微生物的生长及控制课件

微生物的生长及控制1直接测定：直接测定细胞的数量或重量；间接测定：以培养液中细胞组分的变化和代谢活动等为测定指标。单细胞微生物：测定细胞数、细胞重量为生长指标；多细胞微生物：丝状真菌，常以菌丝生长的长度、菌丝的重量为生长指标。一、微生物测定生长繁殖的方法微生物依据种类的不同采用不同的测定方法2直接法①显微镜计数法②比色法（比浊法）③干重测定法④菌丝长度测定⑤细胞堆积体积测定法⑥平皿菌落计数法⑦稀释平板法⑧粒子计数器法

①依细胞组分含量估算②依培养基成分消耗估算③依细胞代谢产物估算④依发酵液的粘度来估算⑤依发酵液的放热量估算间接法3

测生长量比色法（比浊法）：450-650nm波段生理指标法：测含氮量、含磷量、DNA、

RNA、ATP、几丁质（组成份）；产酸、产气、耗氧、粘度、产热（代谢指标）等等干重法（精确）

测体积（粗放）直接法间接法4血球计数器

用血球计数板计算死细胞在内的总菌数，用染料鉴别死活细胞（美蓝染色酵母菌，活细胞无色、死细胞兰色）。血球计数板法（计繁殖数）5注意：培养基成分不能在此波长下有吸收。样品颜色过深或有颗粒不行；不适用多细胞测定。

测定悬液中细胞数量。适宜单细胞计数因为菌体不透光，一定浓度范围内，菌细胞数与光密度成正比。选600-700nm之间的某一波长进行比色测定。比浊计数法6菌数/mL=cfuX稀释度X10平板计数法活菌记数7二、微生物生长规律及培养方法

依据研究及生产目的不同，微生物培养方法也不同。依据培养方法有别其生长规律也不同。研究生长要从个体生长和群体生长两方面去考虑。（一）分批培养（二）连续培养（三）同步培养（四）高密度培养8适用于单细胞微生物（一）分批培养

将少量微生物接种到一定体积的新鲜液体培养基中，微生物群体则由小到大，由少到多进行有规律的生长繁殖。如果以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标就可画出一条曲线即微生物的典型生长曲线。微生物的典型生长曲线(growthcurve)9延迟期指数期稳定期衰亡期根据生长速率不同，可将生长曲线分为四个时期：延迟期、对数期、稳定期、衰亡期。10特征：不立即繁殖，菌数稍有下降。合成代谢活跃，细胞形态变大，对外界不良环境敏感。原因：调整代谢，合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。消除：调整接种量、菌龄、培养基成分2、对数期（指数期）(exponentialphase)特征：代谢活性最强，生长速率最大，呈几何级数增加，代时最短。对不良环境因素的抵抗力强。细菌数目增加，与菌液浊度增加呈正相关性。代时：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。影响代时因素：菌种、营养成分、营养物浓度（很低时影响）、培养温度。1、延迟期(停滞期、调整期）(lagphase)11G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)

X2=X1·2n两边取对数：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)

指数期x2x1t1t2三个重要参数：①繁殖代数(n)②生长速率常数(R)③代时(G)影响代时长短的因素（1）菌种（2）营养成分（3）营养物浓度（4）培养温度细胞数或菌体量时间8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响

指数期133、稳定期

(最高生长期、静止期）

(stationaryphase)

表现：新增殖细胞数与老细胞死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。生长速率趋于0，细胞总数最高。原因：养分减少，有毒代谢物产生，细胞内开始积累贮存物，收获菌体多在此阶段，也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段。14

稳定期①生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；②菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数Y表示；Y=(X-X0)/C0-C=(X-X0)/C0

X：稳定期的细胞干重(g/ml培养液）X0：刚接种时的细胞干重C0

：限制性营养物的最初浓度(g/ml)C：稳定时期限制性营养物的浓度15③通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；①对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(乳酸)等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：②对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；稳定期的实践意义16

在废水生物处理设计时，应根据废水的水质情况即所含有机质浓度，利用不同生长阶段的微生物处理废水。废水处理的活性污泥法是利用生长下降阶段的微生物即减速期、静止期的微生物。细菌生长曲线在污（废）水微生物

