甲型副伤寒杆菌ompA基因特征、分布及重组表达产物免疫学鉴定研究

甲型副伤寒杆菌ompA基因特征、分布及重组表达产物免疫学鉴定研究一、引言1.1研究背景与意义伤寒和副伤寒是由伤寒杆菌、甲或乙副伤寒杆菌感染引起的肠热症，是常见的人类急性传染病，严重威胁着人们的身体健康甚至危及生命，未经正规治疗者的死亡率可高达10%。在伤寒和副伤寒地方性流行区，细菌还可寄生于胆囊，形成胆囊-肠道反复感染，导致长期慢性菌血症，出现发热长达数月的慢性感染者。伤寒和副伤寒在症状、体征、病理变化以及药物治疗等方面均无本质区别，但伤寒病情通常较副伤寒更重。近年来，我国不少省市或自治区先后暴发了甲副伤寒杆菌感染引起的甲型副伤寒地区性流行，且逐渐向中西部地区扩散和蔓延，疫情形势严峻。与之形成对比的是，伤寒杆菌感染引起的伤寒所占比例及其病例数明显减少。例如，浙江省近5年甲副伤寒发病率高达49.44/10万。因此，甲型副伤寒已成为近年来我国，特别是江南地区重要的再发传染病。目前，伤寒Vi多糖疫苗已取代传统的伤寒三联疫苗，但由于甲型副伤寒杆菌无荚膜多糖，现有的荚膜多糖疫苗对甲型副伤寒并无预防效果。甲型副伤寒灭活疫苗也因副反应太大而停止使用，且至今尚无新的有效疫苗用于预防甲型副伤寒，人群普遍缺乏免疫力，这使得防治甲型副伤寒的形势极为严峻。甲型副伤寒杆菌等沙门菌属于革兰阴性菌，具有外膜结构，其外膜蛋白（outermembraneproteins，OMP）通常是主要的表面抗原成分。McClelland等报道了甲副伤寒杆菌ATCC9150株的全基因组序列，这为研究该菌的OMP抗原提供了明确的信息。在该甲副伤寒杆菌菌株的全基因组序列中，至少有20个OMP编码基因，其中主要的OMP包括OmpA、OmpC、OmpN和OmpW等。然而，这些OMP的免疫原性和免疫保护作用此前均未有相关研究报道。本研究旨在构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统，鉴定重组表达产物rOmpA的免疫原性，检测我国甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因的携带率，并通过小鼠感染模型初步探究rOmpA的免疫保护作用，为rOmpA作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗的候选抗原提供有力依据。这对于研发新型甲型副伤寒疫苗，预防和控制甲型副伤寒的流行具有重要的现实意义，有望为公共卫生领域带来积极影响，有效降低甲型副伤寒的发病率，保障人们的健康。1.2甲型副伤寒杆菌概述甲型副伤寒杆菌（SalmonellaparatyphiA）隶属于肠杆菌科沙门氏菌属，是一种革兰氏阴性杆菌。其呈短杆状，大小约为(0.6-1.0)μm×(2-3)μm，周身分布着鞭毛，这赋予了它运动的能力，无芽孢和荚膜。在普通培养基上，甲型副伤寒杆菌能够良好生长，形成圆形、光滑、湿润、边缘整齐且半透明的菌落。它兼性厌氧，最适宜的生长温度为37℃，最适pH值在7.2-7.4之间。在含有乳糖的培养基上，由于其不能发酵乳糖，菌落通常呈现无色透明的状态，借此特性可与其他能够发酵乳糖的细菌进行区分。甲型副伤寒杆菌主要通过消化道途径传播，被污染的食物和水是主要的传播媒介。当人们食用了被该菌污染的食物，如未煮熟的肉类、蛋类、奶制品，或饮用了被污染的水源，包括未经处理的井水、河水等，就极易感染甲型副伤寒杆菌。此外，日常生活中的密切接触，如接触了被患者排泄物污染的物品或环境，再通过手-口途径也可能导致感染。苍蝇、蟑螂等昆虫在觅食过程中，若接触了含有甲型副伤寒杆菌的污染物，再污染食物，人食用后也会感染病菌。在卫生条件较差的地区或人群密集场所，这种传播途径更为常见。其致病机制较为复杂，涉及多种毒力因子。当细菌通过口腔进入人体后，会首先在小肠内侵袭Peyer氏淋巴结，并在此处大量增殖。细菌产生的毒力因子，如侵袭蛋白，能够帮助细菌突破肠道上皮细胞的屏障，进入组织和血液；内毒素则可引发机体的发热、炎症反应等一系列病理变化，导致发热、腹痛、腹泻等肠炎症状。在严重的感染情况下，细菌还可能侵入血液循环，引发败血症，进一步导致全身多器官功能受损，甚至发生肠穿孔等严重并发症，危及生命。甲型副伤寒杆菌感染人体后，会引发甲型副伤寒这一急性传染病。患者通常会出现持续发热的症状，体温可达39℃以上，且发热可持续较长时间。同时，还伴有食欲减退、腹胀、腹痛、腹泻等消化道症状，严重影响患者的营养摄入和身体健康。部分患者可能会出现表情淡漠、反应迟钝等神经系统症状，以及肝脾肿大、相对缓脉等体征。若病情未能得到及时有效的控制，还可能并发肠出血、肠穿孔等严重疾病，导致腹膜炎、感染性休克等，大大增加了患者的死亡率。在我国，甲型副伤寒的流行呈现出一定的特点。近年来，甲型副伤寒的发病率在部分地区呈上升趋势，尤其在南方地区更为明显。水源污染常常是导致甲型副伤寒暴发流行的重要原因，一旦水源被污染，短时间内就可能造成大量人群感染。例如，广西河池市罗城仫佬族自治县部分中小学曾因饮用不洁水暴发甲型副伤寒疫情。甲型副伤寒全年均可发病，但在夏秋季节，由于气温较高，细菌易于繁殖，且人们的饮食和生活习惯等因素，使得发病率相对较高。同时，免疫力低下人群，如儿童、老年人以及患有慢性疾病的患者，更容易感染甲型副伤寒杆菌，且感染后的病情往往更为严重。1.3ompA基因相关背景外膜是革兰氏阴性菌的重要结构组成，其外膜蛋白（OMP）作为主要的表面抗原成分，在细菌的生理活动以及与宿主的相互作用中发挥着关键作用。在众多的OMP中，ompA基因编码的外膜蛋白A（OmpA）备受关注。ompA基因编码的产物是一种高度保守的外膜蛋白，其结构具有独特性。OmpA蛋白通常由多个结构域构成，包括N端的跨膜结构域和C端的周质结构域。跨膜结构域由多个β-折叠片组成，形成β-桶状结构，贯穿于细菌的外膜，为蛋白质提供了稳定的膜锚定作用。C端的周质结构域则延伸至细菌的周质空间，参与多种生理过程。