肿瘤突变负荷(TMB)检测与临床应用的专家共识完整版

基于免疫检查点抑制剂(ICIs)的免疫治疗显著改善了晚期恶性肿瘤患者的致ICI单药治疗的整体缓解率低于20%,且常伴有免疫相关不良事件。因此，迫切需要识别准确可靠的生物标志物，念源于2013年发表在《自然》杂志上的一项研究，该研究检测了30种癌症类型的7000多例标本。该研究通过全基因组测序(WGS)和全外显子变数量。2015年，《科学》杂志发表了首个探索TMB与非小细胞肺癌了TMB在ICI治疗中的预测作用。2017年，《基因组医学》发表了一项涉及10万例实体瘤患者的研究，探索了靶向捕获测序panel与WES结果在TMB检测中的相关性，并证实了panel检测TMB的可行性和可靠性。2019年中国临床肿瘤学会指南和国家综合癌症网络晚期肺癌分子病TMB为生物标志物获批的抗肿瘤药物。然而，临为促进对TMB检测及其临床应用的统一理解和规范化，华东地区肺癌组瘤领域的特点和实践，制定了本TMB临床应用专家共识，并共同制定了生物信息学分析方法、阈值设定以及TMB检测的临床意义。此外，专家组就肿瘤免疫治疗中包括TMB在内的各种疗效预测生物标志物的选择提供了意见。推荐等级采用ECLUNG共识/指南制定原则和方法。映肿瘤产生新抗原的能力。当肿瘤细胞发生体细胞非同义突变生新抗原并被机体免疫系统识别，从而触发免疫应答。TMB-H通常表明肿瘤细胞携带大量体细胞非同义突变，因此可能产生癌症特异性新抗原。这些新抗原经过加工并加载到主要组织相容性负荷或TMB有望成为指导ICI治疗决策的重要临床生物标志物。越来越样本，可能产生不同的TMB检测结果。样本质量差，共识4:当使用靶向测序panel进行TMB评估时，建议评估其与WES在临床实践中，组织TMB(tTMB)检测被广泛使用，而血液TMB(bTMB)检测的准确性需要进一步验证。因此，本共识识建立TMB样本采集和处理原则。常用的标本类型。建议使用10%中性福尔马林固定液处理FFPE组织。固定液体积应大于样本组织体积的10倍。手术标本的最佳固定时间约为24小时，穿刺活检标本为12小时。对于TMB评估，建议使用3年内的近期组织块，最好1年内，或6-8周内制备的石蜡切片，切片厚度为4-5组织标本应包含至少200个活肿瘤细胞，或10%的肿瘤，以确保有足够准的TMB检测要求肿瘤细胞比例至少为20%。大多数TMB检测需要正常对照以提供和过滤胚系变异信息。正常组织或外周血可作为对照。如果使用外周血样本作为对照，应采集2-5mLEDTA抗凝外周血。采集后，应将样本轻轻颠倒混匀8-建议将标本在4°C低温下运送至检测实验室，并在2小时内处理，以避免溶血。如果无法在2小时内处理，或需要长途运输，建议在专用无细胞DNA采集管中室温储存或运输样本。(d)病灶选择：原发肿瘤病灶和远处转移病灶组织均可用于TMB评估。鉴著的瘤内基因突变异质性，从而可能导致TMB值的大幅变化。目前尚无专门研究探索TMB样本的异质性及其与临床结局的相关性。因此，建议优先使用原发肿瘤病灶组织和远处转移病灶组织进行TMB检测。在TMB检测中，核酸提取是关键步骤。建议使用NMPA批准的或经实验化程度。肿瘤组织DNA文库的质量至关重要。浓度不足，特别是低于生物分析仪评估核酸片段化程度。大型panel基因检测进行TMB检测所需的核酸量为20-200ng,具体取决于测序方法。对于基于WES的TMB检测，建议核酸量至少为250ng。明确核酸要求有助于确保检测的准确性TMB检测对于评估肿瘤免疫治疗疗效很重要。目子区域进行测序，因此能准确反映TMB,被视为金标准。然而，复杂性和成本限制了WES在常规临床中的广泛应用。靶向panel测序聚焦于全面的肿瘤相关基因集，结合生物信息学算法异。多项研究证实，靶向panel测序结果与WES结果具有高度一致性；靶向测序panel的大小是影响TMB评估中多个关键指标的重要因素，包覆盖不同的基因组区域，因此导致TMB值的变究所构建了大型(300基因)、中型(48基因)和小型(15基因)panel,发现小型panel是总体突变负荷的不良预测因子，而大型panel能成功重现WES突变负荷。一些研究机构使用随机突变模型模拟真实世界癌症基因组中的非随机突变和公共数据库中的瘤内异质性，发现靶向测序估的TMB变异系数(CV)与panel大小的平方根和TMB的平方根成反比。