键词：液相色谱-质谱法；农药残留；苹果

ABSTRACTIntoday'ssociety,peoplehavehigherandhigherrequirementsonthequalityoffruit.Pesticideresidueisahottopicinfruitqualityandsafety.Appleisoneofthefourmajorfruitsintheworld.Theimportantmeasuretocontrolapplediseasesandinsectpestsistoapplychemicalpesticides.However,alargenumberofchemicalpesticideswillbringsomehealthandsafetyrisks,andevenleadtochronicpoisoning.Somestudieshaveshownthattheincreasedincidenceofcardiovascularandcerebrovasculardiseases,Alzheimer'sdisease,Parkinson'sdiseaseandotherdiseasesaredirectlyrelatedtotheconsumptionofpesticideresidues.Inthispaper,thecharacteristics,properties,hazards,detectionstatusanddetectionmethodsoffivepesticideresiduesinappleweredescribed.Keywords:Liquidchromatography-massspectrometry;pesticideresidues;apple.引言1.1苹果常见病虫害及其防治方法1.1.1苹果的习性苹果是蔷薇科苹果亚科苹果属植物，其果树为落叶乔木。苹果富含矿物质和维生素，营养价值很高。苹果喜光，喜微酸性到中性土壤。最适于土层深厚、富含有机质、心土为通气排水良好的沙质土壤种植。1.1.2苹果常见病虫害及其防治方法：（1）病害苹果种植过程中常见的病害主要有苹果斑点落叶病、苹果白粉病、苹果树腐烂病、苹果褐斑病、苹果轮纹病、苹果黑星病、苹果炭疽病等。主要危害果实和侵扰叶花。防治方法：加强田间管理，及时修剪病枝叶，再将地面的残枝落叶收集，集中烧毁或深埋。在发病条件来临（具备）前、在症状初显时，采用得力的方案尽最大可能杀灭病菌解除病患，起到早防无病、病轻，重治是速效、省钱、省工的效果。（2）虫害苹果在生长时的虫害较多，主要有红蜘蛛、二斑叶蟎、食心虫类、金纹细蛾、卷叶蛾类、苹果黄蚜、介壳虫类、苹果绵蚜等，它们主要危害叶片、嫩梢、花蕾、花瓣和幼果等幼嫩部位，啃食其肉质组织或吸食汁液。导致植株生长受阻、生长缓慢，树势衰弱，最后影响产量和品质。防治方法：它们主要是幼虫危害，所以可采取农业和化学相结合的防治方法，将田间的杂草杂物清理干净，结合浇水松土等方法，减少虫源，在虫害爆发期喷洒药剂防治。1.25种农药残留的化学性质及危害1.2.1吡虫啉吡虫啉，又称高巧、亮巧等，分子式：C9H10ClN5O2，分子量：255.661，化学名称：1-（6-氯吡啶-3-吡啶基甲基）-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺，结构式如图1-1所示：图1-1吡虫啉结构式吡虫啉，无色晶体，有微弱气味，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，并有触杀、胃毒和内吸等多重作用，是烟碱类超高效杀虫剂。其可以阻碍害虫的中枢神经正常传导，使其麻痹死亡。主要用于防治刺吸式口器害虫。1.2.2呋喃丹（克百威）呋喃丹一般指克百威，又称虫螨威，分子式：C12H15NO3，分子量：221.25，化学名称：2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基甲氨基甲酸酯，结构式如图1-2所示。