高三生物二轮复习课件PCR

2026高考二轮复习PCR技术

利用PCR获取和扩增目的基因概念：PCR是__________________的缩写，它是一项根据___________________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对_________________________进行大量复制的技术。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因①原理：②操作环境：③优点：DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）可以在短时间内大量扩增目的基因的核苷酸序列PCR扩增仪（2）体外PCR的条件：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)提供原料与能量激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTPPCR技术所需的基本条件参与的组分在PCR中的作用高温模板DNA4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物一定的缓冲溶液(Mg2＋)打开DNA双链含目的基因的双链DNA片段(已知基因的部分核苷酸序列)合成DNA子链的原料Taq酶

催化合成DNA子链2种

使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所引物酶温度结果联系解旋酶催化，边解旋边复制高温变性解旋，全部解旋后再复制主要在细胞核内细胞外(在PCR扩增仪内)RNA通常是DNA解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内温和条件在不同温度(较高)下进行合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）②酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链（3）PCR过程第一步：加热至90℃以上，

；第二步：冷却至

，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至72℃左右，热稳定

(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。DNA解链为单链50℃左右DNA聚合酶905072℃延伸905072℃变性905072℃复性全解旋再复制过程905072℃变性3`5`5`3`长度相同但C-G含量高的DNA需要设定的变性温度较高905072℃复性引物与模板链哪端结合？3`5`5`3`3`用PCR扩增下面的DNA片段：5′--GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG--3′3′--CTGGACACCTTCG…….GTATGCCCTAAC--′5

供选择的引物有①5′GACCTGTGGAAGC3′②5′CTGGACACCTTCG3′③5′GTTAGGGCATAC3′④5′CAATCCCGTATG3′

共四种，你觉得应选择()A.①②B.②③ C.③④ D.①④D引物的选择：905072℃延伸DNA聚合酶与引物的____端结合?DNA聚合酶的延伸（子链）方向是________？11思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：①子代DNA分子数为：___个②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个③子代含有的目的基因数目：_____个，含有不等长的DNA分子______④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个⑤复制过程中共需引物_______个⑥第n次复制需要引物___个2n22n-12n＋1-22n2n-2n（4）PCR扩增DNA规律2nPCR技术拓展应用M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因2.检测目的基因是否转录出了mRNABt基因在抗虫棉中的表达从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳应用1:检测受体细胞中是否存在目的基因以及目的基因是否转录思考:用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。总mRNA杂交双链单链DNA双链cDNA逆转录酶核酸酶HDNA聚合酶RNA链

DNA链

mRNA取自什么细胞

应用2：反向PCR测定未知DNA区域1．反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5’-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是（

）A.I酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端B.II连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键C.设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’”D.对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'”C1.如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是跟踪训练A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序B.用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序C.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序D.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序√应用3：PCR定点突变技术该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。

重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。下列说法错误的是A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物B利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引

物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互

补的碱基C.①过程需要先加热至90℃以上后再冷却

至50℃左右D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变

产物ADD重叠延伸PCR技术：大引物PCR：应用4：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR)先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA

转化为cDNAB.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延

伸3个阶段C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高D.若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性C应用5：引入酶切位点大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下（图中a链和b链分别是相应基因转录模板链，mRNA分子的合成方向是5′→3′）。分析回答：（1）过程①中，PCR扩增sGFP的原理是

，该过程除需要根据

设计特异性引物序列外，为保证sGFP正确插入到质粒中，还需要在引物的5′端添加

限制酶识别序列，图中b链的黏性末端碱基序列（5′→3′）为

。DNA半保留复制已知sGFP基因的一段核苷酸（或碱基）序列HindⅢ、BamHⅠAGCT-科学家在利用农杆菌转化法把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图1中选择的引物组合是

。

应用6：选择特定引物，进行基因定位Ⅱ，Ⅲ练习4.

为研究水稻

D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中（图3），致使该基因失活，失活后的基因记为d。为验证F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图4所示。随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。如果_______________，则相应植株的基因型为_____________；如果_______________，则相应植株的基因型为______________。引物Ⅰ引物Ⅲ引物Ⅱ知识：PCR产物主要为两种引物为之间的DNA片段引物“Ⅰ+Ⅲ”只能扩增d基因引物“Ⅱ+Ⅲ”只能扩增D基因如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。如果

_______________，则相应植株的基因型为________；如果______________

_，则相应植株的基因型为______________。Dd引物“Ⅰ+Ⅲ”能扩增，引物“Ⅱ+Ⅲ”不能扩增dd引物“Ⅰ+Ⅲ”不能扩增，引物“Ⅱ+Ⅲ”能扩增DD应用7：设计引物序列，实现不同DNA的拼接为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。A.ATGGTG------CAACCAB.TGGTTG------CACCATC.GACGAG------CTGCAGD.CTGCAG------CTCGTC’

问题情境5：

为研究基因A与四膜虫对DDT的耐药性是否有关，科研人员提取耐药四膜虫个体的DNA，用下图所示的引物组合，分别扩增A基因的A1片段、A3片段。

将大量N基因片段与扩增得