当肿瘤TMB阈值设定为每兆碱基10个突覆盖度降低而增加(从4Mb到2Mb、1Mb、0.5Mb和0.25Mb别为22%、26%、32%、45%和63%)。当panel大小小于0.5Mb时，对可能从免疫治疗中获益的患者的有效识别。为研究所选基因对TMBCV的影响，德国、英国和瑞士的研究人员模拟了3个panel:panelA包含癌基因和抑癌基因；panelB由随机选择的基因组成；panelC排除癌基的TMB方差比随机突变模型高6%,panelA高15%。因此，panel设计应覆盖广泛的遗传元件，不应局限于癌基因协会发起的基因组学证据肿瘤信息交换项目分析了约19,000例癌症患者的真实世界TMB数据。当TMB为0-5mut/Mb时，约三分之二的样本无法通过小型panel准确评估。因此，需要大于1.0Mb的panel大小才能准确评估TMB。吉林省肿瘤医院程实验室评估了覆盖超过1.0Mb的panel,并使用其OncoTOP算法在18种癌症类型的2,864例样本中验证了TMB计算的98.7%一致性。中山大学张团队的研究发现，基于大型panel的TMB评估结果与WESTMB检测结果高度一致(Spearman测ICI治疗的反应(PFSHR=0.45/0.43)。在对3个FD因此，建议用于TMB评估的靶向测序panel的理想覆盖度为1.0至标准测序深度通常为100×,在此深度下可以可靠检测频率大于15%的等位基因突变，从而确保TMB评估的准确性。相比之下，panel可以实频变异的能力，建议靶向测序组合的测序深度至少为200×。FDA批准的MSK-IMPACT测序panel的平均覆盖深度为200×。2019年，欧洲大于200×。中国研究团队表明，在500×测序深度下，panel检测与靶向panel在成本效益方面优于WES,具有更低的成本、更高的测序深接近panel水平来节省成本。择中的成本效益低于PD-L1检测。要使WGS-TMB达到与PD-L1检测相当的成本效益，需要测序成本降低≥24%或提高TMB对免疫治疗反应的预测价值。联合TMB-PD-L1检测需要测序和药物成本降低40%-50%,决策树模型倾向于选择PD-L1而非TMB/不检测；基于组织的TMB是从测序平台生成原始数据到完成体细胞突变检测，数据通常经历4个关键量、比对率、平均测序深度和目标区域均一性标准，以确保这些问题不干扰TMB检测。具体而言，这些标准包括数据可用性>99%、错误率<0.1%、Q20评分>90%、Q30评分>85%、GC含量42-55%、比对率>95%。PCR重复)并校正数据质量，对于生成适合变异识别的高质量BAM文件步骤包括：使用FastQC对原始测序数据(FASTQ)进行质量控制，评估Phred质量分数分布、GC含量和接头污染率等指标，结合MultiQC进行多样本质量报告汇总并定义阈值(如平均Phred评分≥20);通过Trimmomatic或Cutadapt进行序列修剪和过滤，去除接头序列，修剪低质量末端(如LEADING:3或TRAILING:3),并过滤短读段(如长度<36bp)以降低比对噪声；使用BWA-MEM(用于WES)等工具比对到参考SAM文件；使用SAMtools将SAM转换为BAM格式(减少存储),并按染色体位置排序以便后续步骤；通过Picard的MarkDuplicates标记PCR重复，避免重复计数导致的变异识别偏差；使用GATK的BaseRecalibrator结合已知变异数据库(如dbSNP或1000Genomes)进行碱基质量分数重校准(BQSR),校正测序仪固有的碱基质量偏差，从而产生重校准的BAM文件；使用Qualimap或GATK的CollectHsMet于WES)进行后预处理质量验证，评估关键指标(如比对率≥95%、重复率<10%、平均覆盖深度符合实验设计),以确保适合变异识别。此外，我们讨论了可重复性的标准化原则，包括选择工具版本(如GATK4.2.6或vs正常组织),推荐使用工作流管理工具(如Snakemake或Nextflow)实确的检测结果。而且，检测速度比传统软件快4-8倍，为加速NGS在临基于panel的TMB检测通过计算panel覆盖外显子中体细胞突变数除以panel外显子覆盖面积来进行。