图1-2呋喃丹（克百威）结构式呋喃丹（克百威），白色结晶，无臭，可溶于多种有机溶剂，难溶于二甲苯、石油醚、煤油。遇明火、高热可燃。受热分解放出氧化氮烟气。按中国农药毒性分级标准，呋喃丹（克百威）为高毒农药，不能用在蔬菜和果树上。2019年12月27日，呋喃丹（克百威）被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。1.2.3啶虫脒啶虫脒，又称莫比朗，分子式：C10H11ClN4，分子量：222.68，化学名称：N-(N-氰基-乙亚胺基)-N-甲基-2-氯吡啶-5-甲胺，结构式如图1-3所示：图1-3啶虫脒结构式啶虫脒外观为白色晶体，能溶于丙酮、甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃等，日光下稳定。是一种新型广谱且具有一定杀螨活性的杀虫剂，其作用方式为土壤和枝叶的系统杀虫剂。广泛用于水稻，尤其蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱、蓟马、部分鳞翅目害虫等的防治。1.2.4霜霉威霜霉威，分子式C9H20N2O2，分子量：188.3，化学名称：3-二甲氨基丙基氨基甲酸丙酯，结构式如图1-4所示：图1-4霜霉威结构式霜霉威，无色、无味，极易吸湿的结晶固体，易溶于水及部分溶剂，属氨基甲酸酯类，是一种具有局部内吸作用的低毒杀菌剂。可广泛适用于黄茄、辣椒、莴苣、马铃薯等蔬菜及烟草、草莓、草坪、花卉卵菌纲真茵病害，具有很好的防治效果。1.2.5多菌灵多菌灵，又称又名棉萎灵、苯并咪唑44号，分子式：C9H9N3O2，分子量：191.2，化学名称：N－（2－苯并咪唑基）－氨基甲酸甲酯，结构式如图1-4所示：图1-5多菌灵结构式多菌灵，无味，粉末状固体，不溶于水，可溶于无机酸及醋酸，并形成相应的盐，微溶于丙酮、氯仿和其他有机溶剂，学性质稳定。是一种广谱性杀菌剂，对多种作物因真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。可叶面喷雾、种子处理和土壤处理等。可以有效防治由真菌引起的多种作物病害。但其残留能引起肝病和染色体畸变，对哺乳动物有极大的毒害。1.2.6危害食品本来是维持人类生存和繁衍的必需品，是人类从事社会活动的物质基础，是保证人体健康和战胜疾病的物质保证[1]。做好农产品农药残留检测及防控是当前众多科研工作者关注的热点[2]。大量施用化学农药会带来一定的卫生安全隐患，苹果中农药残留量超标会对人们的健康和生命安全产生危害，重则会导致人体的慢性中毒。有研究表明，心脑血管病、早老性痴呆、帕金森病等疾病的发生率提高都与农药残留的食用有直接关系[3]。1.3国内外农药残留研究现状1.3.1国外农药残留研究现状国外农药残留分析技术十分先进,气质联用、液质联用等高端的先进检测设备已成为农药残留分析的主要手段,色谱分离、质谱确证大大提高了分析的准确备已成为农药残留分析的主要手段,色谱分离、质谱确证大大提高了分析的准确性[4]。超临界流体萃取、固相微萃取、加速溶剂萃取等先进的前处理技术广泛用于农药残留分析中[5]。1.3.2国内农药残留研究现状我国农药残留分析技术近年来，在许多领域上都取得了重要进步。作为一种对环境和食品有着极高污染的物品，农药分析技术的提升受到了极大的重视。由于品种和用量的不断增加，新型的分析方法，尤其是多种类型农药的多残留分析方法、同类型农药的多残留分析方法以及新的单个农药在多种试样中的分析方法都取得了重要进展。各种先进的检测技术正逐渐应用于农药残留的分析检测中，使农药残留检出灵敏度得到了很大提高。传统的费事的样品预处理工作正在被各种新型的省时、省力、廉价、溶剂用量少、污染少得现代萃取技术取代。另外，农药残留快速检测技术也得到了快速发展[6][7][8]。1.4检测方法我国在1950年左右开始使用农药残留分析技术，直到现在，我国分析农药残留的方法还较为落后，能够分析出的农药数量很有限，远远不能跟上现在大量使用的农药品种数量。农药的残留量检测有很多的方法，如气相色谱法[9]、薄层扫描法[10]、气相色谱－质谱(GC－MS)法[11]、液相色谱－串联质谱(LC－MS/MS)法［12］等检测方法。