甘蓝过氧化物酶基因的克隆及表达分析

摘要甘蓝（BrassicaoleraceaL.var.capitataL.）十字花科芸薹属，典型的异花传粉植物。诸多学者经研究表明花粉败育的主要原因之一是绒毡层细胞的发育异常，绒毡层细胞降解的提前或者延迟都可导致雄性不育，花粉败育属于雄性不育的表现特征。同时也有研究表明过氧化物酶是影响绒毡层发育的一个重要因素。为了系统性的了解过氧化物酶基因在结球甘蓝的作用机制，以及系统结构和表达特点，本试验以结球甘蓝为研究对象，通过RT-PCR扩增出过氧化物酶基因；再通过生物信息学分析其结构和蛋白功能；构建过氧化物酶基因的亚细胞定位重组质粒为后期该基因的深度研究提供理论依据。研究结果表明，通过PT-PCR扩增出984bp的BoPOD基因的CDS区。对该基因进行生物信息学分析结果表明，BoPOD蛋白为亲水性稳定蛋白，由327个氨基酸残基组成，含有Peroxidase结构域同时具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点以及多个特异性激酶磷酸化位点，无信号肽。通过同源氨基酸序列比对和构建系统发育树发现结球甘蓝与甘蓝变种和欧洲油菜有很高的同源性。进行亚细胞定位预测该蛋白在胞外，可能属于分泌蛋白。表达分析得出，BoPOD基因在甘蓝组织花中具有高表达量，在可育与不育甘蓝的发育阶段中，不同的发育阶段和可育与不育对比均有不同的表达量。并成功构建重组载体。本研究为该基因在甘蓝雄性不育的分子调控机理中的功能及调控作用研究提供了理论依据。关键词：结球甘蓝；过氧化物酶；雄性不育；生物信息学

AbstractBrassicaoleraceaL.var.capitataL.isagenusofbrassicainthecruciferousfamily,typicalofcross-pollinatingplants.Manyscholarshaveshownthatoneofthemaincausesofpollensterilizationistheabnormaldevelopmentofchorionyfeltlayercells,andtheearlyordelayeddegradationofchorionyfeltlayercellscanleadtomaleinfertility,andpollensepticisamanifestationcharacteristicofmaleinfertility.Atthesametime,studieshavealsoshownthatperoxidaseisanimportantfactoraffectingthedevelopmentofthevelvetfeltlayer.Inordertosystematicallyunderstandthemechanismofactionofperoxidasegeneincabbage,aswellasthesystemstructureandexpressioncharacteristics,thisexperimentamplifiedperoxidasegenebyRT-PCRwithkaleastheresearchobject.Itsstructureandproteinfunctionwerethenanalyzedbybioinformatics;Theconstructionofsubcellularlocalizationrecombinantplasmidsofperoxidasegeneprovidesatheoreticalbasisforthein-depthstudyofthisgeneinthelaterstage.TheresultsshowedthattheCDSregionoftheBoPODgeneof984bpwasamplifiedbyPT-PCR.BioinformaticsanalysisofthegeneshowedthatBoPODproteinwasahydrophilicstableproteincomposedof327aminoacidresidues,containingPeroxidasedomains,withserine,threonineandtyrosinephosphorylationsitesandmultiplespecifickinasephosphorylationsites,withoutsignalpeptides.Throughhomologyaminoacidsequencealignmentandphylogenetictreeconstruction,itwasfoundthatkalehadhighhomologywithcabbagevarietiesandEuropeanrapeseed.Subcellularlocalizationpredictsthattheproteinisextracellularandmaybeasecretedprotein.ExpressionanalysisshowedthatBoPODgenehadhighexpressionincabbagetissueflowers,anddifferentdevelopmentalstagesandsterileandsterilecomparisonhaddifferentexpressionamountsinthedevelopmentstagesoffertileandsterilecabbage.Andsuccessfullyconstructedtherecombinantvector.Thisstudyprovidesatheoreticalbasisforthestudyofthefunctionandregulatoryroleofthisgeneinthemolecularregulationmechanismofmaleinfertilityincabbage.Keywords：Brusselssprouts;Peroxidase;Maleinfertility;Bioinformatics1绪论1.1研究背景典型的十字花科芸薹属植物甘蓝，具有很强的抗逆环境的性能和强的适应能力，其叶球中含有丰富的营养价值，受到人们广泛的关注和喜爱，在世界各地普遍栽培ADDINNE.Ref.{70E52CC3-3642-4A9D-92E7-E27AAE30770E}[1]。近年来，我国实现了利用雄性不育系技术对甘蓝进行规模化制种，完成了甘蓝育种高效技术体系的建立；同时针对甘蓝的一些重要基因进行了克隆或定位，培育出一批具有优良品质和抗逆性的新品种甘蓝；为后期甘蓝的研究指出重要问题并指明未来的发展方向ADDINNE.Ref.{0CA87B36-38AD-44B5-A13D-856323F7BB05}[1-3]。甘蓝为典型的异花授粉作物,其一代杂种在抗病性、抗逆性、品质、生长势及产量等方面具有十分显著的杂种优势；甘蓝的杂种生产主要依托自交不亲和系和雄性不育系两种途径ADDINNE.Ref.{AEE4D1C4-1B07-45A3-BDE8-E60BDC8AF5A7}[4]。现对甘蓝的育种研究表明，利用自交不亲制种会造成人力、物力及财力等方面的很大程度的浪费，但选用雄性不育系进行制种可以避免这种弊端。细胞核雄性不育、细胞质雄性不育、核质互作雄性不育、基因型——环境互作不育这四大类的划分，是我国学者对甘蓝雄性不育的划分ADDINNE.Ref.{7183A7E4-CA20-4F10-B3E4-00BDAEEAF888}[5]。在结球甘蓝中发现的不育自然突变，是我国特有的类型，现已经应用于甘蓝杂交优势的利用ADDINNE.Ref.{532EF591-13BE-470B-824C-9D088788F8DD}[6]。诸多学者经研究获知花粉败育是雄性不育的表现特征，并表明绒毡层细胞发育异常是其主要原因ADDINNE.Ref.{6E3961B0-CE52-41AB-BB28-CE9C11E00AA4}[7-9]，绒毡层细胞降解的提前或者延迟都将导致雄性不育。线粒体的呼吸作用异常、物质代谢紊乱、膜脂过氧化和小RNA功能异常等都与花粉败育有着密切的关联。绒毡层PCD（细胞的程序化死亡）过程的异常，使得过氧化物酶（POD）的活性发生了异常，产生大量的H2O2无法及时正常清除，从而对蛋白质的合成起到了抑制作用ADDINNE.Ref.{E1094C1A-64CD-44E9-A49C-B048B3FE54E7}[10]。此时正处于小孢子内生化反应最活跃的时期，核进行有丝分裂的时期，从而蛋白质的缺失最终将导致核发育畸形，致使花粉败育ADDINNE.Ref.{C7673136-067F-495C-A374-B27B29F7F5B0}[11]。在高等植物中分布较为广泛的过氧化物酶，是植物重要的保护酶，在植物的正常生长和应激反应中都发挥着重要作用ADDINNE.Ref.{089BB777-6068-44E3-9009-544A6835E0BC}[12]。根据过氧化物酶的不同结构将其分为：胞内过氧化物酶、胞外过氧化物酶、分泌过氧化物酶这三类ADDINNE.Ref.