然而，计算的TMB值与WES检测获得的TMB值之间存在差异。肿瘤纯度是TMB值计算中不可忽视的因素。低。通过肿瘤纯度校正参数校正TMB值，能更好地区分ICI治疗患者的疗效。一般而言，肿瘤细胞纯度不应低于20%。当肿瘤细胞纯度较低时，因频率<1%),都应从TMB计算中排除，以避免高估TMB值。因此，通例如，在4种FDA批准的肿瘤TMB检测方法中，MSK-Impact、OmicsCore和PGDxelio的TMBpanel,通常借助人群数据库进行过滤，如基因组聚合数估计的不准确。程团队发表的OncoTOP算法解决了传统基于配对样本的计算。而且，该算法完全基于中国人群数据库在基于TCGA数据库的27种肿瘤类型的WES分析中，不同肿瘤类型的中位非同义突变频率差异显著,超过1000倍。儿童肿瘤的TMB较低，约为0.1mut/Mb,而一些恶性黑色素瘤和NSCLC患者的TMB超过在恶性黑色素瘤和肺癌中，患者间的TMB值范围为0.1至100mut/Mb,一项基于10,000例泛癌队列的DNA靶向测序研究也产生了类似结果。中国团队在18种癌症类型的2,864例样本中也发现了类似结果，不同癌症类型的TMB分布存在差异。不同癌症类型的中位TMB及其范围差异显著。固定的TMB阈值可能在固有TMB水平较高的癌症类型中捕获更高比例的TMB-H患者，但在TMB水平较低的癌症类型中捕获的TMB-H患者比例较低。因此，应对所有癌症类型应用统一的筛选策略。具体而言，排名前20%的病例被定义为TMB-H组。然而，不同癌症类型中识别的TMB-H阈值差异很大，从4.4到52.2mut/Mb不等。因此，建立癌症类型特异性的TMB-H定义TMB-H阈值的分类不应仅基于人群分布，该分类能否正确指示免疫治疗疗效是关键标准。Budczies等人使用TCGA数据库的WESTMB结果作为参考标准，将TMB的临界值设定为199mut/Mb。相应地，为肺腺癌10%-12%的人群和肺鳞状细胞癌(LUSC)17%-19%的人群定义了基于panel的TMB阈值。回顾性FIR、BIRCH和POPLAR研究最初使用基于基因组DNA靶向测序的FoundationOneLDT方法，阈值为9.9mut/Mb或人群前75%。这些阈值部分区分了从ICI治疗中获益的人群。然而，使用平行验证的FoundationOneCDx检测的两项前瞻性临床研究CheckMate568和CheckMate227确定10mut/Mb为预测TMB>10mut/Mb的肺癌患者比TMB≤10mut/Mb的患者从ICI治疗者具有最高的ICI治疗获益率，林团队发现TMB超过8mut/Mb的胃癌的临床疗效是确定TMB阈值的最佳标准。测实验室和公司已开发了TMB检测解决方案。国际认可的商业panel包括TEMPUS(648基因，2.4Mb基因组覆盖度)、GuardantOMNI(550基因，2.2Mb基因组覆盖度)、CarisSureSelectXT(592基因，1.6Mb基因组覆盖度)和F1CDx(324基因，1.1Mb基因组覆盖度),以及机构验基因组覆盖度)和Dana-Farber癌症研究所的OncoPanel(447基因，基因组覆盖度)和世和基因(425基因，1.26Mb基因组覆盖度)。值得注意阴性非鳞NSCLC患者福尔马林固定组织样本的TMB检测。然而，不同实验和生物信息学方法的TMB定义存在显著差异(表1)。例如，F1CDx将同义突变和短内含子插入缺失纳入TMB计算，而其他算法通常排除这的新开放阅读框；因此，内含子区域分析和插入缺失纳入可能潜在提高平台使用配对血液测序消除胚系变异，仅关注约500个癌症相关基因的体Table2ConsensustemplaPatientinformation,inctestinghistory,familymeSampletype,adequacy,andqualitymAllelefrequency,readdepth,andgermlinReferencegenomeandmatchednormMutationspermegabase(mut/Mb)andpanHigh/lowcut-offandclinicaQCmetricsandvaliActionablemutations,MSIstatus,andothTMBassessmentregardingmutat从免疫治疗中获益的TMB阈值因癌症类型而异。