1.4.1气相色谱法气相色谱法是利用气体作为流动相的一种色层分离分析方法。是根据各组份流出色谱柱的时间和浓度所得到的色谱图。根据图中的出峰时间和顺序，便可以对化合物进行定性分析；根据峰的高低和面积大小，可对化合物进行定量分析[13]。缺点是该方法的前处理太过于繁琐。1.4.2薄层色谱法薄层扫描法原理是将提取和纯化的样品点在薄层板上，并在254nm的紫外波长下照射，以形成棕褐色荧光淬灭点，将斑点的Rf值与标准斑点进行比较，进行定性和定量分析[14]。缺点是没有高的灵敏度，比较难检出物质；1.4.3气相色谱-质谱联用法气相色谱一质谱联用方法是将气相色谱对混合物的分离能力和质谱检测器的定性、定量的优势结合在一起[15]。但对于一些新型农药的检测，难以满足检测要求，会有多种因素影响实验结果的准确性。1.4.4液相色谱－串联质谱(LC－MS/MS)法液相色谱－串联质谱(LC－MS/MS)法是将液相色谱与质谱连用，仪器由分离系统和检测系统两大系统组成，分离系统是液相色谱，起到很强的分离物质的作用，检测系统是质谱系统，有很强的分辨能力，色谱和质谱的串联使用，发挥了两种功能的特点，使色谱和质谱的优势能够互补[16]。液相色谱-串联质谱法具备很强的抗干扰能力，使用简便快速，样品检测结果可靠，分析时间短，数据稳定。（1）工作原理液相色谱-串联质谱法由两部分组成，分别为色谱部分和质谱部分，由离子源、毛细管、离子漏斗、离子光学组件、四级杆1（MS1）和四级杆2（MS2）、碰撞池（CC）、检测器等组成，需要分析的生物分子首先进入高压液相色谱仪进行洗脱、分离，制备成质谱的样品，然后通过电离技术及接口技术对已制备的样品进行质谱定量分析[17]。（2）应用液相色谱-串联质谱法结合了液相色谱和质谱检测方法的优点，在很多领域的研究中有突出的表现，如医学中的新生儿筛查、治疗药物检测、激素水平测定、微生物鉴定以及农产品、食品中的农药残留量的测定等，这些都能查阅到相关的研究文献[18-20]。1.5提取方法提取是指采用合适的溶剂，运用一些新型的手段，从而使得农药从样品中分离出来的过程。提取是样品前处理的第一环节，由于样品的多样性，并且所要检测的农药的种类的不同，所以不同的样品所采用的提取方式也不同。在检测时要根据检测的样品及农药的种类来选择合适的提取方法。目前，我国检测农残常用的提取方法有微波辅助萃取、固相萃取、基质固相分散提取等技术。1.5.1微波辅助萃取微波辅助萃取的原理是固态萃取，主要是通过微波的波动性、高频性等特性来提高溶剂的萃取效率，加快萃取，缩短萃取时间[21]。缺点：需要极性溶剂、设备较为昂贵。1.5.2基质固相分散提取基质固相分散提取方法主要是将要检测的样品与萃取材料放在一起进行粉碎，粉碎到含有少量水分，再将粉碎后的样品作为作为填料进行装入固相萃取柱，在进行洗脱，得到目标物。其优点是操作简便、节省时间、提高效率，适合于分子结构和极性不同的农药残留检测[22]。缺点：该方法对样品的需要量较少，因此要求检测方法具有较高的灵敏度。1.5.3固相萃取固相萃取的原理为液固分离萃取，是通过吸附剂去吸附样品中的目标物，使目标物分离出来以后再用洗脱液洗脱收集，从而得到目标物的方法。这种方法能减少有机试剂消耗量，可自动化批量处理，具有回收率高、花费时间短、操作简单的优点[23]。1.6研究的目的及意义建立LC-MS法同时测定苹果中5种农药残留方法，对苹果质量控制提供参考。我国农药在农产品中的使用量居高不下，而这必将导致农产品中的农药残留超标。长期食用这样的农副产品，很可能导致疾病的发生，诱发癌症。苹果作为一种北方代表性水果，因其口感致密细脆，深受广大人群喜爱，采用液相色谱串联质普法测定苹果中的农残，具有高灵敏度、高通量、高选择性、良好的重复性等特点，可以为苹果质量控制提供参考。２.材料与方法2材料与方法2.1试剂与仪器2.1.1试剂表2-1试剂试剂（材料）名称试剂级别试剂(材料)生产商CAS号批号吡虫啉标准品标准品（100ug/mL）农业部环境保护科研监测所138261-41-32020.1.1呋喃丹（克百威）标准品（100ug/mL）农业部环境保护科研监测所1563-66-22020.1.1啶虫脒标准品标准品（100ug/mL）农业部环境保护科研监测所160430-64-82020.1.1霜霉威标准品（100ug/mL）农业部环境保护科研监测所24579-73-52020.1.1多菌灵标准品（100ug/mL）农业部环境保护科研监测所10605-21-72020.1.1乙腈（C2H3N）色谱级（HPLC）赛默飞世尔科技75-05-817105037甲醇（CH3OH）色谱级（HPLC）赛默飞世尔科技67-56-1192562甲苯（C7H8）色谱级（HPLC）赛默飞世尔科技108-88-3192019苹果编号为1#、2#2个生产地区2020.4.152.1.2仪器与耗材表2-2仪器与耗材名称型号生产厂商液相色谱-串联质谱仪Xevo-TQD三重四级杆沃特世科技（上海）有限公司有机相针式滤器（尼龙）13mm0.22um，上海安谱实验科技股份有限公司超声脱气仪As3120济宁鑫欣超声电子设备台式离心机TG16-WS上海安亭科学仪器厂电子天平METTLERTOLEDOME204德国IKA公司可调式/固定式混匀仪YQ-F-012大龙兴创实验仪器（北京）有限公司2.2溶液的配制2.2.1标准储备溶液（2ug/mL）的配制表2-3标准储备溶液的配制吡虫啉呋喃丹（克百威）啶虫脒霜霉威多菌灵标准品浓度（ug/mL）100ug/mL100ug/mL100ug/mL100ug/mL100ug/mL吸取标准品体积（mL）0.10mL0.10mL0.10mL0.10mL0.10mL定容体积（mL）5mL5mL5mL5mL5mL定容溶剂甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液2.2.2标准应用液的配制表2-4啶虫脒标准应用溶液的配制配制标准应用液浓度（ug/mL）0.0020.010.020.050.10.2吸取标准储备液体积/uL10501002505001000定容体积/uL10mL定容溶剂乙腈-水溶液（1：1）表2-5呋喃丹（克百威）标准应用溶液的配制配制标准应用液浓度（ug/mL）0.0020.010.020.050.10.2吸取标准储备液体积/uL10501002505001000定容体积/uL10mL定容溶剂乙腈-水溶液（1：1）表2-6啶虫脒标准应用溶液的配制配制标准应用液浓度（ug/mL）0.0020.010.020.050.10.2吸取标准储备液体积/uL10501002505001000定容体积/uL10mL定容溶剂乙腈-水溶液（1：1）表2-7霜霉威标准应用溶液的配制配制标准应用液浓度（ug/mL）0.0020.010.020.050.10.2吸取标准储备液体积/uL10501002505001000定容体积/uL10mL定容溶剂乙腈-水溶液（1：1）表2-8多菌灵标准应用溶液的配制配制标准应用液浓度（ug/mL）0.0020.010.020.050.10.2吸取标准储备液体积/uL10501002505001000定容体积/uL10mL定容溶剂乙腈-水溶液（1：1）2.2.3流动相的配制0.1%甲酸水：量取1mL甲酸于1000mL容量瓶中，用up水定容，0.22um水系滤膜过滤，后超声，作为流动相。乙腈：取1000mL质谱级用乙腈，用0.22um有机系滤膜过滤，后超声，作为流动相。2.2.4调谐液的配制调谐的目的：通过调谐找到目标定量化合物的最佳质11谱检测参数。包括MSMmethed中的电离极性，母离子，碎片离子，锥孔能量，碰撞能量。还可以用于优化MSTune中的毛细管电压，脱溶剂温度，脱溶剂气流量等参数。调谐母离子时：优化其离子源温度，锥孔气流速，脱溶剂气温度，脱溶剂气流速，从而确定母离子最佳优化条件。寻找子离子时：优化其锥孔电压，碰撞能量，确定子离子最佳优化条件。1号瓶：精确吸取1mL吡虫啉标准溶液（2ug/mL)，用流动相0.1%甲酸-乙腈（1:1）作为溶剂，定容至10mL,配制成200ppb的标准调谐液。2号瓶：精确吸取1mL呋喃丹（克百威）标准溶液（2ug/mL)，用流动相0.1%甲酸-乙腈（1:1）作为溶剂，定容至10mL,配制成200ppb的标准调谐液。