DB32／T 5359-2026+纺织品+花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定+酶联免疫吸附法

DB32/T5359—2026纺织品花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定酶联免疫吸附法2026-04-03发布江苏省市场监督管理局发发出布版ⅠDB32/T5359—2026前言 Ⅲ引言 Ⅳ 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂和材料 6仪器与设备 7测试准备 8过敏原标准曲线绘制 9测试步骤 10过敏原去除率计算与表示 12重复性和再现性 13测试报告 附录A（资料性）花粉、螨虫过敏原 附录B（资料性）试剂盒组成示例 附录C（资料性）酶联免疫吸附法：夹心ELISA法 附录D（资料性）过敏原标准曲线 附录E（资料性）回收率 附录F（资料性）实验室间对比结果 附录G（资料性）重复性和再现性 参考文献 DB32/T5359—2026Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江苏省市场监督管理局提出并组织实施。本文件由江苏省化学纤维标准化委员会归口。本文件起草单位：江苏省纺织产品质量监督检验研究院、中国药科大学。ⅣDB32/T5359—2026引言经整理具有抗细菌、真菌、病毒等功能的纺织品，满足了消费者对健康和卫生的需求，自面世以来其应用领域越来越广泛。一定条件下，可引发人体抗原-抗体反应的过敏原（如螨虫、花粉来源的过敏原）会通过污染纺织品给消费者的健康带来一些隐患。因此，经整理具有去除此类过敏原功能的高性能纺织品越来越受关注和青睐。这类高性能纺织品的研发、生产不仅涉及纺织技术还有生物技术。当前，由于缺乏现行有效的、规范统一的测试方法，不同测试结果之间不具有可比性，因此，无法为生产商、经销商、消费者以及市场监管部门有效评估此类经整理纺织品的去除过敏原功效提供依据。为满足市场各相关方获取纺织品去除过敏原性能准确评价的需求，本文件提供了一种基于酶联免疫吸附法（Enzyme⁃linkedimmunosorbentassay，ELISA）测定纺织品的螨虫、花粉等过敏原去除活性的试验方法。为响应此迫切需求，基于ELISA，本文件提供了一种科学的、有效的、可行的，可测定纺织品的螨虫、花粉等过敏原去除活性的试验方法。需要说明的是，该测试方法不用于人体过敏原检测。DB32/T5359—20261纺织品花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定酶联免疫吸附法警告——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。本文件描述了采用酶联免疫吸附法测定纺织品的花粉、螨虫等过敏原去除活性的方法。本文件适用于纤维、纱线、无纺布、机织物、针织物、编织物等纺织品的花粉、螨虫等过敏原去除活性测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T33411酶联免疫分析试剂盒通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。被免疫系统识别为外来物，并诱发免疫反应生成抗体的物质。B淋巴细胞响应外来物（抗原）而产生并分泌的，能够与对应抗原特异性结合的免疫球蛋白。注：免疫球蛋白是抗体的常见同义词。过敏原allergen能够诱发机体发生过敏反应的抗原物质，如来源于花粉、螨虫、霉菌、蟑螂或宠物等的特异性蛋白。注：花粉、螨虫过敏原示例见附录A。去除过敏原allergenreduction采用物理、化学、生物等方法减少或去除作用对象上过敏原的过程。过敏原去除活性reductionactivityofallergen在规定条件下试验后，试样过敏原浓度比空白对照组过敏原浓度减少的百分比。DB32/T5359—20262注1：以过敏原去除率表示。注2：有未经整理纺织品样品作为参比对照时，试验后，比较试样过敏原浓度比未经整理试样过敏原浓度减少的百分比。过敏原去除剂allergenreductionagents能够降低过敏原浓度的无机、有机化学物质，或生物学物质。经整理纺织品treatedtextiles经过敏原去除剂整理的纺织品。未经整理纺织品untreatedtextiles未经过敏原去除剂整理，材质和性能与经整理纺织品相同或相似的纺织品。注：测试中用作参比对照。酶联免疫吸附法Enzyme⁃linkedimmunosorbentassay；ELISA利用抗体（3.2）或抗原（3.1）与酶共价结合原理的测试方法。注：以酶作为标记指示物，以抗原抗体反应为基础，通过色原呈色程度进行结果判断的固相吸附测试方法。4原理在试样和对照上，滴加一定浓度的过敏原工作溶液，在规定的温度下，接触、孵育一定时间，用ELI⁃SA法测定试样和对照上过敏原的浓度。