处理中的应用17其一，对数期的微生物生长代谢快、活力强、虽然去除有机物的能力强，但相应的要求进水有机物浓度也高，这样，出水有机物的绝对值也相应提高，不易达到排放标准。其二，对数期的微生物繁殖旺盛，细胞表面的粘液层和夹膜尚未形成，运动活跃，不易形成菌胶团，沉淀性能差，致使出水质量也差。

减速期、静止期的微生物仍有相当的代谢活力，并且，形成了粘液层、夹膜，体内积累了大量的贮存物质，强化了微生物的吸附能力，聚合力强，易形成菌胶团，使泥和水易分层，去除有机物的效果仍然较好，出水质量好。为什么不用对数生长期的微生物处理污水？18丝状真菌，细胞数目不呈几何级数增加，无对数生长期，一般有调整期，最高生长期，衰退期。4、衰亡期(deathphase)

表现：出现

“负生长

”，个体死亡速度超过新生速度；细胞形态发生变化，出现畸形；有些细胞开始自溶；有的合成或释放次生代谢产物；芽孢此期释放。营养物尤其是生长限制因子的耗尽；有害代谢产物的累计；理化条件的不适宜等。19（二）连续培养

将微生物置于一定容积的培养基中，当培养至指数期的后期时，不断补充新鲜营养，并及时不断以同样速度排出培养物延长对数期，保证容器内总菌量不变。这样，微生物的生长可长期保持在平衡状态，从而形成连续生长。1、恒浊连续培养2、恒化连续培养201.恒浊器(turbidostat)是一种根据培养器内微生物的生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液（营养物浓度）保持恒定的连续培养方法。主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。212、恒化器(chemostat)是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置；主要获得不同生长速率的菌体；又称恒组成连续培养。适用于废水处理22恒浊与恒化培养控制装置23装置恒浊器恒化器控制对象菌体密度(内控制)培养基流速(外控制)培养基无限制生长因子有限制生长因子培养基流速不恒定恒定生长速率最高速率低于最高速率产物大量菌体或与菌体相平行的代谢产物不同生长速率的菌体应用范围生产为主实验室为主

Turbidostat&chemostat的比较分批培养与连续培养的比较25连续培养的优缺点优点高效自控产品质量稳定节约动力、人力、水和蒸汽等缺点菌种容易退化容易污染杂菌营养物的利用率低于单批培养26（三）同步生长培养法：

设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中。通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。

目的：研究某类单细胞的阶段性细胞学特性、生物化学特性等。27（四）高密度培养

也称高密度发酵，是指微生物在液体培养中，细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。应用：基因工程菌生产多肽类药物，如人生长素、胰岛

素、人干扰素等目前，主要局限于E.coli

andS.cerevisiae等兼性厌氧菌；28三、影响微生物生长的主要因素（一）温度（二）氧气（三）酸碱度（pH）（四）其它（渗透压、氧化还原电位、阳光等）29（一）温度(temperature)生长温度三基点：最低、最适、最高（与进化过程中所处的生存环境温度有关）实验室中霉菌、酵母菌和放线菌经常采用的温度是28-32℃；多数藻类是28-30℃；废水生物处理中微生物的适宜温度是30℃左右。30不同生物的温度极限红色为古细菌，蓝色为细菌，浅绿色为藻类，棕色为真菌，黄色为原生动物，绿色为植物，紫色是动物。31生长温度三基点最低：嗜超冷菌，一般为-10℃—-5℃，极端为-30℃

嗜冷菌：﹤

-20℃（一般为-15℃

）嗜温菌（20-45℃

）室温菌：约25℃最适：体温菌：约37℃

嗜热菌：﹥45℃（一般为50-60℃）

最高：嗜超热菌，一般为80-95℃，极端为105-150℃微生物生长温度类型32根据温度对微生物的影响分类

来自嗜热菌的酶可在高温下稳定的催化生物化学反应。其中由Thermusaquaticus中分离出来的DNA聚合酶Taqpolymerase已广泛应用于PCR反应。

（二）氧气(oxygen)

自然环境中，氧的多寡决定着微生物的种类，种类不同对氧的要求也不同。各种微生物要求的氧化还原电位不同。好氧菌一般要求较高：+0.3-+0.4V，而专性厌氧菌只能在0.1V以下甚至为负值时才能生长。兼性厌氧菌在0.1V以上时行有氧呼吸，以下时行无氧呼吸或发酵作用。34