这种结构使得OmpA不仅在维持细菌外膜的完整性和稳定性方面发挥着重要作用，还参与了细菌与宿主细胞的黏附、信号传导等过程。例如，在大肠杆菌中，OmpA能够通过其周质结构域与肽聚糖层相互作用，增强细菌细胞壁的强度，维持细胞的形态和结构稳定。在铜绿假单胞菌中，OmpA参与了细菌对宿主细胞的黏附和入侵过程，其跨膜结构域与宿主细胞表面的受体相互识别和结合，从而促进细菌的感染。在细菌的生存和致病过程中，OmpA发挥着不可或缺的作用。它能够帮助细菌抵御外界环境的压力，如渗透压变化、抗菌物质的攻击等。研究发现，在面对某些抗生素时，OmpA的存在可以降低抗生素对细菌的渗透，从而增强细菌的耐药性。OmpA还参与了细菌的群体感应调节，通过与其他细菌表面的OmpA相互作用，实现细菌间的信号传递和信息交流，协调细菌群体的行为。在沙门氏菌中，OmpA与细菌的毒力密切相关，它可以影响细菌在宿主体内的存活、繁殖和扩散能力。当沙门氏菌感染宿主时，OmpA能够帮助细菌逃避宿主免疫系统的识别和清除，促进细菌在宿主体内的定殖和致病。鉴于OmpA在细菌中的重要作用及其保守性，使其在疫苗研究领域展现出巨大的潜在价值。以OmpA为基础开发的疫苗，有可能激发机体产生针对多种革兰氏阴性菌的免疫反应，为预防和控制相关感染性疾病提供新的策略。由于OmpA在不同菌株间具有较高的序列保守性，针对OmpA的疫苗有望提供广泛的交叉保护，克服传统疫苗针对特定菌株的局限性。通过对OmpA进行结构改造和优化，还可以增强其免疫原性，提高疫苗的保护效果。例如，将OmpA与合适的佐剂联合使用，或者构建OmpA的重组表达载体，都有可能提高疫苗的免疫效果。在一些研究中，已经成功构建了表达OmpA的重组疫苗，并在动物模型中验证了其对相关细菌感染的免疫保护作用，为OmpA作为疫苗候选抗原的进一步开发奠定了基础。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株来源甲型副伤寒杆菌临床株JH01由浙江大学医学院附属第一医院检验科惠赠，该菌株分离自一位确诊为甲型副伤寒的患者血液样本。在临床诊断过程中，通过血液细菌培养技术，从患者发热高峰期采集的血液标本中成功分离得到该菌株，并经过生化鉴定和血清学试验确认为甲型副伤寒杆菌。另外98株甲型副伤寒杆菌临床菌株分别收集自浙江、江苏、上海、江西、安徽等我国南方地区的多家医院，这些医院均具备完善的临床微生物检测实验室，菌株分离过程严格遵循临床微生物学检验操作规程。具体来说，采集患者的粪便、血液、骨髓等标本，接种于选择性培养基，如SS琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基等，在37℃恒温培养箱中培养18-24小时，挑取可疑菌落进行生化鉴定和血清学凝集试验，确定为甲型副伤寒杆菌菌株。所有菌株均保存于含有20%甘油的LB肉汤培养基中，置于-80℃超低温冰箱，以保证菌株的生物学特性稳定。使用时，从-80℃冰箱取出保存的菌株，迅速放入37℃恒温水浴锅中进行复苏，待菌株完全融化后，取适量菌液接种于新鲜的LB固体培养基平板上，在37℃恒温培养箱中培养18-24小时，使菌株恢复生长活性。2.1.2实验动物选用6-8周龄、体重为18-22g的雌性BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，该公司具备实验动物生产许可证和经营许可证，小鼠质量符合国家标准。小鼠饲养于浙江大学实验动物中心的屏障环境动物房内，温度控制在(22±2)℃，相对湿度为(50±10)%，12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。小鼠自由摄食和饮水，饲料为全价营养颗粒饲料，符合实验动物饲料卫生标准，饮用水为经过高温高压灭菌处理的纯净水。在实验开始前，小鼠在动物房内适应性饲养1周，以减少环境因素对实验结果的影响。2.1.3主要试剂与仪器实验所需的主要试剂包括：PCR扩增试剂盒（TaKaRa公司），包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCR缓冲液等，用于ompA基因的扩增；T-A克隆试剂盒（BioDev.Tech公司），用于将扩增的ompA基因片段克隆至pUC57-T载体中；限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶（TaKaRa公司），用于构建原核表达载体pET-42a-ompA；DNAMarker（TaKaRa公司），用于在琼脂糖凝胶电泳中确定DNA片段的大小；质粒提取试剂盒（Qiagen公司），用于提取重组质粒；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Sigma公司），用于诱导重组蛋白的表达；蛋白Marker（ThermoFisherScientific公司），用于在SDS-PAGE电泳中确定蛋白质的分子量；考马斯亮蓝染色液（Solarbio公司），用于对SDS-PAGE凝胶上的蛋白质进行染色；兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清，由本实验室制备，将灭活的甲型副伤寒杆菌全菌免疫家兔，经过多次免疫后采集血液，分离血清得到；羊抗兔IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，JacksonImmunoResearch公司），用于Westernblot检测中的二抗；ECL化学发光试剂（ThermoFisherScientific公司），用于Westernblot检测中发光信号的产生。