植物组织培养绪论

植物组织培养学主讲教师：范翠丽教材教材：《植物组织培养》，王蒂主编，中国农业出版社参考教材（1）吴殿星,胡繁荣主编.植物组织培养（第二版）.上海:上海交通大学出版社,2009（2）刘振祥,廖旭辉主编.植物组织培养技术.北京:化学工业出版社,2008（3）吕晋慧,孔冬梅主编.园艺植物组织培养.北京:中国农业科学与技术出版社,2008（4）王家福主编.花卉组织培养与快繁技术.北京:中国林业出版社,2006参考网站绪论1植物组织培养的基本概念1.1植物组织培养的概念植物组织培养（planttissueculture）：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养（plantcultureinvitro）。广义：对植物的器官、组织、细胞及原生质体进行离体培养的技术。狭义：对植物的组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织（callus）进行离体培养的技术。无菌（asepsis)：是指培养器皿、器械、培养基和培养材料等无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养皿中正常生长和发育。人工控制的环境条件：对光照、温度、湿度、气体等进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长发育。离体生态学（invitroecology）：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件。外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞。愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。1.2植物组织培养的特点：主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。(1)组培技术是无菌操作技术。(2)组培材料处于完全的异养状态。(3)组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。(4)组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根。(5)组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。(6)组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调。世界上首只克隆羊多利被执行“安乐死”克隆技术大事记

1938年：德国科学家首次提出克隆设想1952年：科学家开始用青蛙进行克隆实验1970年：克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪，但是在开始进食以后死亡1981年：科学家进行克隆鼠实验，据称用鼠胚胎细胞培育出了正常的鼠。1984年：第一只胚胎克隆羊诞生。

1997年2月24日：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。1998年2月23日：英国PPL医疗公司宣布，该公司克隆出一头牛犊“杰弗逊先生”。1998年7月5日：日本科学家宣布，他们利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。1998年7月22日：科学家采用一种新克隆技术，用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠，这是人类第一次用克隆动物克隆出克隆动物。1999年5月31日：美国夏威夷大学的科学家，利用成年体细胞克隆出第一只雄性老鼠。1999年6月17日：以美藉华人科学家杨向中为首的研究小组利用一头13岁高龄的母牛耳朵上取出的细胞克隆出小牛。2000年1月3日：美国著名华人杨向东，用体外长期培养后的公牛耳皮细胞成功克隆出6头牛犊。2000年1月：美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名“泰特拉”。2000年3月14日：曾参与克隆小羊“多利”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。

人耳的克隆从患者肋骨中提取软骨细胞，再在实验室里培养软骨细胞至微小球状体，之后将球状软骨细胞移入折成耳朵形状的塑料支架，让细胞在支架上繁殖生长，经过体外培养后植入裸鼠背部。随后，人耳支架降解消失，而老鼠背上就会长出人耳。不过支架降解消失的过程需要2个月的培养，长出来的耳朵尺寸是2英寸。1.3植物组织培养的研究类型和任务1.3.1研究类型：1.3.1.1组织培养：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。1.3.1.2器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子。1.3.1.3胚胎培养：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。1.3.1.4细胞培养：单细胞或较小细胞团，如性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。1.3.1.5原生质体培养1.3.1研究任务：研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等。从而改良植物品种，创造新的植物种类，为人类造福。2、植物组织培养的形成与发展植物组织培养的研究历史可以追溯到19世纪中期，其开拓和发展的理论基础是植物细胞的全能性，即植物每个有核细胞具有母体全部基因，在离体培养下，都有分化、发育成完整植株的潜在能力。该研究领域的发展历史可分为开创、奠基和建立三个阶段。2植物组织培养的形成与发展