例如，在阿替利珠单抗治疗膀胱癌的IMvigor210临床研究中，FoundationOne产品检测的TMB阈值为≥16mut/Mb。在NSCLC治疗的BIRCH/FIR临床研究中，FoundationOne产品检测的一线患者TMB阈值为≥13.5mut/Mb,二线患者为≥17.1mut/Mb。POPLAR临床研究的TMB阈值为≥15.8mut/Mb。在纳武利尤单抗联合伊匹木单抗治疗NSCLC患者的CheckMate012研究、小细胞肺癌(SCLC)的CheckMate0性黑色素瘤的CheckMate038研307mut/Mb、≥248mut/Mb和≥100mut/Mb。因此，作为预测ICI疗效的生物标志物，不同药物伴随诊断产品的TMB阈值参考价值相对有限。不应使用统一的TMB阈值评估不同ICI对患者的治疗效果。多项研究已充分证实TMB是实体瘤ICI治疗疗效的预测生物标志物。2014年，Snyder等人首次报道TMB是黑色素瘤ICI的潜在生物标志物。在评估纳武利尤单抗联合伊匹木单抗治疗转移性NSCLC疗效的CheckMate568研究中，较高的肿瘤tTMB(≥10mut/Mb)与较高的ORR(44%vs.12.0%)和更长的PFS(7.1vs.2.6个月)相关。在前瞻性CheckMate227研究中，TMB-H(≥10mut/Mb)NSCLC著长于TMB-L患者(7.2vs.5.5个月；OR0.58;95%CIO.41至0.81;P<0.001),且独立于PD-L1表达水平。然而，TMB指导的单克隆抗体疗效有限，因为纳武利尤单抗单药治疗在TMB-H患者中显示出改善结局的趋势，而在TMB-L患者中未观察到显著获益。在LUSC(一种基因组特征标志物。在CheckMate227亚组分析中，纳武利尤单抗加伊匹木单抗与化疗相比，显著延长了TMB-H(≥10mut/mb)患者的PFS,包括LUSC患者。CheckMate9LA研究证实，纳武利尤单抗加伊匹木单抗和短程化疗在TMB-HLUSC患者中比TMB-L患者产生显著更长的PFS和OS。CheckMate275研究中，接受纳武利尤单抗治疗的TMB-H(≥13mut/Mb)尿路上皮癌患者比TMB-L患者具有更高的ORR和更长的PFS/OS。在包括10种肿瘤(如SCLC和子宫内膜癌)的KEYNOTE-158单抗作为单药治疗，用于既往治疗后进展的晚期TMB-H(≥10mut/mb)检测可帮助指导治疗决策。历史数据表明，约10%-20%的CUP患者为TMB-H。在Maria等人对31例接受纳武利尤单抗加伊匹木单抗治疗的TMB-L患者(60%vs.7.7%),表明TMB-H的CUP患者在接受ICI后更TMB<8mut/Mb的患者ORR显著改善。中山大学张领导团队证实，TMB-H的晚期NSCLC患者PFS显著增加(HR=0.43-0.45)。未来需要进一步深入研究以优化TMB的临床应用，更好地为癌症患者治疗提供指外，与PD-L1表达分析联合筛选，能更准确地筛选出获得延长PFS和患者从ICI中获益，并可能通过联合检测其他血液参数获得更好的预后结局。在上海胸科医院陆团队进行的TRACELib002研究中，bTMB≥16mut/Mb的患者免疫治疗后中位OS为24.5个月，显著长于bTMB<16mut/Mb患者的14.6个月。然而，研究也表明，虽然bTMBbTMB的当前局限性和未来方向在比较纳武利尤单抗单药与铂类化疗作为PD-线治疗的CheckMate026研究的探索性分析中，TMB-H(>243突变/外显子组)患者使用纳武利尤单抗获得最高的ORR和最长的PFS。I期CheckMate227研究前瞻性评估了纳武利尤单抗加伊匹木单抗与化疗在表明TMB升高的患者联合治疗比标准化疗PFS显著改善，但未报告OS获益。在SCLC中，CheckMate032研究证实，TMB-H患者(>248突疗比TMB-L患者表现出更高的ORR和更长的PFS/OS。在黑癌症患者中，阿替利珠单抗联合维莫非尼和考比分位)与所有3个治疗组的临床结局显著改善相关。