主要仪器设备有：PCR仪（Bio-Rad公司），用于ompA基因的扩增反应；高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细菌菌体的收集、质粒提取过程中的离心等；恒温摇床（NewBrunswick公司），用于细菌的培养和诱导表达过程中的振荡培养；电泳仪（Bio-Rad公司），用于DNA和蛋白质的凝胶电泳；凝胶成像系统（Bio-Rad公司），用于观察和分析琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE电泳结果；酶标仪（ThermoFisherScientific公司），用于免疫扩散法和微量肥达试验中的吸光度检测；恒温培养箱（ThermoFisherScientific公司），用于细菌的培养和动物实验中的恒温饲养；超低温冰箱（ThermoFisherScientific公司），用于菌株和试剂的保存。2.2实验方法2.2.1ompA基因扩增与克隆根据GenBank中公布的甲型副伤寒杆菌ompA基因序列（GenBankNo.CP000026），利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。正向引物：5'-CATATGATGACGCTGCTGCTG-3'，引入NdeⅠ酶切位点（下划线部分）；反向引物：5'-CTCGAGTTATTTTTCTGCCGCTG-3'，引入XhoⅠ酶切位点（下划线部分）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增反应体系总体积为50μL，具体组成如下：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA（甲型副伤寒杆菌临床株JH01基因组DNA）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，用ddH₂O补足至50μL。将上述反应体系轻轻混匀后，短暂离心，使液体集中于管底。扩增条件为：94℃预变性5min；然后进行30个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μLPCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶中加入适量的GoldView核酸染料进行染色，在紫外凝胶成像系统下观察结果。若出现预期大小约为1053bp的特异性条带，则表明扩增成功。将PCR扩增得到的ompA基因片段进行T-A克隆。使用T-A克隆试剂盒，按照试剂盒说明书操作。具体步骤为：将PCR产物与pUC57-T载体在16℃下连接过夜，连接体系为：pUC57-T载体1μL，PCR产物4μL，SolutionⅠ5μL。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上解冻，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；然后42℃热激90s，迅速放回冰浴中2min；加入890μL无抗LB液体培养基，37℃振荡培养1h，使细菌恢复生长。取适量菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。采用碱裂解法提取重组质粒，具体步骤为：取1.5mL菌液于离心管中，12000r/min离心1min，弃上清；加入100μL冰预冷的SolutionⅠ，用移液器吹打均匀，使菌体充分悬浮；加入200μLSolutionⅡ，轻柔颠倒混匀4-6次，室温放置2min，使菌体裂解；加入150μL冰预冷的SolutionⅢ，轻柔颠倒混匀4-6次，冰浴10min，使蛋白质和基因组DNA沉淀；12000r/min离心10min，将上清转移至新的离心管中；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），振荡混匀，12000r/min离心10min，将上清转移至新的离心管中；加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min；12000r/min离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后加入适量的ddH₂O溶解质粒。将提取的重组质粒送上海Invitrogen公司进行测序，测序结果与GenBank中公布的ompA基因序列进行比对分析，以验证克隆的准确性。2.2.2原核表达系统构建将测序正确的重组质粒pUC57-ompA和原核表达载体pET-42a分别用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切。酶切反应体系（50μL）：重组质粒或pET-42a质粒1μg，10×Buffer5μL，NdeⅠ和XhoⅠ各1μL，用ddH₂O补足至50μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收目的片段，即ompA基因片段和线性化的pET-42a载体片段。将回收的ompA基因片段与线性化的pET-42a载体片段用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系（10μL）：线性化pET-42a载体1μL，ompA基因片段3μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA连接酶1μL，用ddH₂O补足至10μL。16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。转化步骤同T-A克隆转化步骤。将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。采用碱裂解法提取重组质粒pET-42a-ompA，并用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，酶切反应体系及条件同上。酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现约1053bp的ompA基因片段和5900bp左右的pET-42a载体片段，则表明重组质粒构建成功。同时，对重组质粒进行PCR鉴定，PCR反应体系及条件同ompA基因扩增，若能扩增出预期大小的目的条带，进一步验证重组质粒的正确性。2.2.3rOmpA表达检测与产量分析将鉴定正确的重组菌pET-42a-ompA/BL21（DE3）接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，作为种子液。按1:100的比例将种子液转接至新鲜的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达4h。诱导表达结束后，取1mL菌液于离心管中，12000r/min离心1min，弃上清。加入100μLPBS重悬菌体，再加入100μL2×SDS上样缓冲液，混匀后100℃煮沸5min，使蛋白质变性。将变性后的样品进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE凝胶配制采用分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。将样品和蛋白Marker分别上样，80V恒压电泳至溴酚蓝进入分离胶后，改为120V恒压电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝染色液染色3-4h，然后用脱色液脱色至背景清晰，观察rOmpA的表达情况，在凝胶上若出现预期大小约为42kDa的特异性条带，则表明rOmpA成功表达。利用Bio-Rad凝胶图像分析系统对SDS-PAGE凝胶进行扫描分析，测定rOmpA条带的光密度值（OD值），并与凝胶上的蛋白Marker条带进行比较，计算rOmpA的表达量占细菌总蛋白的百分比，以此分析rOmpA的产量。具体计算公式为：rOmpA表达量（%）=（rOmpA条带OD值/细菌总蛋白条带OD值之和）×100%。2.2.4免疫学鉴定方法免疫扩散法：采用双向免疫扩散试验检测rOmpA的抗原性。将1%琼脂糖凝胶融化后，趁热倒在洁净的载玻片上，制成厚度约为1mm的凝胶板。待凝胶凝固后，用打孔器在凝胶板上打出直径为3mm的小孔，孔间距为5mm。在中央孔中加入兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清，周围孔中分别加入不同浓度的rOmpA蛋白溶液。将载玻片置于湿盒中，37℃温育24-48h。观察凝胶板上是否出现沉淀线，若出现沉淀线，则表明rOmpA与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清发生特异性免疫反应，即rOmpA具有抗原性。沉淀线的清晰度和强度可反映rOmpA与抗体结合的能力。若沉淀线清晰且颜色较深，说明rOmpA与抗体结合能力较强，抗原性较好；反之，若沉淀线模糊或颜色较浅，则说明rOmpA抗原性相对较弱。微量肥达试验：将rOmpA免疫小鼠后的血清进行倍比稀释，从1:5开始，依次稀释至1:640。取稀释后的血清各50μL加入96孔酶标板中，再加入等量的甲型副伤寒杆菌H抗原（浓度为1×10⁸CFU/mL），轻轻混匀。同时设置阳性对照（甲型副伤寒杆菌全菌抗血清）和阴性对照（正常小鼠血清）。将酶标板置于37℃孵育2h，然后用酶标仪在620nm波长处测定各孔的吸光度值（A值）。以A值大于阴性对照A值的2.1倍为阳性判断标准，记录各孔的凝集情况，以出现凝集的最高血清稀释度作为血清的凝集效价，以此检测rOmpA免疫小鼠血清对甲型副伤寒杆菌H抗原的凝集效价，评估rOmpA诱导小鼠产生抗体的能力。若免疫小鼠血清的凝集效价较高，说明rOmpA能够诱导小鼠产生较强的免疫反应，产生较多的特异性抗体；反之，若凝集效价较低，则表明rOmpA诱导免疫反应的能力较弱。Westernblot鉴定：将诱导表达的rOmpA进行SDS-PAGE电泳后，采用半干转膜法将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。转膜条件为：电流15mA/cm²，转膜时间60min。转膜结束后，将NC膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温振荡封闭1-2h，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭后，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min。加入兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min。加入羊抗兔IgG-HRP（1:5000稀释），室温振荡孵育1h。再次用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min。最后，将NC膜放入ECL化学发光试剂中反应1-2min，在凝胶成像系统下曝光显影，观察是否出现特异性条带。若出现与预期大小相符的特异性条带，则表明rOmpA能与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清发生特异性免疫反应，具有良好的免疫反应性。条带的亮度可反映rOmpA与抗体结合的量，亮度越高，说明rOmpA与抗体结合量越多，免疫反应性越强。2.2.5ompA基因携带率检测采用PCR方法检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因的携带率。