开创阶段（上世纪初－上世纪30年代末）Schleiden和Schwann植物组织培养的理论基础源于德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说：一切生物都是由细胞构成，细胞是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞分裂而来。Haberlandt德国植物学家Haberlandt被公认为是植物组织培养之父，他于1902年发表的植物组织培养的第一篇论文：提出了植物细胞具有全能性，构思了细胞培养的概念。Haberlandt选择了栅栏组织细胞、髓部细胞、雄蕊绒毛以及气孔保卫细胞进行实验，将这些细胞培养在有机物丰富并含有葡萄糖的Knop培养液中，在无菌条件下进行培养。细胞没有分裂，但存活了几个星期并有生长。1）实验材料高度分化。Haberlandt没有意识到，由于可进行光合作用的细胞相应地已经分化了，它们的分生组织潜能不容易表达。2）培养基过于简单。Haberlandt不知道细胞脱分化成为分生组织状态需要刺激物质，植物生长调节剂当时还未发现。KotteandRobbins1922年，植物离体组织培养取得了一些进展。德国人Kotte和美国人Robbins两人同时分别独立地将分生组织作为外植体。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖，将它们放在含有Knop溶液盐成分、葡萄糖、含氮化合物如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各种营养液中。Kotte观察到根尖生长持续了2周，但他没有进行继代培养。另一方面Robbins通过继代，将玉米根尖离体培养了更长的时间，但随着时间延长，生长量减少，最后消失。Hanning、Knudson和Laibach1904年，Hanning在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行了培养，发现离体胚可以充分发育成熟，并提早萌发形成小苗。1922年，Knudson采用胚培养法获得了大量的兰花幼苗。1925年，Laibach培养亚麻种间杂交幼胚获得成功，证明了胚培养在植物远源杂交中利用的可能性。在植物组织培养研究的开创时期，由于影响植物组织和细胞增殖及形态发生能力的因素尚不清楚，培养材料的选择十分重要，在30多年的探索实验中，植物组织培养几乎没有大的进展。2植物组织培养的形成与发展奠基阶段

（上世纪30年代－上世纪50年代末）20世纪30-50年代，影响离体培养材料生长和发育的一些物质，如天然提取物、B族维生素、生长素、细胞分裂素等的发现，促使植物组织培养的研究迅速发展，特别是分裂素与生长素的比例控制器官分化的激素模式的建立，使植物细胞培养的技术与理论体系得以形成。李继侗和沈同1933年，他们首次报道了利用天然提取物成功进行植物组织培养的研究。利用加有银杏胚乳提取物的培养基，成功培养了银杏的胚。White、GautheretandNobecourt1934年，美国植物生理学家White用添加了酵母提取物（YE）的培养基进行了番茄根的离体培养，建立了第一个活跃生长并能继代增殖的无性繁殖系，从而使非胚器官培养首次获得成功。同年，法国学者Gautheret在添加了YE和水解酪蛋白（CH）的固体培养基上，使山毛榉和欧洲黑杨的形成层培养物连续增殖了几个月，这是固体培养基在植物组织培养上的首次成功应用。1937年，White又发现酵母提取物的作用可以被B-族维生素（硫胺素，VB6，烟酸）所取代，建立了第一个由已知化合物组成的培养基。1939年，White建立了连续生长的烟草杂种培养物。同时期，Gautheret在山毛榉和胡萝卜形成层、Nobecourt在胡萝卜根和马铃薯块茎上也建立了连续生长的培养物。WhiteWhiteGautheretGautheretNobecourtNobecourt

White和Gautheret获得的愈伤组织，由含有大液泡的薄壁组织组成。White和Gautheret获得的愈伤组织，由含有大液泡的薄壁组织组成。Skoog和Miller1954年，Skoog于做了一个著名的实验。在烟草愈伤组织培养中用了变质的鲱鱼精子DNA，发现它可促使愈伤组织加快生长。有效成分存在于变质的DNA样品或者经高压灭菌后的新鲜样品中，他指出有效成分是降解的DNA产物。1955年，他把这种物质命名为激动素（KT）。1956年，Miller首次从鲱鱼精子中分离出激动素。Skoog