{31B7335C-2BC9-4829-AF5D-B3754EA8E50A}[13]。植物的血红素依赖性过氧化物酶属于分泌过氧化物酶,催化涉及过氧化氢作为电子受体的多步氧化过程反应,含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点ADDINNE.Ref.{EAE7C943-E9BC-4218-8C66-FDE93BFF2A18}[14]。它参与酚类物质氧化，在果蔬褐变中发挥着重要作用。同时在萝卜雄性不育系和保持系的过氧化物酶同工酶分析中，发现过氧化物酶基因与萝卜雄性不育系花的败育有关ADDINNE.Ref.{F511161A-9365-4212-8E87-13E3F04B6054}[15]。1.2研究目的及意义17世纪左右甘蓝传入中国进行种植并对其进行了大量研究，取得了优异的成果；在本世纪雄性不育系的研究与利用获得巨大成就，经过300多年来的发展，在蔬菜对外贸易出口国外和周年供给两大方面甘蓝占据重要地位，目前国内的种植面积已经约90万hm2。我国大力发展甘蓝种植业，同时推动对甘蓝遗传变种获得突破，实现了F1制种由自交不亲和系到雄性不育系的技术变革，抗新型流行性病害育种取得了突破性进展，小孢子培养和分子标记辅助选择等生物技术逐步实用化，很大程度提高了育种效率ADDINNE.Ref.{104755B4-5CAC-4FC7-A7E0-0D97A96615DD}[16]。虽然近年来对甘蓝的研究已经取得了一定的成功，但是应用于生产种植方面的甘蓝品种在抗病虫害、抗逆与优质品种的结合方面依然缺乏，不能完全满足生产和市场的需要。且遗传方面的资源任然有较大空缺，尤其是抗逆、抗病、优质三大方面优异资源的缺乏，传统育种和生物新技术还未很好的相互结合。目前已有结球甘蓝过氧化物酶同工酶的一些生化和遗传特性研究，以及过氧化物酶活性及其影响因素的研究ADDINNE.Ref.{57A74506-3392-4BD8-9CC3-865E2289FF30}[17,18]。但过氧化物酶基因在甘蓝的生长发育中有着不可替代的作用，若能对甘蓝过氧化物酶基因（BoPOD）进行系统的研究，便能为后期甘蓝雄性不育的分子调控机理中的功能及调控作用研究奠定基础，并为甘蓝杂种优势利用提供参考。所以本文将对过氧化物酶克隆体系、表达分析、重组载体构建三个方面进行系统分析研究。2材料与方法2.1试验材料本课题组田间种植结球甘蓝，其花序、嫩角果、茎、叶四个组织；以及可育与不育甘蓝花蕾，分别具有为一级（花粉母细胞时期：0-1mm）、二级（四分体时期：1-2mm）、三级（单核花粉期：2-3.5mm）花蕾ADDINNE.Ref.{CA45306F-C68C-4F21-88B0-819A3FAF84FF}[18]；可育花序、不育花序、可育嫩角果。2.2试验试剂与器材TIANGEN植物总RNA提取试剂盒、TIANGENcDNA第一链合成试剂盒、VazymeTaqDNA聚合酶2×RapidTaqMasterMix、ddH2O、TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、液氮、琼脂糖、EB、Tris、EDTA、蒸馏水、无水乙醇、DNA引物（上海生工生物工程有限公司）、TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TIANGEN质粒小提试剂盒、Vazyme同源置换试剂盒ClonExpress®OneStepCloningKit、NEB的限制性内切酶XbaI、BamHI和T4DNA连接酶、Biotopped的硫酸卡那霉素（kanamycin，Kan）、ddH2O、(中科瑞泰)D2000和D15000，(中晖赫彩)6×DNA上样缓冲液，(SangonBiotech)大肠杆菌DH5α，PFGC-eGFP载体为本试验室保存菌株PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、切胶仪、超低温冰箱、冰箱、烘箱、制冰机、顺时离心机、低温高速离心机、天平、微波炉、NANODROP2000仪、金属空气浴、涡旋震荡仪、高压灭菌锅、高温灭菌锅灭菌处理的研钵、药匙、镊子、剪刀、枪头、1.5ml离心管、PCR管，不同规格的移液枪、量筒、烧杯、橡胶手套、一次性塑料手套、酒精棉、口罩、玻璃棒、锡纸、报纸2.3试验方法2.3.1甘蓝过氧化物酶基因CDS克隆（1）RNA的提取严格按照植物总RNA试剂盒的说明书以及注意事项进行RNA提取，材料选用甘蓝的四个组织、可育与不育的不同级别的花蕾以及可育花序、不育花序、可育嫩角果。