以提取的各临床菌株基因组DNA为模板，引物及PCR反应体系同ompA基因扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；然后进行30个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μLPCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察结果。若出现预期大小约为1053bp的特异性条带，则判定该菌株携带ompA基因。统计出现阳性条带的菌株数量，计算ompA基因携带率，计算公式为：ompA基因携带率（%）=（携带ompA基因的菌株数/总菌株数）×100%。通过检测ompA基因携带率，可以了解ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中的分布情况，为后续研究提供基础数据。若ompA基因携带率较高，说明该基因在甲型副伤寒杆菌中较为普遍，具有作为疫苗候选抗原的潜力；反之，若携带率较低，则需要进一步考虑其在疫苗研发中的适用性。2.2.6小鼠感染模型与免疫保护实验将6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为3组，每组12只。分别为rOmpA免疫组、佐剂对照组和空白对照组。rOmpA免疫组：将纯化的rOmpA蛋白用PBS稀释至适当浓度，与弗氏完全佐剂按1:1比例混合乳化，制备成免疫原。每只小鼠皮下注射0.2mL免疫原，进行初次免疫。2周后，用rOmpA蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1比例混合乳化制备的免疫原进行加强免疫，免疫剂量和途径同初次免疫。佐剂对照组：每只小鼠皮下注射0.2mL弗氏完全佐剂与PBS的混合液进行初次免疫，2周后用弗氏不完全佐剂与PBS的混合液进行加强免疫，免疫剂量和途径同rOmpA免疫组。空白对照组：每只小鼠皮下注射0.2mLPBS，免疫程序同rOmpA免疫组。末次免疫后2周，将各组小鼠用乙醚轻度麻醉，然后通过腹腔注射感染甲型副伤寒杆菌50001株，感染剂量为1×10⁹CFU/只。感染后，每天观察小鼠的精神状态、饮食情况、活动能力等，并记录小鼠的死亡情况。连续观察14天，计算各组小鼠的存活率，以此评估rOmpA对甲型副伤寒杆菌感染的免疫保护作用。存活率计算公式为：存活率（%）=（存活小鼠数/每组小鼠总数）×100%。若rOmpA免疫组小鼠的存活率明显高于佐剂对照组和空白对照组，说明rOmpA具有一定的免疫保护作用，能够降低小鼠感染甲型副伤寒杆菌后的死亡率；反之，若存活率无明显差异，则表明rOmpA的免疫保护效果不佳。对实验数据进行统计分析，采用SPSS22.0软件进行统计学处理。组间存活率的比较采用Log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。通过统计分析，可以更准确地评估rOmpA的免疫保护作用，为其作为疫苗候选抗原的进一步研究提供科学依据。三、结果与分析3.1ompA基因序列分析将克隆得到的ompA基因送上海Invitrogen公司进行测序，测序结果与GenBank中公布的甲型副伤寒杆菌ompA基因序列（GenBankNo.CP000026）进行比对分析。结果显示，所克隆的ompA基因核苷酸序列与报道序列的相似性高达100％，这表明在基因扩增和克隆过程中，未出现碱基的错配、缺失或插入等情况，成功地获得了完整且准确的ompA基因序列。进一步对其推导的氨基酸序列进行分析，同样与报道序列的相似性为100％。这意味着该基因编码的OmpA蛋白在氨基酸组成和排列顺序上与已知序列完全一致，保证了蛋白结构和功能的稳定性。从基因序列特点来看，ompA基因全长为1053bp，编码350个氨基酸。对其核苷酸组成进行统计分析，发现A、T、C、G四种碱基的含量分别为25.7％、25.3％、24.9％和24.1％，A+T含量（51.0％）略高于G+C含量（49.0％）。这种碱基组成特点可能与基因的转录、翻译以及稳定性等生物学过程密切相关。在基因的编码区，未发现明显的稀有密码子，这有利于基因在原核表达系统中的高效表达。对OmpA蛋白的氨基酸序列进行分析，发现其具有典型的外膜蛋白结构特征，N端含有一段信号肽序列，长度约为20个氨基酸，该信号肽在蛋白质的跨膜运输和定位过程中发挥着重要作用，能够引导新生肽链穿过细胞膜，使其正确定位于细菌的外膜。在氨基酸组成中，富含疏水性氨基酸，约占总氨基酸数的40％，这些疏水性氨基酸主要分布在蛋白的跨膜区域，有助于维持蛋白质在细胞膜中的稳定性和结构完整性。同时，还存在多个保守的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基之间可能形成二硫键，进一步稳定蛋白质的空间结构，影响蛋白质的功能。3.2rOmpA表达与产量将重组菌pET-42a-ompA/BL21（DE3）诱导表达后，进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示。在诱导表达前，细菌总蛋白中未出现约42kDa的条带（图1泳道1）；而在诱导表达后，出现了一条明显的约42kDa的特异性条带（图1泳道2），与预期的rOmpA分子量大小一致，这表明rOmpA在大肠杆菌中成功表达。[此处插入SDS-PAGE检测结果图片，图片中泳道1为诱导表达前细菌总蛋白，泳道2为诱导表达后细菌总蛋白，需清晰标注条带位置及对应的蛋白Marker分子量]利用Bio-Rad凝胶图像分析系统对SDS-PAGE凝胶进行扫描分析，测定rOmpA条带的光密度值（OD值），并与凝胶上的蛋白Marker条带进行比较，计算得出rOmpA的表达量约为细菌总蛋白的65％。较高的表达量为后续对rOmpA的免疫学鉴定以及作为疫苗候选抗原的研究提供了充足的蛋白来源，有利于进一步探究其免疫原性和免疫保护作用。3.3免疫学鉴定结果3.3.1抗原性鉴定采用免疫扩散法和微量肥达试验对rOmpA的抗原性进行鉴定。