好氧菌(Aerobes)1.专性好氧菌(obligateaerobes)

必须有氧存在2.兼性好氧菌(facultativeaerobes)

有氧无氧均可，但有氧更好3.微好氧菌(microaerophilicaerobes)

只在较低的氧分压下生长

厌氧菌(anaerobes)4.耐氧菌(aerotolerantanaerobes)

不需氧，但有氧也能生存，氧无毒害5.专性厌氧菌(obligate/strictanaerobes)

氧有毒害，甚至致死依据微生物与氧的关系分类微生物与氧的关系

必需有O2

（溶解氧）才能生长。有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，具有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（多数真菌和细菌、放线菌都是专性好氧菌）。①分子氧对它们有毒，即使短期内接触也会抑制或致死；②只在深层无氧条件下才能生长；③通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等获得生命所需的能量；④缺乏过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素氧化酶（常见的厌氧菌：梭菌属、梭杆菌属、双歧杆菌、光和细菌和产甲烷菌等）。专性好氧菌特点专性厌氧菌特点37去除·O2-等有害活性氧分子的机制H2O+1/2O22H2O2·O2-+2H+H2O2+O2SOD一切好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶一切好氧生物NADH2NAD过氧化物酶耐氧菌O2－＋2H＋O2

＋e－

O2

超氧阴离子自由基是活性氧的一种，可破坏生物大分子和膜结构38放线菌：喜欢在中性和偏碱性环境中生长，

pH值7.5-8.0.霉菌、酵母菌：喜欢在酸性和偏酸性环境中生长，pH值3-6。

大多数微生物最适pH值为中性左右（pH6.5-7.5）。pH值适应范围是4-10。同一种微生物的不同生长阶段，有不同的pH值要求。微生物在培养过程中，培养基的pH值会发生变化。（三）pH39不同生物的pH极限红色为古细菌，蓝色为细菌，浅绿色为藻类，棕色为真菌，黄色为原生动物，绿色为植物，紫色是动物。40嗜碱微生物（basophile）多数放线菌、硝化细菌、根瘤菌等耐碱微生物（basotolerantmicroorganism）若干链霉菌嗜酸微生物（acidophile）多数真菌耐酸微生物(acidotolerantmicroorganism)乳酸杆菌、醋酸杆菌，许多肠杆菌等41

净化污、废水的微生物适应pH变化的能力强，爆气池中的pH一般维持在6.5-8.5均可，大多数细菌、藻类、放线菌和原生动物等在此pH值下，均能生长繁殖，形成菌溶胶，获得良好的净化效果。酸性条件不利于细菌和原生动物生长，而有利于霉菌和酵母菌生长，如果活性污泥中有大量的霉菌繁殖，则霉菌不分泌粘性物质，使污泥的絮凝性不好，结构分散、不利于沉淀，甚至导致活性污泥丝状膨胀。pH值影响污、废水净化42（四）其它影响因素太阳辐射影响：太阳光中380-760nm可见光是蓝细菌和藻类进行光和作用的主要能源；1000nm红外光能被不产氧的光和细菌利用。氧还电位、太阳辐射、水活度、渗透压等因素也影响微生物的生长繁殖。水活度(aw)影响：大多数微生物在水活度为0.95-0.99时生长好渗透压影响：等渗溶液：微生物生长好低渗溶液：细胞膨胀或破裂高渗溶液：细胞质壁分离氧还电位影响：好氧菌：Eh为+300~+600mV厌氧菌：Eh为-200~-400mV43微生物培养方法生产实践实验室培养法固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养四、微生物培养法概论为了保证微生物大量生长繁殖和产生有益代谢产物，培养方法是关键。实验室培养法和生产实际中的培养法不同。（一）好氧菌的实验室培养固体培养试管斜面培养皿琼脂平板液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养（振荡培养）台式发酵罐培养好氧菌液体培养前提是保证培养液中始终有较高的溶解氧。45（二）厌氧菌的实验室培养高层琼脂柱需要特殊的培养装置：厌氧培养皿、厌氧手套箱、厌氧培养基（加还原剂）46Hungate