将提取的RNA置冰上，利用NANODROP2000仪测其浓度与纯度做好标记，-80C冰箱保存。试验过程中离心机一直保持4℃，使用RNA专用枪头；佩戴口罩和手套，常用75％酒精杀菌消毒、更换手套。（2）第一链cDNA合成RNA模板变性在RNase-Free离心管中配制如下混合液：表SEQ表\*ARABIC1RNA模板变性Table1RNAtemplatedegeneration组成成分体积RNase-FreeddH2Oto12μLOligo(dT)23VN(50uM)1μLTotalRNA1μL加热65℃、5min，结束后迅速置于冰上骤冷，并静置2min。去除基因组DNA表SEQ表\*ARABIC2基因DNA去除Table2RemovalDNAgenome组成成分体积上一步的混合液12μL4×gDNAwiperMix4μL加入上述组分后使用移液枪轻轻吹打混匀。置于空气浴中42℃、2min。第一链cDNA合成反应液的配制 表SEQ表\*ARABIC3第一链cDNA合成反应液Table3SynthesisreactioncDNAfirstchain组成成分体积上一步的混合液16μL10×RTMix2μLHiScript=2\*ROMANIIEnzymeMix2μL加入各组分后用移液器轻轻吹打混匀。将所得溶液置于冰上，测其浓度与纯度（OD值260/280:1.8-2.0）记录；放置-20℃冰箱保存。（3）过氧化物酶基因的引物设计以UBC10为内参基因，根据前期试验以获得UBC10基因特异性引物。BoPOD基因引物的获得，首先利用NCBI以及SnapGene软件设计出过氧化物酶基因的特异性引物BoPOD-1F/R（表4），以获得其基因全长；再利用Premier6.0软件以及碱基互补配对原则设计出BoPOD基因CDS区的巢式引物BoPOD-2F/R（表4），获得其基因的CDS区。交由上海生工生物工程有限公司合成，根据DNA合成报告单稀释引物。表SEQ表\*ARABIC4引物序列Table4PrimerSequence（4）RT-PCR获取BoPOD基因以25μL为总反应体系，向灭菌的PCR管中加入表5的各组份用量，移液枪吹打混匀、低速离心。在冰上完成该操作。50μL的回收体系按照比例成倍增加。表SEQ表\*ARABIC5PCR反应体系Table5PCRReactionsystems用以下PCR程序进行扩增反应起始（94℃） 3min变性（94℃）30sec退火（53℃） 30sec 34×延伸（72℃） 2min最后延伸（72℃） 10min保存（4℃） ∞50×TAEBuffer缓冲液配制：配制100mL的试剂，称取Tris24.2g、Na2EDTA·2H2O3.72g，混入烧杯中80mL蒸馏水充分溶解，加入6mL冰乙酸搅拌均匀。使用NaOH溶液调节PH至8.3后，蒸馏水定容到100mL。1×TAEBuffer缓冲液按照比例用50×的溶液稀释。缓冲液置于室温保存。配制1.0%琼脂糖凝胶：向50mL的烧杯中加入琼脂糖0.3g、1×TAEBuffer缓冲液30mL，置于微波炉中加热两分钟到完全溶解。待温度降至50℃左右向溶液中加入5μLEB，充分混合均匀。倒入提前洗净晾干的制胶板中，等其冷却凝固。点样、跑胶：将冷却凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽靠近负极一段，提前将1×TAEBuffer缓冲液倒入电泳槽中。点样每孔10μL，从左至右依次为D2000maker、甘蓝不同组织的PCR产物。电压100V、电流130A，电泳40min。电泳结束后凝胶成像仪观察条带位置，并拍照保存。目的片段的回收、纯化：在切胶板上将目的条带准确无误的切下，放入灭菌过的离心管中。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书及注意事项严格进行DNA凝胶回收，回收后测量浓度及OD值，-20℃保存。（5）BoPOD基因CDS区的获取按照上诉步骤2.3.1（4）进行CDS区的克隆，将PCR体系的模板换成回收的BoPOD基因、引物换成BoPOD-2F/2R，PCR程序退火温度改为54℃。经过一些列步骤获得BoPOD基因CDS区。2.3.2表达分析（1）生物信息学分析内容及所使用网址见表6。表SEQ表\*ARABIC6生物信息学预测网址Table7Websitesofbioinformaticsprediction（2）序列比对分析使用NCBI的BLAST工具比对找到具有同源性的过氧化物酶基因的植物，包括四种十字花科芸薹属和五种十字花科非芸薹属的植物氨基酸序列。