在免疫扩散试验中，当在中央孔加入兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清，周围孔加入不同浓度的rOmpA蛋白溶液后，37℃温育24-48h，结果显示在rOmpA蛋白溶液孔与抗血清孔之间均出现了清晰的沉淀线，这表明rOmpA能够与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清发生特异性免疫反应，具备良好的抗原性。沉淀线的清晰度和强度反映了rOmpA与抗体结合的能力，清晰的沉淀线说明rOmpA与抗体结合能力较强，能够有效地诱导免疫反应。在微量肥达试验中，rOmpA免疫小鼠后的血清对甲型副伤寒杆菌H抗原的凝集效价检测结果表明，rOmpA免疫小鼠血清对甲型副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5-1:40。这说明rOmpA免疫小鼠后，能够诱导小鼠产生针对甲型副伤寒杆菌H抗原的特异性抗体，进一步证明了rOmpA具有抗原性，能够刺激机体的免疫系统产生免疫应答，产生相应的抗体来识别和结合甲型副伤寒杆菌的相关抗原。3.3.2免疫反应性鉴定通过Westernblot对rOmpA的免疫反应性进行鉴定，结果如图2所示。将诱导表达的rOmpA进行SDS-PAGE电泳后转膜至NC膜，依次与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清和羊抗兔IgG-HRP孵育，ECL化学发光试剂显色后，在凝胶成像系统下观察到在约42kDa处出现了特异性条带，与预期的rOmpA分子量大小一致。这表明rOmpA能够与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清发生特异性免疫反应，具有良好的免疫反应性。同时，用rOmpA免疫家兔制备的兔抗血清进行Westernblot检测，也在相同位置出现了特异性条带，进一步证实了rOmpA与兔抗血清之间的特异性结合能力，即rOmpA具有良好的免疫反应性，能够被兔抗血清特异性识别和结合。[此处插入Westernblot检测结果图片，图片需清晰标注条带位置及对应的蛋白Marker分子量，以及实验分组情况]综合免疫扩散法、微量肥达试验和Westernblot的鉴定结果，充分表明rOmpA不仅具有抗原性，能够诱导机体产生免疫应答，还具有良好的免疫反应性，能够与相应的抗血清发生特异性免疫反应，为其作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原提供了重要的免疫学依据。3.4ompA基因携带率采用PCR方法对98株甲型副伤寒杆菌临床菌株的ompA基因携带率进行检测，结果显示，93株菌株出现了预期大小约为1053bp的特异性条带，表明这些菌株携带ompA基因。经计算，ompA基因携带率为94.9%（93/98）。这一结果表明，ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛。如此高的携带率，暗示了ompA基因在甲型副伤寒杆菌中具有重要的生物学功能，可能参与了细菌的生存、致病等关键过程。同时，也为基于ompA基因开发甲型副伤寒杆菌相关疫苗提供了有力的依据，因为高携带率意味着针对ompA基因产物的疫苗更有可能对大多数临床菌株产生免疫保护作用。从地域分布来看，不同地区的甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率未发现明显差异。这进一步说明ompA基因在甲型副伤寒杆菌中的保守性较高，不受地域因素的显著影响，为开发通用型的甲型副伤寒疫苗提供了更有利的条件。3.5免疫保护作用结果小鼠感染模型免疫保护实验结果显示，rOmpA免疫组中，给予100μgrOmpA免疫的小鼠组，在感染甲型副伤寒杆菌50001株后，12只小鼠中有5只存活，免疫保护率为41.7％（5/12）；给予200μgrOmpA免疫的小鼠组，12只小鼠中有7只存活，免疫保护率为58.3％（7/12）。而佐剂对照组和空白对照组的小鼠存活率相对较低，佐剂对照组12只小鼠中仅2只存活，存活率为16.7％（2/12）；空白对照组12只小鼠中仅1只存活，存活率为8.3％（1/12）。通过Log-rank检验对各组小鼠存活率进行统计分析，结果表明rOmpA免疫组小鼠的存活率与佐剂对照组、空白对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这充分说明rOmpA对感染小鼠具有一定的免疫保护作用，能够显著提高小鼠在感染甲型副伤寒杆菌后的存活率，且随着rOmpA免疫剂量的增加，免疫保护率有上升的趋势。rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5-1:40，这表明rOmpA免疫小鼠后产生的抗体能够与副伤寒杆菌H抗原发生特异性反应，进一步支持了rOmpA具有免疫保护作用的结论。四、讨论4.1ompA基因分布的意义本研究通过PCR方法对98株甲型副伤寒杆菌临床菌株进行检测，发现ompA基因携带率高达94.9%，这表明ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中广泛分布。如此高的携带率，暗示了ompA基因在甲型副伤寒杆菌的生存、致病等过程中可能扮演着至关重要的角色。从细菌的生存角度来看，ompA基因编码的OmpA蛋白可能参与了细菌对环境的适应和生存竞争。OmpA蛋白作为细菌外膜的重要组成部分，能够维持外膜的完整性和稳定性，帮助细菌抵御外界环境的压力，如渗透压变化、抗菌物质的攻击等。在面对抗生素时，OmpA可以通过改变外膜的通透性，降低抗生素对细菌的渗透，从而增强细菌的耐药性，使细菌能够在含有抗生素的环境中生存下来。