通过比较接触、孵育后试样与对照上剩余过敏原浓度，计算过敏原去除率，以此表示试样的过敏原去除活性，评价试样去除过敏原的效果。5试剂和材料5.1通则所有试剂和材料应适用于生物学试验。5.2水符合GB/T6682规定的三级水。5.3磷酸盐缓冲溶液（PBS）氯化钠8.0g氯化钾0.2g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.83g水定容至1000mL5.4含吐温⁃20的磷酸盐缓冲溶液（PBST）吐温⁃20（Tween⁃20）0.5mLPBS（5.2）定容至1000mLDB32/T5359—202635.5过敏原溶液于-20℃或以下温度保存过敏原溶液。于生物安全柜中，操作过敏原溶液。5.6过敏原工作溶液取已知浓度的过敏原溶液，用PBST（5.4）稀释，配制成浓度为10ng/mL~20ng/mL的过敏原工作溶液。如需要，浓度可调至100ng/mL。工作溶液现用现配。于生物安全柜中，操作过敏原工作溶液。5.7过敏原测定ELISA试剂盒5.7.1过敏原测定ELISA试剂盒组成见附录B。试剂盒按照GB/T33411评价，检出限不低于0.5ng/mL。5.7.2可购买市售试剂盒并按照说明配制和使用。检出限不低于0.5ng/mL。6仪器与设备6.2天平：精确度0.1g和0.0001g。6.3微量可调移液器及配套吸头：10μL、200μL、1000μL。6.4冰箱：工作温度范围2℃~8℃和（-20±2)℃。6.5生物安全柜：Ⅱ级。6.6培养箱：工作温度（25±1)℃,（37±1)℃。6.7酶标仪：波长范围450nm~620nm，最大允许误差：±5nm。6.8聚乙烯自封袋60±2）mm×（85±2)mm。6.9凝胶过滤柱：填料为葡聚糖凝胶G⁃25；凝胶颗粒直径为85μm~260μm。7测试准备7.1试样按照表1规定大小或重量，直接剪取或称取试样。共制备试样6个，其中3个用于灵敏度验证试验表1试样制备样品类型样品规格a/g试样≥0.40（50±2)mm×（50±2)mm<0.40（0.40±0.05)g—（0.40±0.05)ga尺寸为（50±2)mm×（50±2)mm的织物试样重量。DB32/T5359—20264取3个聚乙烯自封袋（6.8）作为空白对照。如有未经整理纺织品样品，可作为参比对照。按照表1规定，制备6个未经整理试样，其中3个用于7.3ELISA灵敏度验证试验7.3.1.2如有作为参比对照的未经整理试样（7.2.2取3个分别放入3个聚乙烯自封袋（6.8各加入7.3.1.3折叠自封袋中的试样（或作为参比对照的未经整理试样不少于4层，立即挤压试样数次，取出试样，回收样液。7.3.1.4用移液器分别取各自封袋中回收液100μL，加入相应过敏原抗体包被板（B.1）微孔中。每份回收液各2孔。7.3.1.7用移液器吸取100μL过敏原工作溶液（5.6）加入包被板（B.1）各微孔中，参照附录C方法完成测试。利用标准曲线计算过敏原浓度，单位为ng/mL，保留2位小数。计算试样和阴性对照的过敏原浓度，ELISA灵敏度验证应满足公式（1n-St)Sn×100|<20%…………（1）式中：Sn——3个阴性对照测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数；St——3个试样回收液测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数。如有作为参比对照的未经整理试样，则ELISA灵敏度验证应满足公式（2n-Su)Sn×100|<20%…………（2）式中：Su——3个未经整理试样回收液测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数。上述数值<20%时，说明样品基质（除分析物外的化学物质）没有影响ELISA测试结果准确性。如果数值≥20%，说明回收液（7.3.1.4）中所含化学物质对ELISA测试结果产生影响，需将回收液纯化后再验证，按照7.3.3操作。7.3.3回收液纯化及验证7.3.3.1用移液器将各自封袋袋中的回收液（7.3.1.4）转移至凝胶过滤柱（6.9）。按照市售过滤柱说明书DB32/T5359—20265进行纯化操作，回收滤液。7.3.3.2分别取各滤液100μL，加入包被板（B.1）微孔中。每份样液各2孔。7.3.3.3其余操作同7.3.1.5~7.3.1.7。7.3.3.4按照7.3.2验证，直至数值<20%。8过敏原标准曲线绘制8.1选取浓度介于检测限浓度与20ng/mL之间的7个点绘制过敏原标准曲线。8.2采用2倍稀释，用PBST（5.4）稀释已知准确浓度的过敏原标准溶液。8.3用移液器吸取100μL各浓度过敏原标准溶液，加入过敏原抗体包被板（B.1）微孔中。每个浓度8.4参照附录C方法，测定各浓度过敏原标准溶液对应的450nm处的吸光度值（OD）。8.5参见附录D，绘制过敏原标准曲线。