Skoog和Miller的烟草髓部愈伤组织培养实验1957年，Skoog和Miller提出激素控制器官形成的观点。在这篇著名的论文中，他们提到在烟草髓部愈伤组织培养中，根和芽的分化由生长素和细胞分裂素的比率决定，并且器官分化可以通过改变培养基中两种激素的浓度进行调节。高浓度的生长素诱导生根，而高浓度的细胞分裂素促进芽的形成。两者浓度相当时则倾向于未分化样式的生长。这一对激素调节器官分化的观点现在已在大多数植物种类中被证实。Muir、Steward和Reinert1953年，Muir利用往复式摇床的振荡，在液体培养基中进行了万寿菊和烟草愈伤组织的培养，获得了单细胞或密集细胞的悬浮液，并可继代增殖。这既是培养方法上的突破，也是Haberlandt培养单细胞设想的实现。1958年，英国学者Steward和Reinert几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养液中诱导出胚状体，并长成完整植株。证实了Haberlandt的细胞全能性理论。

建立和发展阶段（上世纪60年代至今）从植物细胞全能性理论的提出到其被实验科学地证实，植物组织培养研究领域走过了近60年的发展历程。当影响植物细胞分裂和器官形成的机理被揭示后，学者们对该领域进行了全面研究，获得的成果枝繁叶茂，发表的文章浩如烟海，形成了一套成熟的植物组织培养的理论体系和技术方法，拥有着极其广泛的应用领域，从而在生物科学中建成了这门具有理论、技术和应用的科学。

Thimann和Wickson1958年，他们发现腋芽（当顶芽存在时为休眠状态）的生长，可以通过外源细胞分裂素的应用而启动。这样，将茎段培养在含有细胞分裂素的培养基上，就可以在一个具有完整顶芽的生长中的茎上诱导侧芽的形成。这将消除顶端优势，得到大量不定芽。ThimannMorel－脱毒、快繁商业化

1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virusfree）技术，通过分离已被病毒感染的大丽花个体的根尖，并将其离体培养，重新获得了无病毒的大丽花。

1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖（rapidclonepropagation）的两个目的。这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。MurashingeMurashinge发展了一套标准的离体繁殖方法，将这一技术广泛普及。与Skoog一起筛选出至今仍被广泛应用的MS培养基。MorelGuha和Maheshwari等——花药培养1964-1966年，印度学者Guha和Maheshwari成功地由曼陀罗花药培养获得单倍体植株，开创了花粉培育单倍体的新途径。1973年，Nitsch采用花药预培养方法获得了烟草花粉植株的纯合二倍体。1974年，Sunderland建立了散落花粉系列培养法。1982年，Ghandimathi和Imamura直接分离花粉进行培养成功，建立了一个适于深入研究雄核发育的实验体系。MaheshwariNitschNitsch发展了培养烟草和曼陀罗小孢子的技术、单倍体染色体加倍的技术，并且在5个月之内收集到二倍体纯合子的种子（Nitsch,1974,1977）。

Cocking等-原生质体培养1960年，英国学者Cocking首次用酶解方法获得了原生质体，开创了植物原生质体培养的研究。1971年，日本学者Nagata和Takebe首次将烟草叶肉原生质体培养出再生植株。1985年，Fujimura获得首例禾谷类——水稻的原生质体培养的再生植株。1986年，Spangenberg获得了甘蓝型油菜的原生质体培养的再生植株。CockingCarlson等——原生质体融合1972年，Carlson利用硝酸钠进行了烟草种间原生质体的融合实验，获得了首株体细胞种间杂种植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（PEG）进行了大豆和烟草科间原生质体的融合，获得了3％的异质体。同年，Bonne和Eriksson利用PEG成功进行了具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体的融合。1978年，Melchers获得了首个属间杂种植株（马铃薯番茄）。1981年，Zimmerman提出了原生质体融合的新方法——电融合。Melchers植物遗传操作成功的前景引起了大众的兴趣。Melchers和他的同事（1978年）通过将马铃薯和番茄原生质体融合，允许遗传信息在两个不同的有机体中移动，获得了一个杂种植物。这一方法提供了获得亲缘相近但生殖隔离的种间杂种的机会。Kaul等——次生代谢物生产1969年，Kaul发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基。1973年，Furuya和Ishii发现人参培养细胞可以产生人参皂苷。Nickell组织培养的先驱，尤其是在培养中次生代谢物质的生产方面。