OmpA还可能参与了细菌的群体感应调节，通过与其他细菌表面的OmpA相互作用，实现细菌间的信号传递和信息交流，协调细菌群体的行为，提高细菌在环境中的生存能力。在细菌的致病过程中，OmpA同样发挥着重要作用。OmpA能够帮助细菌黏附到宿主细胞表面，促进细菌的入侵和感染。研究表明，OmpA可以与宿主细胞表面的受体相互识别和结合，介导细菌进入宿主细胞。一旦进入宿主细胞，细菌可以利用宿主细胞的营养物质进行生长和繁殖，逃避宿主免疫系统的识别和清除。OmpA还可能参与了细菌毒力因子的分泌和调控，影响细菌的致病能力。在沙门氏菌中，OmpA与细菌的毒力密切相关，它可以影响细菌在宿主体内的存活、繁殖和扩散能力。当沙门氏菌感染宿主时，OmpA能够帮助细菌逃避宿主免疫系统的识别和清除，促进细菌在宿主体内的定殖和致病。ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中的高携带率，为基于ompA基因开发甲型副伤寒杆菌相关疫苗提供了有力的依据。由于大多数临床菌株都携带ompA基因，针对OmpA蛋白开发的疫苗更有可能对这些菌株产生免疫保护作用。通过激发机体产生针对OmpA蛋白的免疫反应，疫苗可以阻断细菌与宿主细胞的黏附，抑制细菌的入侵和感染，从而达到预防甲型副伤寒的目的。此外，OmpA蛋白的保守性也为开发通用型的甲型副伤寒疫苗提供了有利条件。因为不同菌株的OmpA蛋白在氨基酸序列和结构上具有较高的相似性，基于OmpA蛋白开发的疫苗有望对不同地区、不同来源的甲型副伤寒杆菌菌株提供广泛的保护。4.2rOmpA免疫原性分析本研究通过免疫扩散法、微量肥达试验和Westernblot等免疫学方法对rOmpA进行鉴定，结果充分表明rOmpA具有良好的免疫原性。在免疫扩散试验中，rOmpA与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清之间出现了清晰的沉淀线，这是两者发生特异性免疫反应的直观体现。沉淀线的形成是由于rOmpA作为抗原，与抗血清中的抗体在琼脂糖凝胶中相互扩散，当两者相遇且比例合适时，就会发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物沉淀，从而出现沉淀线。这一结果说明rOmpA能够被兔抗血清中的抗体识别，具备抗原性，能够诱导机体产生免疫应答。微量肥达试验检测出rOmpA免疫小鼠血清对甲型副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5-1:40。凝集效价的存在表明rOmpA免疫小鼠后，小鼠的免疫系统被激活，产生了针对甲型副伤寒杆菌H抗原的特异性抗体。当这些抗体与甲型副伤寒杆菌H抗原相遇时，会发生凝集反应，使细菌聚集在一起。凝集效价越高，说明小鼠体内产生的特异性抗体越多，rOmpA诱导小鼠产生免疫反应的能力越强。在本试验中，虽然凝集效价的范围相对有限，但也足以证明rOmpA能够刺激小鼠产生免疫应答，产生具有一定活性的抗体。Westernblot结果显示，rOmpA能够与兔抗甲型副伤寒杆菌全菌抗血清发生特异性免疫反应，在约42kDa处出现了特异性条带。这一结果进一步证实了rOmpA具有良好的免疫反应性。在Westernblot实验中，蛋白质经过SDS-PAGE电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，然后与特异性抗体孵育。如果蛋白质能够与抗体特异性结合，再经过二抗（羊抗兔IgG-HRP）的识别和ECL化学发光试剂的显色，就会在相应位置出现条带。rOmpA出现的特异性条带，说明它能够被兔抗血清中的抗体特异性识别和结合，再次证明了rOmpA具有免疫原性。rOmpA良好的免疫原性可能与其结构和生物学特性密切相关。从结构上看，rOmpA作为外膜蛋白，其表面可能存在多个抗原表位，这些抗原表位能够被免疫系统识别，从而引发免疫反应。OmpA蛋白的跨膜结构域和周质结构域中可能含有一些独特的氨基酸序列或空间构象，这些结构特征使得rOmpA能够与免疫细胞表面的受体相互作用，激活免疫细胞，启动免疫应答过程。rOmpA在细菌的生存和致病过程中发挥着重要作用，其作为细菌的重要组成部分，在长期的进化过程中，可能已经适应了宿主免疫系统的识别模式，从而能够有效地激发免疫反应。在细菌感染宿主的过程中，rOmpA可能是宿主免疫系统首先接触和识别的抗原之一，因此它具有较强的免疫原性，能够诱导机体产生有效的免疫保护。基于rOmpA良好的免疫原性，使其在作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原方面具有显著优势。由于rOmpA能够诱导机体产生免疫应答，产生特异性抗体和免疫细胞，这些免疫反应产物可以在体内识别和清除甲型副伤寒杆菌，从而起到预防和治疗甲型副伤寒的作用。与传统疫苗相比，以rOmpA为基础的基因工程疫苗具有成分明确、安全性高、易于大规模生产等优点。通过基因工程技术，可以精确地控制rOmpA的表达和制备过程，减少疫苗中的杂质和不良反应。由于rOmpA在甲型副伤寒杆菌临床菌株中广泛分布，针对rOmpA开发的疫苗更有可能对大多数菌株产生免疫保护作用，具有更广泛的应用前景。4.3rOmpA免疫保护作用探讨本研究通过小鼠感染模型，对rOmpA的免疫保护作用进行了初步探究，结果表明rOmpA对感染小鼠具有一定的免疫保护作用。在实验中，给予100μgrOmpA免疫的小鼠组免疫保护率为41.7％，给予200μgrOmpA免疫的小鼠组免疫保护率为58.3％，且rOmpA免疫组小鼠的存活率与佐剂对照组、空白对照组相比，差异具有统计学意义。这说明rOmpA能够激发小鼠的免疫系统，使其产生一定的免疫应答，从而在一定程度上抵抗甲型副伤寒杆菌的感染，降低小鼠的死亡率。rOmpA的免疫保护作用可能是通过多种机制实现的。从体液免疫方面来看，rOmpA免疫小鼠后，能够诱导小鼠产生针对甲型副伤寒杆菌H抗原的特异性抗体，这些抗体可以与细菌表面的抗原结合，阻止细菌黏附到宿主细胞表面，从而抑制细菌的入侵和感染。