再利用ClustalX和GeneDoc工具进行10种氨基酸序列的多重比对，用MegAlign工具分析10种氨基酸的相似性。（3）构建系统发育树使用MEGA5.0软件以邻接法构建BoPOD的系统进化树并分析甘蓝与甘蓝变种、欧洲油菜、芜青、芥蓝、萝卜、盐芥、亚麻荠、拟南芥以及荠菜的亲缘关系，具体物种信息及基因序列号见表7。表SEQ表\*ARABIC7POD系统进化树物种信息Table7PODphylogenetictreespeciesinformation物种学名所在科属同源基因序列号结球甘蓝BrassicaoleraceaL.var.capitataL.十字花科、芸薹属甘蓝变种Brassicaoleraceavar.Oleracea十字花科、芸薹属XM_013754635.1欧洲油菜Brassicanapus十字花科、芸薹属XM_013858729.3芜青BrassicarapaL十字花科、芸薹属XM_009116062.3芥蓝Brassicaoleraceavar.alboglabra十字花科、芸薹属XM_010443214.2萝卜Raphanussativus十字花科、萝卜属XM_018599839.1盐芥Eutremasalsugineum十字花科、山嵛菜属XM_006398331.2亚麻荠Camelinasativa十字花科、亚麻荠属XM_010483085.2拟南芥Arabidopsisthaliana十字花科、拟南芥属XM_002863330.2荠菜Capsellarubella十字花科、荠属XM_006281522.2（4）BoPOD基因表达分析RT-PCR分析：以甘蓝的花、果、茎、叶以及可育与不育的不同级别花蕾、可育花序、不育花序、可育嫩角果cDNA为模板，根据2.3.1（4）的步骤进行RT-PCR。qRT-PCR分析：使用Premier6.0软件进行qPCR引物设计：上引TTGTCCCGATGTGGTATCATG；下引GAAGAGCCGGTCACTAAACTC。交于生工进行引物合成。分别以甘蓝的花、果、茎、叶以及可育与不育的不同级别花蕾cDNA为模板，以ACTIN为内参基因。根据qRT-PCR反应体系：2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μL,上下引物各0.5μL，50×ROXReferenceDye2b0.4μL，模板5μL，ddH2O补齐至20μL。在实时荧光定量PCR仪中进行BoPOD基因表达水平的检测。最终相对水平的计算采用2-ΔΔCT法ADDINNE.Ref.{F3AE30EB-3298-4C1B-8480-509DB00F3627}[19]。试验生物学重复三次，操作重复三次。琼脂糖凝胶电泳，并观察在不同模板中BoPOD基因的表达情况。2.3.3PFGC-eGFP::BoPOD载体的构建（1）目的基因同源连接引物和检测引物设计目的基因同源连接引物设计：根据前期试验室研究的质粒PFGC-eGFP（图2.1）核心序列，选择酶切位点BamHI和XbaI，eGFP蛋白序列在插入位点之前并保留终止密码子。同源连接的插入片段需要满足正反向引物的5’端具有线性化载体两末端的同源序列，所以在上游引物BoPOD-2F的5’端加上酶切位点BamHI序列GGATCC及此序列上游15bp末端同源臂序列，在下游引物BoPOD-2R的5’端加上XbaI序列TCTAGA及此序列下游15bp末端同源臂序列（表8），以确保BoPOD连接在BamHI和XbaI酶切位点上。图2.SEQ图2.\*ARABIC1PFGC-eGFP质粒环状图Fig.2.1LoopdiagramofPFGC-eGFPplasmid检测引物设计：根据前期研究已有的pFGC-eGFP质粒核心序列，在eGFP序列中设计上引物，在XbaI酶切位点后设计下引物（表8），确保BoPOD序列及其上下游部份pFGC-eGFP质粒序列包含其中。目的基因连接pFGC-eGFP质粒转化DH5α后需要用检测引物做菌液PCR检测。表SEQ表\*ARABIC8引物序列表Table8PrimerSequenceTables注：表示同源臂，表示酶切位点RT-PCR其步骤与2.3.1（4）的步骤完全相同，只需将PCR体系的模板换成回收的BoPOD-CDS区基因、引物换成BoPOD-3F/3R，PCR程序退火温度改为58℃。经过一些列步骤获得带有同源臂的BoPOD基因CDS区，即为插入片段。