越来越多的证据支持研究调查了高tTMB(通过F1CDx检测≥10mut/Mb)与10种肿瘤类型符合TMB-H标准。最常见的TMB-H肿瘤类型包括SCLC(33%)、宫颈鳞状细胞癌(16%)和肛门鳞状细胞癌(14%)。TMB-H患者比TMB-L患者显示出更优的ORR和PFS(ORR:29%vs.6%;12个月PFS:26%vs.13%)。这些数据导致FDA批准帕博利珠单抗单药治疗，用于既往治疗后进展、无其他治疗方案可用的TMB-H(≥10mut/Mb)实体瘤患者。虽然KEYNOTE-158支持在≥10mut/Mb的癌症中使用帕博利珠单抗，但该疗法对某些肿瘤类型仍然无效；因此，单一的TMB阈值无法普遍识别所TMB在临床应用中存在诸多局限性。虽然多项研呈正相关，但在某些肿瘤类型中，低TMB也可能表明可从ICI治疗中获PD-1/PD-L1阻断治疗中获益的重要特征。CD治疗良好反应的基础，然而在一项研究中，并非所有TMB水平的癌症中均发现CD8+T细胞计数升高，且在CD8+T细胞水平与新抗原负荷无显ORR未达到20%(ORR=15.3%,95%CI9.2至23.4,P=0.95)。此外，TMB值在不同癌症类型间差异显著。与慢性诱变暴露相关的癌症，如肺治疗的高微卫星不稳定性转移性结直肠癌患者，TMB-H的最佳预测阈值为37-41mut/Mb。因此，合理的TMB阈值应根据肿瘤类型而变化。序panel对肺腺癌多个区域进行测序并计算TMB值的研究中，30%的患者在同一肿瘤不同区域间显示TMB差异，最大绝对TMB差异为对数据分析中，TMB-L水平在原发灶和转移灶间的一致性为73%,仅2例原发TMB-H病灶中的1例(50%)在治疗后仍为TMB-H(P=0.32)。虽然TMB已成为免疫治疗反应的独立生物标志物，但将TMB评估与其他生物标志物结合可能用于进一步分层患者以单独使用TMB作为ICI生物标志物的若干固有局限性。已在TMB之外研究了多种生物标志物，包括PD-L1表达、肿瘤浸润淋巴细胞、RNA基高且PD-L1表达水平高的肿瘤患者可能获得更大的治疗获益。在CheckMate026研究中，晚期NSCLC患者中TMB-H(≥243个体细胞尤单抗显示出最高的影像学反应概率，而TMB低/中等且PD-L1低表达KEYNOTE-042、IMpower110、CheckMate227和MYSTIC,报告了类似发现，表明在同时表现出TMB-H和改善。然而，这些研究中TMB-H的可变定义以及关于这两种生物标志物最佳整合以预测NSCLC免疫治疗疗效的不确定性仍未解决。细胞相关，因此与免疫治疗反应性相关。在最近一项泛癌分析中，在胶质瘤)中，TMB-H肿瘤显示出比TMB-L肿瘤更低的ORR(OR:0.46,新出现的证据强调了胚系和体细胞HLA变异如何决定抗原呈递和癌症对ICI的易感性。将HLA状态与TMB整合可能因此增强预测能力。体细胞HLA-I杂合性缺失(LOH)与TMB呈非线性关系，表明TMB-H肿瘤中存在替代免疫逃逸机制。在一项接受ICI治疗的非鳞NSCLC队列中，完整的HLA-I与显著延长的OS相关(HR=0.65,P=0.01),且与TMB结合改跨治疗缩短的OS相关(每等位基因HR=1.48,P<0.001),而HLA-B44超型与延长OS相关，HLA-B62亚型/体细胞HLA-ILOH与不良结局相关。然而，在17项帕博利珠单抗研究(n>3,500)的荟萃分析中，单独胚系HLA谱不足以预测帕博利珠单抗疗效，从而强调了HLA对免疫应答贡献项研究表明，将TMB与dNLR结合可提高预测准确性。dNLR高(前20dNLR/TMB整合可能优化PD-(L)1治疗选择。(75.0%)和纳武利尤单抗-伊匹木单抗(66.7%)的ORR最高，而单独使用伊匹木单抗为27.6%。同样，帕博利珠单抗研究中22种肿瘤类型的生物标志物分析表明，TMB-H加T细胞炎症GEP或PD-L1表达升高的肿瘤应预测的前景。