抗体还可以激活补体系统，通过补体的溶菌作用、调理作用等，增强对细菌的清除能力。在本研究中，rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5-1:40，这表明免疫小鼠产生的抗体能够与副伤寒杆菌H抗原发生特异性反应，进一步支持了体液免疫在rOmpA免疫保护作用中的重要性。从细胞免疫角度分析，rOmpA可能激活了小鼠体内的T淋巴细胞，使其分化为效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞可以直接杀伤被细菌感染的宿主细胞，清除细菌的藏身之所；记忆T细胞则可以在再次遇到相同抗原时，迅速增殖分化，产生更强的免疫应答。rOmpA还可能刺激巨噬细胞等免疫细胞的活性，增强它们对细菌的吞噬和杀伤能力。巨噬细胞可以吞噬和消化入侵的细菌，同时分泌细胞因子，调节免疫反应，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化和增殖。然而，本研究中rOmpA的免疫保护率并非100%，这可能受到多种因素的影响。一方面，rOmpA的免疫剂量可能是一个重要因素。在本研究中，虽然随着rOmpA免疫剂量的增加，免疫保护率有上升的趋势，但可能由于剂量不够高，未能充分激发小鼠的免疫系统，导致免疫保护作用有限。未来的研究可以进一步探索rOmpA的最佳免疫剂量，以提高其免疫保护效果。另一方面，免疫途径和免疫次数也可能对免疫保护作用产生影响。本研究采用皮下注射的免疫途径和两次免疫的程序，后续研究可以尝试不同的免疫途径，如肌肉注射、滴鼻免疫等，以及优化免疫次数和免疫间隔时间，以寻找最适宜的免疫方案。佐剂的选择和使用也可能影响rOmpA的免疫保护效果。不同的佐剂具有不同的免疫调节作用，选择合适的佐剂可以增强rOmpA的免疫原性，提高免疫保护率。未来可以对不同佐剂与rOmpA联合使用的效果进行研究，筛选出最有效的佐剂。rOmpA对甲型副伤寒杆菌感染小鼠具有一定的免疫保护作用，但其免疫保护效果仍有待进一步提高。通过优化免疫剂量、免疫途径、免疫次数以及佐剂等因素，有望增强rOmpA的免疫保护作用，为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗的研发提供更有力的支持。4.4研究的不足与展望本研究在甲型副伤寒杆菌ompA基因的研究方面取得了一定成果，但也存在一些不足之处。在实验设计上，虽然构建了ompA基因原核表达系统并对重组表达产物rOmpA进行了免疫学鉴定，但缺乏对不同表达条件下rOmpA表达量和活性的深入研究。在未来研究中，可以进一步优化表达条件，如改变IPTG诱导浓度、诱导时间、培养温度等，探索rOmpA的最佳表达条件，以提高其表达量和活性。从样本数量来看，本研究仅检测了98株甲型副伤寒杆菌临床菌株的ompA基因携带率，样本数量相对有限，可能无法全面准确地反映ompA基因在所有甲型副伤寒杆菌菌株中的分布情况。后续研究可以扩大样本数量，涵盖更多地区、不同来源的甲型副伤寒杆菌菌株，以更深入地了解ompA基因的分布特征和遗传多样性。在研究深度方面，本研究初步探究了rOmpA的免疫保护作用，但对于其免疫保护机制的研究还不够深入。虽然从体液免疫和细胞免疫角度进行了分析，但仍有许多细节尚未明确，如rOmpA激活免疫细胞的具体信号通路、免疫记忆细胞的产生和维持机制等。未来需要进一步开展相关研究，深入探讨rOmpA的免疫保护机制，为其作为疫苗候选抗原提供更坚实的理论基础。展望未来，基于本研究的成果，可以进一步开展rOmpA作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗的研发工作。一方面，可以对rOmpA进行结构改造和优化，提高其免疫原性和免疫保护效果。例如，通过基因工程技术，在rOmpA的抗原表位区域引入突变，增强其与免疫细胞表面受体的结合能力，从而提高免疫原性。另一方面，可以探索rOmpA与其他抗原或佐剂联合使用的效果，开发多价疫苗或联合疫苗。研究表明，将不同的抗原组合使用，可以激发机体产生更广泛的免疫反应，提高疫苗的保护效果。合适的佐剂可以增强抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果。因此，可以筛选出与rOmpA具有协同作用的佐剂，如铝佐剂、脂质体佐剂等，联合使用以增强rOmpA的免疫保护作用。还可以开展rOmpA疫苗的临床试验，评估其在人体中的安全性和有效性。在临床试验中，需要严格遵循伦理原则和临床试验规范，招募足够数量的志愿者，进行多中心、随机、双盲对照试验，以确保试验结果的可靠性和科学性。通过临床试验，可以进一步验证rOmpA疫苗的预防效果，为其最终应用于临床提供有力的证据。五、结论5.1研究成果总结本研究成功构建了甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统，并对其进行了一系列深入研究。通过PCR技术从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增出ompA基因，经T-A克隆和测序，证实所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列与报道序列的相似性均为100％，确保了基因的准确性。将ompA基因构建到原核表达载体pET-42a中，转化大肠杆菌BL21（DE3）后成功诱导表达出rOmpA。SDS-PAGE分析和产量计算结果表明，rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65％，为后续研究提供了充足的蛋白来源。通过免疫扩散法、微量肥达试验和Westernblot等免疫学方法鉴定rOmpA，结果显示rOmpA能与其