（3）PFGC-eGFP载体的扩繁LB液/固培养基配制：配制液体培养基1L，将酵母提取液5g、胰化蛋白胨10g、氯化钠10g，以及800mL蒸馏水倒入白瓷缸中使用玻璃棒搅拌均匀，放置在电磁炉上煮沸并充分溶解，定容至1000mL，用1mol/LNaOH调PH=7.4；将所得溶液分装至2个500mL的锥形瓶中，放入高温高压灭菌锅进行灭菌。1L的固体LB培养基配制：在液体培养基的基础上加入15g琼脂粉，其余步骤与配制液体培养基步骤相同。灭菌后的液体培养基放在室温中晾凉后4℃冰箱保存。固体培养基需在未凝固（50℃左右）时加入抗生素Kan（1mLLB加入1μL50mg/mL的Kan）充分混匀，到平板后待其冷却凝固后封膜4℃保存。转化：100μL的DH5α感受态细胞加入1μg质粒载体，轻弹混匀后冰浴30min；接着42℃恒温水浴90s（不得晃动）热激后，结束后立即拿出插入冰中冰浴2-3min，离心管中加入300μLLB培养液（提前37℃水浴预热），轻弹混匀后37℃、200r/min摇床震荡培养1h；吸取100μL培养菌液进行LB固体培养基涂板，将菌液均匀滴在平板中，再用灭菌晾凉的玻璃涂布器均匀涂抹，晾干后培养箱中先正面培养1h，然后倒置培养12-16h。挑菌摇床培养：选择不同位置的白色单一菌落用灭菌牙签挑起，放入含有10μLkan的10mLLB培养液锥形瓶中，37℃、200r/min过夜培养。质粒小提：根据质粒小提试剂盒说明书与注意事项，进行扩繁质粒的提取。按照质粒片段大小和菌液浓度对各组分试剂进行用量调整，从而提高质粒提取浓度。然后测纯度与浓度，-80℃冰箱保存。（4）载体线性化用BamHI和XbaI限制性内切酶双酶切质粒PFGC-eGFP，按照表9加入各组分至PCR管中，37℃酶切3h。获得50μL的双酶切产物，产物中含有两个不同粘性末端的大片段和小片段线性化载体。产物中加入6×上样缓冲液10μL，吹打混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，使用D15000marker；最后进行大片段的纯化回收，测浓度与纯度后-20℃保存。表SEQ表\*ARABIC9pFGC-eGFP双酶切体系Table9pFGC-eGFPDoubleenzymedigestionsystem（5）重组、转化重组：载体与插入片段使用量需满足摩尔比为1:2，置于冰上完成重组反应体系配制（表10）；使用移液枪将溶液轻轻吹打混匀，用瞬时离心机短暂离心将反应液收集至管底；接着在金属空气浴中37℃、30min进行重组反应，结束后立即置于冰上充分冷却。表SEQ表\*ARABIC10重组反应体系Table10Restructuringreactionsystem转化：将感受态细胞DH5α置于冰上充分解冻；取上述10μL重组产物加入解冻后的100μL感受态细胞中，轻弹管壁使溶液混匀，然后离心管置冰上静置30min；接着金属空气浴中42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min；向离心管中加入提前37℃预热的900μLLB液体培养基（未加抗生素），37℃、1h摇床上摇菌；将LB固体培养基平板（含抗生素Kan）在培养箱中37℃预热；离心机中5000rpm离心5min，弃掉900μL上清；用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在平板上将菌液轻轻涂匀；培养箱中37℃倒置培养12-16h。摇菌扩繁：步骤见2.3.3（3）。（6）检测菌液PCR检测：PCR体系见表5，将模板cDNA换成菌液 ，引物为检测引物PFGC-F/R。PCR反应程序与上文相同，将退火温度设置为58℃进行反应。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，正确的PCR产物长度为1284bp，与D15000marker的长度进行对照分析，并拍照保存。选择对比正确的菌液进行重组质粒小提。重组载体双酶切检测：按照表11中体系进行重组质粒双酶切，37℃、3h。然后加入6×上样缓冲液4μL，混匀。进行琼脂糖凝胶电泳检测，正确的重组质粒会得到10728bp和1026bp两条条带，与D15000marker的长度进行对照分析。表SEQ表\*ARABIC11重组载体双酶切体系Table11Recombinantvectordoubledigestionsystem3结果与分析3.1甘蓝BoPOD基因的克隆以甘蓝混合cDNA为模板，经过RT-PCR扩增出BoPOD基因（1251bp）；再以扩增回收的BoPOD基因为模板获得BoPOD基因的CDS区（984bp）。