每次试验均绘制标准曲线。经适当验证后，其他过敏原标准曲线也可使用。9测试步骤9.1准备取3个试样（7.1）分别放入3个聚乙烯自封袋（6.8用移液器吸取1000μL过敏原工作溶液（5.6滴加在试样中心，封口。如试样吸收过敏原工作溶液过多，导致自封袋中样液过少，可增加过敏原溶液至取3个聚乙烯自封袋（6.8加入与9.1.1相同体积的过敏原工作溶液，封口。9.1.2.2参比对照如有未经整理试样作为参比对照（7.2.2取3个分别放入3个聚乙烯自封袋（6.8用移液器吸取与9.1.1相同体积的过敏原工作溶液（5.6滴加在未经整理试样中心，封口。9.2接触孵育将准备好的自封袋（9.1）放入培养箱（6.6）中，25℃,静置，接触孵育2h。协议双方可根据需要规定孵育时间，不宜超过24h。9.3样液回收静置孵育结束后，折叠自封袋中的试样，不少于4层，挤压试样数次后，取出试样（或作为参比对照的未经整理试样回收样液。如ELISA灵敏度验证试验（7.3）中，回收液经纯化操作，此处经回收的样液按照7.3.3.1进行纯化操作。DB32/T5359—202669.4ELISA测定用移液器分别取各自封袋中溶液或纯化回收的溶液100μL，加入过敏原抗体包被板（B.1）微孔中。每份样液各2孔。参照附录C方法，完成测定。利用标准曲线计算过敏原浓度，单位为ng/mL，保留2位小数。10过敏原去除率计算与表示比较试样与空白对照的过敏原质量浓度，按公式（3）计算过敏原去除率。P=(Rb-Rt)Rb×100 式中：P——过敏原去除率，以百分比（%）表示，保留2位小数；Rb——接触孵育2h后，3个空白对照测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数；Rt——接触孵育2h后，3个试样回收液测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数。如果有作为参比对照的未经整理试样，经协商，按公式（4）计算过敏原去除率。P=(Ru-Rt)Ru×100…………（4）式中：Ru——接触孵育2h后，3个未经整理试样回收液测得的过敏原均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数。如有未经整理纺织品样品作为参比对照，可参照附录E计算方法的过敏原回收率。回收率可验证方法的准确性和可靠性。12重复性和再现性实验室间比对已由5个实验室参与进行，结果参见附录F。重复性和再现性根据附录F计算，结果参见附录G。13测试报告测试报告应包含以下信息：a）采用的文件（本文件编号b）样品信息；d）测试结果，如以未经整理试样作为参比对照计算过敏原去除率，请注明；e）任何偏离本文件的细节和异常；f）测试日期；g）如商用ELISA试剂盒，详细注明生产商、产品名称、产品编号或批号等信息。DB32/T5359—20267（资料性）花粉、螨虫过敏原本文件中所使用的来源于花粉、螨虫的过敏原示例见表A.1。适当验证后，可使用其他过敏原。表A.1本文件中所使用花粉、螨虫过敏原过敏原来源过敏原种类花粉日本柳杉（Cryptomeriajaponica）花粉过敏原Cryj1螨虫粉尘螨（Dermatophagoidesfarinae）过敏原Derf1粉尘螨（Dermatophagoidesfarinae）过敏原Derf2DB32/T5359—20268（资料性）试剂盒组成示例B.1过敏原抗体（一抗）包被板B.1.1过敏原抗体溶液过敏原抗体50~200μgPBS（5.3）定容至50mL配制后立即使用。B.1.2用移液器吸取100μL过敏原抗体溶液（附录B.1.1）加入酶标板的各微孔中，4℃,孵育18h，制得过敏原抗体包被板。注：过敏原抗体包被板是指微孔表面包被有对应过敏原抗体的酶标板。B.2酶标记的过敏原检测抗体（二抗）溶液牛血清白蛋白0.5g酶标记的过敏原检测抗体1个合适的单位PBST（5.4）定容至50mL完全溶解后，使用前置于4℃保存。配制后4h内使用。B.3显色液B.3.1底物A液醋酸钠柠檬酸过氧化氢（30%）水B.3.2底物B液醋酸钠柠檬酸水13.6g1.6g0.3mL定容至1000mL13.6g1.6g0.2g定容至1000mLB.4终止液浓硫酸（98%）54.3mL水定容至1000mL完全混匀后，使用前置于室温保存。DB32/T5359—20269（资料性）酶联免疫吸附法：夹心ELISA法C.1包被板（B.1）各微孔中加入100μl含有过敏原的溶液后，37℃,静置孵育60min。去除微孔中液体。C.2用移液器吸取300μLPBST（5.4）洗涤包被板，重复洗板步骤，共洗3次。此步骤可用洗板机完成。将微孔板倒置洁净的吸水纸上，去除剩余残液。C.3用移液器吸取100μL酶标记的过敏原检测抗体溶液（B.2）加入包被板各微孔中，37℃,静置孵育30min。去除微孔中液体。C.4重复C.2操作。C.6用移液器吸取50μL的终止液（B.4）加入包被板各微孔中，终止反应。