3号瓶：精确吸取1mL啶虫脒标准溶液（2ug/mL)，用流动相0.1%甲酸-乙腈（1:1）作为溶剂，定容至10mL,配制成200ppb的标准调谐液。4号瓶：精确吸取1mL霜霉威标准溶液（2ug/mL)，用流动相0.1%甲酸-乙腈（1:1）作为溶剂，定容至10mL,配制成200ppb的标准调谐液。5号瓶：精确吸取1mL多菌灵标准溶液（2ug/mL)，用流动相0.1%甲酸-乙腈（1:1）作为溶剂，定容至10mL,配制成200ppb的标准调谐液。2.3仪器条件2.3.1色谱条件表2-9色谱条件色谱柱柱温流动相流速流动相ACQUITYUPLCBENC1840℃0.4mL/minA：0.1%甲酸溶液B：乙腈表2-10梯度洗脱条件T/minA：1%甲酸溶液/%B：乙腈/%F/mL/min0.0099.01.00.43.0070.030.00.46.0060.040.00.47.0099.01.00.42.3.2质谱条件表2-11质谱条件电离源模式与极性ESI的正模式测定方式多离子反应监测（MRM）碰撞气氩气稳定气氮气碰撞电压2-100v脱溶剂气流速50-1000L/Hr毛细管电压 1.0kv-4.0kv离子源温度100℃-200℃2.4样品前处理2.4.1苹果的预处理苹果去籽破碎匀浆，混匀待用。2.4.2提取称取2g苹果样品(精确至0.01g)放入50ml离心管中，加入15ml乙腈，加入5ml水，在涡旋混合器中涡旋5min，加入2g氯化钠，涡旋5min，以4200r/min离心5min，取所有上清液放入150ml鸡心瓶中，向离心管中加入15ml乙腈，重复涡旋5min，以4200r/min离心5min，将所有上清液与之前的上清液合并，旋转蒸发至1mL~2mL，待净化。2.4.3净化取固相萃取柱（500mg、6mL）进行活化。（1）活化：加样前先用5mL水再用5mL乙腈活化固相萃取柱。（2）上样：向活化后的固相萃取柱中倒入提取后待净化的样品。（3）淋洗：用2mL乙腈-甲苯溶液（1：1）洗涤样品瓶两次，将溶液依次倒入固相萃取住中。（4）洗脱：用25mL乙腈-甲苯溶液（1：1）洗脱固相萃取住并将溶液收集在储液器中。（5）浓缩：将储液器放置40℃水浴氮吹近干，用1mL的乙腈-水溶液（1：1）溶解，经0.22um滤膜过滤，检测。2.5含量计算公式采用外标法以峰面积计算定量。式中：W1—样品中吡虫啉的含量，mg/kg；W2—样品中呋喃丹（克百威）的含量，mg/kg；W3—样品中吡虫啉的含量，mg/kg；W4—样品中霜霉威的含量，mg/kg；W5—样品中多菌灵的含量，mg/kg；C1—标准曲线得到的吡虫啉浓度，ng/mL；C2—标准曲线得到的呋喃丹（克百威）浓度，ug/mL；C3—标准曲线得到的吡虫啉浓度，ug/mL；C4—标准曲线得到的霜霉威浓度，ug/mL；C5—标准曲线得到的多菌灵浓度，ug/mL；m—样品质量，g；V—待测液的体积，mL。2.6定性、定量测定定性测定：在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品的质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的相对离子丰度比一致，则通过对检出的色谱峰的保留时间与标准样品相对比，来判断样品中是否存在这种农药。定量测定：本实验采用外标-校准曲线法定量测定。通过采用基质混合标准工作溶液绘制标准曲线。按照标准曲线得出它们的线性方程和相关系数，通过曲线图中的直线部分得到线性范围。