图3.SEQ图3.\*ARABIC1BoPOD的cDNA扩增Fig.3.1BoPODcDNAsequenceamplification注：A表示BoPOD基因、B表示BoPOD基因CDS区，M为D2000，1、2、均为扩增序列。3.2表达分析3.2.1BoPOD基因全长CDS序列利用SnapGene对甘蓝POD基因进行序列分析，图3.2中黄色区域表示BoPOD基因的CDS区域984bp。并获得BoPOD基因的CDS区序列图谱（图3.3）。图3.SEQ图3.\*ARABIC2BoPOD基因序列Fig.3.3BoPODgenesequence图3.SEQ图3.\*ARABIC3甘蓝POD基因CDS序列图谱Fig.3.3CDSsequencemapofcabbagePODgene注：图中黑色西文字体为不同的酶切位点或同尾酶3.2.2氨基酸序列利用SnapGene软件获得BoPOD基因的氨基酸序列图。图3.SEQ图3.\*ARABIC4BoPOD基因的氨基酸序列Fig.3.4AminoacidsequenceoftheBoPODgene3.2.3生物信息学分析（1）BoPOD蛋白的理化性质及一级结构分析利用Expasy对BoPOD蛋白进行分析，获得其分子式为C1598H2528N446O476S18，共有原子5066个，分子量为36181.43，等电点为6.75。BoPOD蛋白编码氨基酸残基327个，其中包含带正电荷的氨基酸，精氨酸和赖氨酸（Arg+Lys）41个；带负电荷氨基酸天冬氨酸和谷氨酸（Asp+Glu）42个。氨基酸组成见图（3.5）。预测得到其不稳定系数为24.72，所以判断该蛋白为稳定蛋白；脂溶系数为82.32。并获得BoPOD蛋白体外半衰期为30h。用SignalP软件预测BoPOD蛋白无信号肽。SMART分析BoPOD蛋白具有Pfam-Peroxidase结构域（图3.6）。图3.SEQ图3.\*ARABIC5氨基酸组成Fig.3.5Aminoacidcomposition图3.SEQ图3.\*ARABIC6甘蓝BoPOD蛋白质的功能结构域分析Fig.3.6ProteindomainanalysisofBoPODproteininBrassicaoleraceaL.（2）BoPOD蛋白二级结构和三级结构预测利用SOPMA网站预测蛋白质二级结构，获得结果为BoPOD蛋白包含α-螺旋（Alphahelix）占38.53%（蓝色），氨基酸残基组成；β-转角（Betaturn）占5.20%（绿色），由17个氨基酸残基组成由126个氨基酸残基组成；延伸链（Extendedstrand）占16.82%（红色），由55个；无规则卷曲（Randomcoil）占39.45%（紫色），由129个氨基酸残基组成；BoPOD基因的N端具有α-螺旋，C端为无规则卷曲（图3.7）。通过SWISS-MODEL软件预测蛋白质三级结构并进行建模，表明BoPOD蛋白具有螺旋、折叠、延伸链和卷曲结构，说明其BoPOD蛋白的稳定性与其三级结构有关。预测结果同时表明该蛋白可形成一个单体结构，无配体结合（图3.8）。图3.SEQ图3.\*ARABIC7甘蓝BoPOD蛋白的二级结构Fig.3.7SecondarystructureofBoPODproteininBrassicaoleraceaL.图3.SEQ图3.\*ARABIC8甘蓝BoPOD蛋白的三级结构Fig.3.8TertiarystructureofBoPODproteininBrassicaoleraceaL.（3）BoPOD蛋白的亲水性/疏水性分析、跨膜区预测、磷酸化位点预测利用Expasy网站对BoPOD蛋白进行亲水性/疏水性分析，结果表明多肽链第五位精氨酸具有最高的疏水性分值，为3.867；第92位天冬氨酸具有最高的亲水性分值最高，为-2.500（图3.9）；整条多肽链的平均亲水性为-0.200,所以该蛋白为亲水性蛋白。利用NetPhos3.1对蛋白质序列进行潜在磷酸化位点预测，发现BoPOD蛋白含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点（图3.10），并含有多个特异性激酶磷酸化位点：依赖性蛋白激酶（PKA、PKC、PKG、DNAPK）磷酸化位点、络氨酸蛋白激酶（INSR)磷酸化位点、肌酸磷酸激酶（CKI）磷酸化位点、丝裂原激活蛋白激酶p38MAPK磷酸化位点、钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaM-II）磷酸化位点、cdc2磷酸化位点。