Street－培养设施化Street和他的助手开创了各种细胞悬浮培养的程序（恒化器和恒浊器）。1.3植物组织培养的应用及展望快繁和脱毒育种次生代谢物生产种质保存在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用一、植物离体快繁植物离体快繁是植物组织培养在生产上应用最广泛、经济效益较大。特点：繁殖系数大、速度快，苗木整齐一致，周年生产。一个单株一年繁殖几万到几百万个植株。葡萄：3万，兰花：400万，草莓：108。对于一些繁殖系数低，不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”品种、脱毒苗、优良单株、濒危植物和基因工程植株等的繁殖。目前园艺作物及经济林木等部分或大部分都用离体快繁提供苗木。美国Wyford国际公司年产花卉、蔬菜、果树及林木的组培苗3000万株。以色列Benzur苗圃年产观赏植物组培苗800万株。我国工厂化生产的组培苗有：香蕉、甘蔗、桉树、葡萄、苹果、脱毒草莓、脱毒马铃薯、非洲菊、芦荟。二、脱毒苗木培育很多作物特别是无性繁殖作物都带有病毒，影响产量和质量，对生产造成极大损失。草莓主要病毒有4种，大蒜和马铃薯的病毒有10多种。感病植株并非每个部位都带有病毒，生长点附近的病毒浓度很低甚至无毒。利用茎尖组培，再生植株就可脱毒，获得脱毒苗。应用：水果（甘蔗、菠萝、香蕉、葡萄、草莓等）、蔬菜（马铃薯、大蒜、洋葱等）、花卉（兰花、菊花、唐菖蒲等）等。茎尖培养用于脱毒茎尖培养用于脱毒茎尖培养用于脱毒二、培育新品种或创制新物种培育远源杂种离体选择突变体单倍体育种培育远缘杂种通过胚培养可克服受精后障碍导致的远源杂交不孕，产生远源杂交后代，育成新物种。已育成苹果和梨、大白菜和甘蓝、栽培棉和野生棉等杂交种。通过原生质体融合可克服有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种。已获得马铃薯和番茄、烟草和龙葵等属间杂种，但尚无实际应用价值。典型的原生质体烟草原生质体Aechmeafasciata(X400)蜻蜓凤梨Ti导入的原生质体原生质体远缘杂交离体选择突变体培养的细胞无论是愈伤组织还是悬浮培养细胞，由于处于分裂状态，易受培养条件和诱变因素（射线、化学物质等）的影响产生变异，从中可以筛选出对人类有用的突变体，从而育成新品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时，由于处理细胞数远远多于处理个数，因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来，如植物抗病虫性、耐盐、抗除草剂毒性、生理生化变异等的诱发，为进一步选育提供了丰富的变异材料。目前，用这种方法已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产。体细胞变异突变体筛选单倍体育种手段：花药和花粉培养优点：所有基因均能表现，基因型可快速纯合。成果：已育成大面积种植的品种。1974年我国育成第一个新品种——烟草单育1号，此后还育出水稻中花8号、小麦京花1号和大量花培新品系。四、次生代谢物生产利用组织和细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。已从200多种植物的培养组织或细胞中获得了500多种有效代谢化合物，包括一些重要药物。如人参皂苷、喜树碱、降压灵等。粗人参皂苷含量在愈伤组织为21.4%，冠瘿组织为19.3%，再分化根为27.4%，都高于天然人参根的含量（4.1%）。特别适于天然植物蕴藏量少、含量低、临床效用高的成分，如紫杉醇等。Scale-upofCatharanthusroseus长春花cell

culturesina20litreair

紫草发酵罐培养五、植物种质资源的离体保存种植资源是农业生产的基础，而自然灾害、生物间竞争及人类活动等已造成相当数量的植物物种消失或正在消失，特别是具有独特遗传性状的生物物种的绝迹更是一种不可挽回的损失。但常规的植物种植资源保存方法耗费人力、物力和土地，使种质资源流失的情况时有发生。1975年，Henshaw和Morel首次提出了离体保存植物种质的策略。优点：节约人力、物力和土地，防止有害病虫的传播，便于种质资源的交换和转移。已有多种植物保存。如草莓茎培养物可