３.结果与讨论3结果与讨论3.1质谱条件的确定3.1.1质谱调谐最佳优化参数确定根据查阅相关文献以及仪器厂家所给定方案，确定质谱参数时，测定项目所用流动相为0.1%甲酸和乙腈，流速为0.3mL/min，调谐所用溶液浓度范围值（50ppb-400ppb），以及根据质谱仪器上的计算工具（MolecularWeightCaculator）查阅并计算出吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵其各自相关的母离子及子离子。表3-1吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵其母离子优化条件数据离子源温度（℃）毛细管电压（kv）脱溶剂气温度（℃）锥孔气流速（L/Hr）柱温（℃）响应值（v）1102.0550800301.45e51303.05001000401.76e61503.0650600355.63e5色谱柱ACQUITYUPLCBEHG8,2.1×100um,1.7um系统采集方法ESI正离子源，MS质谱模式（多反应离子监测）测试项目吡虫啉呋喃丹啶虫脒霜霉威多菌灵母离子256.1222.3223.2189.2192.1由表3-1可得出吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵在离子源温度130℃、毛细管电压3.0kv、脱溶剂气温度500℃、锥孔气流速1000L/Hr、柱温40℃条件下，其响应值1.76e6最高，故该条件为吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵检测母离子的最优质谱条件。表3-2子离子优化条件数据名称子离子锥孔电压（v）碰撞能量（v）响应值吡虫啉209.120191.10e530163.19e538262.03e5175.1a）20192.58e530165.03e538262.15e5呋喃丹（克百威）165.0a）20192.08e530206.07e538232.18e5123.020172.06e530195.18e538262.01e5啶虫脒126.0a）25153.16e530185.37e540282.04e556.025152.73e530203.69e540282.11e5霜霉威102.1a）25143.11e530156.08e540261.89e5144.225182.93e530224.19e540302.22e5多菌灵160.1a）25172.86e530255.29e540291.95e5105.025152.66e530215.01e540241.87e5注：a）代表定量离子。由表3-2可得出，在表3-1检测母离子的最优质谱条件下，通过调谐吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵所对应的锥孔电压、碰撞能量，所测得吡虫啉的锥孔电压、碰撞能量在30v、16v下其响应值为5.03e5，呋喃丹（克百威）的锥孔电压、碰撞能量在30v、20v下其响应值为6.07e5，啶虫脒的锥孔电压、碰撞能量在30v、18v下其响应值为5.37e5，霜霉威的锥孔电压、碰撞能量在30v、15v下其响应值为6.08e5，多菌灵的锥孔电压、碰撞能量在30v、25v下其响应值为5.29e5，从而确定最佳质谱条件。3.2定量分析图3-2定量分析将吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵的标准溶液各进样一次，由图3-2得到其保留时间为吡虫啉3.41min，呋喃丹（克百威）5.05min，啶虫脒3.59min，霜霉威2.19min、多菌灵2.06min。得到吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵色谱、质谱条件如表3-4所示：表3-4啶虫脒、吡虫啉色谱、质谱条件农药名称保留时间定量离子对碰撞电压/V碰撞能量/V吡虫啉3.41256.1/209.13016呋喃丹5.05222.3/165.13020啶虫脒3.59223.2/126.03018霜霉威2.19189.2/102.13015多菌灵2.06192.1/160.130253.3标准曲线的绘制以吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵标准曲线系列浓度（X，ng/mL）为横坐标，响应值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，见图3-3，图3-4，图3-5，图3-6，图3-7。