滚管47厌氧罐技术48厌氧手套箱49液体培养：①浅盘培养：②深层液体通气培养：大型发酵罐（也称生物反应器）进行深层液体通气搅拌培养（三）生产中的培养固体培养：①好氧菌的曲法培养：以麸皮、碎麦或豆饼等做固体基质（瓶曲、袋曲、盘曲等）②厌氧菌的堆积培养：酵母菌的酒精深层地窖堆积发酵50五、有害微生物的控制（二）灭菌方法1、高温灭菌（干热和湿热）2、过滤灭菌3、射线灭菌4、化学药剂灭菌（一）基本概念1、灭菌2、消毒3、防腐4、化疗511、灭菌

(sterilization)总菌数活菌数细胞数的对数细胞数的对数时间时间杀菌溶菌（一）基本概念

采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。即彻底杀死一切微生物（杀菌或溶菌）。高温灭菌、辐射灭菌522、消毒(disinfection)

采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。即仅杀死病原菌。

常用的对皮肤、水果、饮料、牛奶等的消毒533、防腐

(antisepsis)抑制霉菌微生物对食品、生物制品的侵染措施。防腐常用措施：低温储藏、缺氧（抽真空、充氮或二氧化碳，加除氧剂）、干燥（晒干，烘干，红外线干燥，喷雾干燥）、高渗（盐腌、糖渍）、高酸度（乳酸、醋酸）、高醇度（白酒、酒精）、防腐剂（苯甲酸、山梨酸）。544、化学治疗

(chemotherapy)抑制宿主体内的病原菌而对宿主无害利用具有高度选择毒力即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗的化学物质称化学治疗剂；一些重要的化学治疗剂种类：各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等55比较项目灭菌消毒防腐化疗处理因素强理、化因素理、化因素理、化因素化学治疗剂处理对象任何物体内外的一切微生物物体表面的病原菌物体内外的一切微生物宿主体内的病原菌作用效果彻底杀灭杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死实例加压蒸汽灭菌，辐射灭菌，杀菌剂70%酒精消毒，巴氏消毒法冷藏、干燥、糖渍、盐腌、缺氧、防腐剂抗生素、磺胺药、生物药物素灭菌、消毒、防腐和化疗的比较1、高温杀菌（物理方法））高温灭菌干热灭菌法火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法湿热灭菌(消毒)法常压下加压下巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法常规加压灭菌法连续加压灭菌法LTH法HTST法（二）灭菌方法原理：引起蛋白质、核酸和脂类等重要生物高分子发生降解或改变空间结构，从而变性或被破坏57①火焰灼烧法：适用于接种环、接种针的灭菌或带有病原菌的材料、动物尸体的焚烧等；②电烘箱灭菌：适用于玻璃器皿等的灭菌。电烘箱内温度150-170℃，维持1-2h后，可彻底灭菌。干热灭菌法灭菌彻底（包括细菌芽孢），菌体蛋白变性、原生质干燥、膜等细胞组分发生氧化变质。58温度不同，杀菌效果也不同。60℃/5-10min可杀死细菌和真菌的营养细胞，80℃下杀死酵母菌细胞和真菌孢子，120℃/15min能杀死细菌的芽孢。湿热灭菌法依据温度和压力条件分类常压法：巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法高压法：高压蒸汽灭菌法、连续加压蒸汽灭菌法59比较项目干热90℃90℃相对湿度20%80%白喉棒杆菌24h2h2min痢疾杆菌3h2h2min伤寒杆菌3h2h2min葡萄球菌8h3h2min干热与湿热空气对不同细胞的致死时间相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌好①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；②热蒸汽比热空气穿透力更强；③蒸汽存在潜热，当气体转变成液体时可放出大量热量；④可迅速提高灭菌物体的温度。60巴氏消毒法低温维持法(Lowtemperatureholdingmethod,LTH)63℃30min高温瞬时法(Hightemperatureshorttime,HTST)72℃15s巴氏消毒法

是一种低温湿热消毒法。适用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜高温灭菌的液体饮料等。61间歇灭菌法