待测。C.7用酶标仪（6.7）在450nm下读取并记录各微孔中的吸光度值（OD）。读取数据在加入终止液后30min内进行，否则将影响检测结果。过敏原标准曲线使用4参数logistic的过敏原标准曲线的示例见图D.1。校准曲线的回归方程通常由ELISA试剂盒生产商通过计算软件编制。如没有，可通过商用统计软件计算。0.10.1图D.1过敏原标准曲线示例DB32/T5359—2026（资料性） 回收率E.1回收率的计算与表示接触孵育后，比较作为参比对照的未经整理试样回收液与空白对照的过敏原浓度，按公式（E.1）计算过敏原回收率。R=RuRb×100…………（E.1）式中：R——过敏原回收率（%保留2位小数；Rb——接触孵育2h后，3个空白对照测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL保留2位小数；Ru——接触孵育2h后，3个未经整理试样回收液测得的过敏原浓度（ng/mL）均值，保留2位小数。E.2回收率参考回收率宜≥70%，示例参见表F.4和表F.5。DB32/T5359—2026（资料性）实验室间对比结果F.1参与者五个实验室参与实验室间比对。F.2试验条件试验用材料及测试条件见表F.1。表F.1材料及测试条件项目内容样品A100%聚酯机织物130±5)g/m2，经过敏原去除剂A整理参比对照A100%聚酯机织物130±5)g/m2，未经过敏原去除剂整理样品B100%聚酯机织物130±5)g/m2，经过敏原去除剂B整理参比对照B100%聚酯机织物130±5)g/m2，未经过敏原去除剂整理阴性对照/空白对照PBST/聚乙烯自封袋过敏原粉尘螨（Dermatophagoidesfarinae）过敏原Derf2过敏原用量1000μL接触孵育条件F.3测试结果F.3.1ELISA灵敏度验证试验各实验室ELISA灵敏度验证试验结果见表F.2。灵敏度验证值见表F.3，所有实验室均满足灵敏度验证要求。表F.2各实验室灵敏度验证试验结果实验室编号试验后过敏原浓度/（ng/mL）阴性对照样品A（St⁃A）参比对照A（Su⁃A）样品B（St⁃B）参比对照B（Su⁃B）12.442.392.252.372.2522.041.961.972.011.9732.392.232.272.152.2742.592.452.362.412.3652.412.272.322.182.32DB32/T5359—2026表F.3各实验室灵敏度验证值实验室编号验证值a/%阴性对照（Sn）样品A（St⁃A）参比对照A（Su⁃A）样品B（St⁃B）参比对照B（Su⁃B）1—1.807.632.657.632—3.873.121.503.123—6.374.999.974.994—5.369.016.969.015—5.763.759.543.75验证要求<20%a验证值按照|（Sn-St）/Sn×100|或|（Sn-Su）/Sn×100|计算。F.3.2过敏原去除活性测试样品A的过敏原去除活性测试结果见表F.4。样品B的过敏原去除活性测试结果见表F.5。表F.4样品A的过敏原去除活性测试结果实验室编号试验组编号试验后过敏原浓度/（ng/mL）过敏原去除率a%回收率b%初始浓度ng/mL空白对照Rb样品ARt参比对照ARu1组116.290.2415.1898.4493.1616.46组216.290.2915.0798.0592.5116.462组116.440.0016.31100.0099.2216.62组216.440.2216.2198.6398.5816.623组119.670.6018.8196.8295.6219.88组219.670.5519.4597.1898.9019.884组117.990.0015.03100.0083.5618.91组217.990.0015.17100.0084.3118.915组118.100.4417.3397.4695.7718.99组218.100.4717.3097.2795.6018.99均值17.700.2816.5998.3993.7218.17a过敏原去除率按照P=（Ru-Rt）/Ru×100计算。b回收率按照R=Ru/Rb×100计算。DB32/T5359—2026表F.5样品B的过敏原去除活性测试结果实验室编号试验组编号试验后过敏原浓度/（ng/mL）过敏原去除率a/%回收率b/%初始浓度/ng/mL空白对照样品B（Rt）参比对照B1组1组22组1组23组1组24组1组25组1组2均值a过敏原去除率按照P=（Ru-Rt）/Ru×100计算。b回收率按照R=Ru/Rb×100计算。DB32/T5359—2026（资料性）重复性和再现性根据ISO5752⁃2的统计分析，利用附录F所述的实验室间比对结果，确定该方法的重复性和再现性。表G.1过敏原去除率测试重复性与再现性验证总表实验室编号测试样本组1/%组2/%1样品A98.4498.05样品B1001002样品A10