图3-3啶虫脒标准曲线图3-4克百威标准曲线图3-5吡虫啉标准曲线图3-6霜霉威标准曲线图3-7多菌灵标准曲线表3-5标准曲线的线性方程、相关系数和线性范围农药名称线性方程相关系数/R2线性范围啶虫脒0.99942~200ng/mL呋喃丹0.99972~100ng/mL吡虫啉0.99912~200ng/mL霜霉威0.99992~30ng/mL多菌灵0.99912~100ng/mL由表3-5可得，吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵的相关系数都大于0.9990，线性关系良好，线性范围分别为吡虫啉2~200ng/mL，呋喃丹（克百威）2~100ng/mL，啶虫脒2~200ng/mL，霜霉威2~30ng/mL、多菌灵2~100ng/mL时，其浓度与其响应值呈线性关系，满足试验分析要求。3.4提取方式的确定通过对不同的提取方式的选取，比较所提取的样品所测的回收率，从而确定最佳的提取方式。三种提取方式分别为：涡旋5min、超声15min和涡旋5min及超声15min结合的方式。分别称取苹果样品2.00g（精确至0.0001g）共两份，编号记为1#、2#（如表3-6所示）。向所称两份苹果样品中分别加入1.0mL的10ng/mL吡虫啉标准应用液、1.0mL的10ng/mL呋喃丹（克百威）标准应用液、1.0mL的10ng/mL啶虫脒标准应用液、1.0mL的10ng/mL霜霉威标准应用液、1.0mL的10ng/mL多菌灵标准应用液，通过对2.4样品前处理的方法进行处理，改变提取方式，其他实验条件不变的情况下，得到试验结果如下图3-5所示。图3-5提取方式对回收率的影响通过图3-5比较得出，两份所测样品使用涡旋与超声结合的提取方式时，回收率都接近90%，从而样品提取方式选择涡旋5min及超声15min结合的方式。3.5提取溶剂的选择通过选取不同的提取溶剂，比较提取的样品所测得的回收率，确定最佳提取溶剂。三种提取溶剂分别为：甲醇、乙腈、0.1%乙酸乙腈。分别称取苹果样品2.00g（精确至0.0001g）共两份，编号分别记为1#、2#（如表3-7所示）。向所称的两份苹果样品中分别加入1.0mL的10ng/mL的吡虫啉标准应用液、1.0mL的10ng/mL呋喃丹（克百威）标准应用液、1.0mL的10ng/mL啶虫脒标准应用液、1.0mL的10ng/mL霜霉威标准应用液、1.0mL的10ng/mL多菌灵标准应用液，通过对2.4样品前处理的方法进行处理，改变提取溶剂，其他实验条件不变的情况下，得到试验结果如下图3-6所示。图3-6提取溶液对回收率的影响通过图3-6比较得出，两份所测样品选择0.1%乙酸乙腈作为提取溶液时，回收率都高于90%，从而样品提取溶剂选择0.1%乙酸乙腈溶液。3.6固相萃取柱的优化通过对不同固相萃取柱的选取，对提取的样品所测回收率进行比较，确定最佳固相萃取柱。三种固相萃取柱分别为：HLB柱，NH2柱，QuickProCP柱。分别称取苹果样品2.00g（精确至0.0001g）共两份。向所称两份苹果样品中分别加入1.0mL的10ng/mL的吡虫啉标准应用液、1.0mL的10ng/mL呋喃丹（克百威）标准应用液、1.0mL的10ng/mL啶虫脒标准应用液、1.0mL的10ng/mL霜霉威标准应用液、1.0mL的10ng/mL多菌灵标准应用液，通过对2.4样品前处理的方法进行处理，改变固相萃取柱，其他实验条件不变的情况下，得到试验结果如下图3-7所示。图3-7固相萃取柱对回收率的影响由图3-7可以得出，使用HLB柱、NH2柱时，吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵的加标回收率值相差不大；使用QuickProCP柱时，吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵的回收率最高，从而因此固相萃取柱选用QuickProCP柱。