(fractionalsterilization)煮沸消毒法：100℃下煮沸数分钟，适用于饮用水的消毒

又叫分段灭菌法或丁达尔灭菌法，适用于不耐热培养基的灭菌。80-100℃下蒸煮15-60min后放置过夜，诱使其中的芽孢萌发，第二天用同样方法蒸煮和保温过夜，连续重复3次。如硫细菌的含硫培养基采用此法灭菌。62高压蒸汽灭菌法

用121℃、15-20min、1kg/cm2的加压蒸汽进行灭菌。广泛使用的方法。适用于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵厂中的对培养基及多种器材或物料的灭菌。连续加压蒸汽灭菌法（一般了解）：

使培养基在管道流动过程中快速升温、维持和冷却然后流入发酵灌，135-140℃下维持5-15S即高温瞬时灭菌，即彻底地灭了菌又有效地减少养分的破坏适用于发酵厂的大批培养基灭菌，如抗生素发酵。63高压蒸汽灭菌锅构造①压力表②安全阀③放气阀④软管⑤紧固螺栓⑤灭菌桶⑦筛架⑧水手提式高压蒸汽灭菌锅64高压蒸汽灭菌锅使用方法①加水至止水线；②灭菌物包裹好、放入；③开启放气阀；④加热排气；⑤达到预定表压，开始计时；⑥关闭热源，当压力指针归0时，缓慢开启放气阀。65①灭菌物的含菌量：菌多，时间长②灭菌锅内空气排除程度：排尽空气③灭菌对象的pH：pH小于6的微生物易死④灭菌对象的体积：体积大，灭菌时间延长⑤加热与散热速度：及时散热，灭菌时间过长破坏培养基的成分（形成沉淀物，褐变，降低pH和浓度）。影响加压蒸汽灭菌效果的因素66对于抗生素等不耐热成分采用过滤除菌法2、过滤除菌673、射线灭菌

最常用的是紫外线（波长为260nm左右）灭菌。紫外辐射对微生物有致死作用。68紫外线能引起DNA链上的两个邻近的胸腺嘧啶分子形成胸腺嘧啶二聚体（T=T），致使DNA不能复制，导致微生物死亡。694、化学药剂灭菌（1）表面消毒剂(surfacedisinfactant)：是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。（2）化学治疗剂(chemotherapeutant)：指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂。依来源分两类：人工合成(主要是一些生长因子类似物：磺胺类药物）；微生物产生（抗生素）70类型名称及使用浓度作用机制应用范围醇类70-75%乙醇使膜损伤、蛋白质变性皮肤、器械醛类0.5-10%甲醛破坏蛋白质氢键或氨基物品消毒，接种箱、接种室的熏蒸酚类3-5%石炭酸蛋白质变性，损伤细胞膜地面、家具、器皿表面活性剂类0.05-0.1%新洁而灭蛋白质变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、手术器械染料2-4%龙胆紫与蛋白质羧基结合皮肤、伤口氧化剂类0.1%高锰酸钾氧化蛋白质的活性基团皮肤、尿道3%双氧水污染物件表面重金属类2%红汞与蛋白质的巯基结合使失活皮肤、伤口0.1-0.5%硫酸铜植物病原菌酸碱类5-10%醋酸破坏细胞膜和蛋白质房间消毒（1）常用表面消毒剂及应用影响消毒剂作用的因素消毒剂种类浓度作用时间细菌菌龄种类

环境有机物温度酸碱度对氨基苯甲酸（PABA）

(正常代谢物）

磺胺

(代谢物拮抗物）磺胺类药物的杀菌机制—PABA代谢类似物（2）化学治疗剂—

磺胺类药物

是第一个发现的生长因子类似物药物；也是人类第一个成功地用于特异性抑制某种微生物的生长来治疗疾病的化学治疗剂73二氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶四氢叶酸辅酶F核酸合成细菌体内合成叶酸二氢蝶啶二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶PABA（对氨基苯甲酸）Glu74二氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶四氢叶酸辅酶F核酸合成磺胺药TMPTMP(三甲基苄二氨嘧啶)——磺胺增效剂细菌体内叶酸合成受阻二氢蝶啶二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶PABA假二氢叶酸75

一类由微生物或其他生物合成的次生代谢产物或人工衍生物。它们在很低浓度时就能抑制或干扰他种生物（包括病原菌、病毒和癌细胞等)的生命活动。目前临床上应用的抗生素仅五