使用DeepTMHMM分析获得BoPOD蛋白质无跨膜螺旋区，不属于跨膜蛋白。图3.SEQ图3.\*ARABIC9BoPOD蛋白质序列的亲水性分布Fig.3.9HydrophilicdistributionofBoPODproteinsequences图3.SEQ图3.\*ARABIC10BoPOD蛋白质序列的磷酸化位点分布Fig.3.10PhosphorylationsitedistributionofBoPODproteinsequence（4）BoPOD蛋白的亚细胞定位预测利用PredictProtein进行亚细胞定位预测，将BoPOD蛋白定位在胞外。图3.SEQ图3.\*ARABIC11BoPOD蛋白质亚细胞定位预测Fig.3.11PredictionofBoPODproteinsubcellularlocalization3.2.4序列比对分析经过NCBI的核酸序列比对分析发现甘蓝BoPOD基因与甘蓝变种、欧洲油菜、芜青以及萝卜中的BoPOD基因同源性分别高达100.00%、99.90%、95.83%和92.98%。并将BoPOD基因的核苷酸序列与甘蓝变种、欧洲油菜、芜青、芥蓝、萝卜、盐芥、亚麻荠、拟南芥以及荠菜的核酸序列进行比对分析（图3.12），发现它们具有很强的同源性，可推测BoPOD基因在植物中具有很强的保守性，在植物的生长发育中具有着不可替代的作用。10种氨基酸的相似性分析如图3.13所示，发现甘蓝变种、欧洲油菜、芜青、萝卜、盐芥与甘蓝BoPOD基因氨基酸序列相似性高达90.00%以上。图3.SEQ图3.\*ARABIC12BoPOD与BoPOD1、BnPOD、BrPOD、BoaPOD、RsPOD、EsPOD、CsPOD、AtPOD、CrPOD的氨基酸序列比较Fig.3.12ComparisonoftheBoPODwithBoPOD1、BnPOD、BrPOD、BoaPOD、RsPOD、EsPOD、CsPOD、AtPOD、CrPOD注：BoPOD1：甘蓝变种；BnPOD：欧洲油菜；BrPOD：芜青；BoaPOD：芥蓝；RsPOD：萝卜；EsPOD：盐芥；CsPOD：亚麻荠；AtPOD：拟南芥；CrPOD:荠菜黑色：同源性100%；蓝色：同源性80%；紫色：同源性60%图3.SEQ图3.\*ARABIC1310种氨基酸序列相似性百分比Fig.3.13Percentagesequencesimilarityof10aminoacids注：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别表示BoPOD、BoPOD1、BnPOD、BrPOD、BoaPOD、RsPOD、EsPOD、CsPOD、AtPOD、CrPOD3.2.5系统发育树根据获得的系统发育树(图3.14)可得BoPOD基因中甘蓝与甘蓝变种、欧洲油菜的遗传距离最近，与芥兰和亚麻荠的遗传距离最远。可说明甘蓝与甘蓝变种、欧洲油菜有着较近的亲缘关系，与芥兰和亚麻荠的亲缘关系较远。图3.SEQ图3.\*ARABIC14BoPOD系统发育树Fig.3.14phylogenetictreeofBoPOD3.2.6BoPOD基因的表达分析以甘蓝的花、果、茎、叶以及可育与不育甘蓝的一、二、三级花蕾、可育花序、不育花序、可育嫩角果为材料，以UBC10为内参基因，进行RT-PCR检测；甘蓝的花、果、茎、叶以及可育与不育甘蓝的一、二、三级花蕾为材料，以UBC10为内参基因，进行qRT-PCR检测。获得的结果表明，BoPOD基因在不同组织中具有不同的表达含量，在花中具有高表达（图3.15）。在可育与不育甘蓝的发育过程中（图3.16），相同发育阶段的可育与不育品种具有不同的表达量，不育一、二、三级花蕾表达量要比同时期可育花蕾高，但发育完全的花序可育相对与不育更高，且可育嫩角果具有高表达；可育与不育甘蓝在各自的不同发育时期BoPOD基因表达量也有所变化。图3.SEQ图3.\*ARABIC16BoPOD在甘蓝发育阶段的表达Fig.3.16ExpressionofBoPODindevelopmentalstageofBrassicaoleraceaL.注：K1、K2、K3、B1、B2、B3、KH、BH、KG分别表示甘蓝的可育一级花蕾、可育二级花蕾、可育三级花蕾、不育一级花蕾、不育二级花蕾、不育三级花蕾、可育花序、不育花序、可育嫩角果3.3PFGC-eGFP::BoPOD载体的构建重组载体构建首先根据RT-PCR获取得到具有同源臂的目的基因如图3.17（A）所示；再与PFGC-eGFP载体进行重组构建，经过菌液PCR鉴定选取阳性克隆（图