3.7方法验证3.7.1加标回收率实验分别称取枸杞样品2.00g（精确至0.001g）两组，编号记为1#、2#（如表3-9所示），对于两份样品分别进行低水平（LOQ）添加和高水平（4LOQ）添加，通过对2-4样品前处理的方法进行处理，测定它们的加标回收率，测得的数据见表3-9。表3-10不同加标浓度的验证样品编号称样质量/g农药名称加标浓度加标后样品测定值ng/mL样品测定值ng/mL加标回收率/%1#2.0009啶虫脒5ng/mL4.520.0689.22#2.001120ng/mL19.140.0595.451#2.0009呋喃丹5ng/mL4.490.04892#2.001120ng/mL19.260.0396.151#2.0009吡虫啉5ng/mL4.560.06902#2.001120ng/mL19.270.0596.11#2.0009霜霉威5ng/mL4.510.06892#2.001120ng/mL19.120.0595.351#2.0009多菌灵5ng/mL4.490.0688.62#2.001120ng/mL19.530.0797.3结果表明，吡虫啉、呋喃丹（克百威）、啶虫脒、霜霉威、多菌灵在本方法试验中，不同添加水平下的加标回收率均符合GB/T27404-2008附录F要求。3.7.2稳定性试验称取苹果样品2.00g（精确至0.0001g）一份，对此份样品添加浓度为10ng/mL的啶虫脒和吡虫啉标准混合溶液，分别放置30min、60min、90min、120min分别上机测定。表3-11样品中添加标准混和溶液稳定性试验所测农药浓度/时间min3060（60min内）RSD/%90120（120min内）RSD/%啶虫脒浓度ng/mL9.619.660.379.328.952.86呋喃丹浓度ng/mL9.119.130.168.938.652.25吡虫啉浓度ng/mL9.169.140.159.018.920.71霜霉威浓度ng/mL9.299.310.159.189.140.31多菌灵浓度ng/mL9.499.450.309.329.240.61由表3-11可得，啶虫脒加标样品120min内的RSD值为2.86%，60min内的RSD值为0.37%，因此标样配好后60min内0-4℃避光保存效果更好。呋喃丹（克百威）加标样品120min内的RSD值为2.25%，60min内的RSD值为0.16%，因此标样配好后60min内0-4℃避光保存效果更好。吡虫啉加标样品120min内的RSD值为0.71%，60min内的RSD值为0.15%，因此样品处理好后60min内0-4℃避光保存效果更好。霜霉威加标样品120min内的RSD值为0.31%，60min内的RSD值为0.15%，因此标样配好后60min内0-4℃避光保存效果更好。多菌灵加标样品120min内的RSD值为0.61%，60min内的RSD值为0.30%，因此标样配好后60min内0-4℃避光保存效果更好。3.7.3精密度试验由甲、乙两名同学分别称取2.0g（精确至0.001g），加入1.0mL的10ng/mL啶虫脒标准应用液、1.0mL的10ng/mL呋喃丹（克百威）标准应用液、1.0mL的10ng/mL的吡虫啉标准应用液、1.0mL的10ng/mL霜霉威标准应用液、1.0mL的10ng/mL多菌灵标准应用液，做六祖平行实验测定，枸杞中啶虫脒、吡虫啉的加标回收率及RSD值见下表3-12所示。表3-12精密度试验人员农药名称加标浓度/ng/mL加标回收率（%）平均加标回收率（%）RSD%RSD均值123456甲啶虫脒10.0085.6883.9682.6988.0683.2986.9885.112.522.29呋喃丹10.0090.1687.2890.6786.6690.8990.0589.292.05吡虫啉10.0088.2591.9383.3891.0589.5892.3189.423.723.39霜霉威10.0088.6390.189.7683.1989.9190.1288.623.07多菌灵10.0088.6889.2189.3489.1789.2489.3889.170.280.39乙啶虫脒10.0088.6788.9488.7688.3288.