全面的多生物标志物评估可能Table5CompariconbetweentheinternationalconDifferencesintermationalDfferencesChineseconzeofsomaticnonsynonymousmutamegabaze(Mb)inaspecifcgenomicregi.EmphasizesmutationDNAregionsanddoesnotumortype,samplequality,anddetectiorequiresalignmentwithChinezepopulapotentalpredictivebiomarkerforICIrezp3.Bothrequirequalitycontr2.Providesnoadditionmeetlaboratoryaccreditati2.EpicityinksTMBtop1.DetalsFPErequirements:10%neu2.RecommendsNMPA-approvedorlaboratory3.SpecifiesDNAconcentrationrecommendsmicro-nucleicaagarosegelelectrophoresisforqpanelcoverage,withoutspecify1.Recommendspanelcoverage21.significantlydecreaesat<2.Bothnotethatpanelco1.Bothemphasizefiteringger&voidTMBoverestimationpairedtumor-normalzequencingorpop2.Compareshybridcapture3.Doesnotpecilyaze2.MenionsMuTec/Mutect2aspopulation-specihicdatabazelimitati2.Specfessequencingdepth2200×(refESMOguidelinesplusdomesticv3.Listdomezticcomm425-gene,andGeneplusOncoD1,021-genandunsuitableforChinesepopulationgrecolaboratory-builtChinesedatab2.Bothemphasizereportingmethodo1.Focusesonmethodologicalforcros-laboratorycomparability,2.Requirestesterandrevwithoutspecifyingphysicianqualfcati(diagnosisandtreatmenth2.Recommend:MolecularTumorBoard(title/MD.pathologybackground,andt4.Providesaztandardlungcancer/melanoma/gastriccancer(a24.5monthsforbTMB≥16mut3.ClarnfesthatbTMBca1.Describesfuturedirectsample,mult-centerprospectiprogresingafterstandardtreatmefrequiresfurthervalidathrezhold(TMB210mut/Mb)withou2.MentionsonlybTMBzamplea7.Limitationsand1.Bothnofuturedirectionsheterogeneity,spatiotemporalhdetectionmethodvanability.CancerRerearchandQu2.BothsuggestcombiningTMBwithother2.Doesnotbiomarkers(PD-L1,MS3.DoesnotmentionChinezepopuL1anddNLR)forpreciionpredic关于共识一致点，国际共识和中国专家共识高度一致，在以下5个方面核认靶向NGSpanel是更临床实用的替代解决方案。国际共识表明1-2Mb是panel的常见覆盖范围，而中国共识进一步明确panel覆盖度必须≥1.0Mb(因为<1.0Mb覆盖度显著降低准确性);而且，两者都表明panel——国际共识中阈值隐含设定为≥20%,中国共识中明确指定——同时推或1000Genomes)