重组DNA技术的基本工具（第二课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章第1节人教版选择性必修302DNA连接酶—“分子缝合针”二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’3’5’5’3’目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？某DNA片段5’3’3’5’某DNA片段……TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG…………AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC……5’3’3’5’你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’某DNA片段5’3’3’5’你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段如何将他们连接起来呢？它们具有相同的黏性末端!5’3’3’5’二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段如何将他们连接起来呢？DNA连接酶—“分子缝合针”它们具有相同的黏性末端!恢复被限制酶切开的磷酸二酯键完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键“缝”上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样。二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段如何将他们连接起来呢？DNA连接酶—“分子缝合针”它们具有相同的黏性末端!恢复被限制酶切开的磷酸二酯键完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键“缝”上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样。二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段如何将他们连接起来呢？DNA连接酶—“分子缝合针”它们具有相同的黏性末端!恢复被限制酶切开的磷酸二酯键磷酸二酯键形成完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键“缝”上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样。二DNA连接酶—“分子缝合针”苏-基因2Bt基因5’3’3’5’用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段如何将他们连接起来呢？DNA连接酶—“分子缝合针”它们具有相同的黏性末端!恢复被限制酶切开的磷酸二酯键磷酸二酯键形成完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键“缝”上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样。DNA连接酶:一种能够将两个DNA片段连接起来的酶片段1片段2片段3二DNA连接酶—“分子缝合针”5’3’3’5’DNA连接酶:一种能够将两个DNA片段连接起来的酶片段1片段2片段3将片段1与片段2连接将片段2与片段3连接DNA连接酶DNA连接酶种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源作用差别2分子缝合针——DNA连接酶如何将目的基因和载体连接形成重组DNA？将

连接起来，恢复被限制酶切开的

。

1、作用：注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）两个DNA片段磷酸二酯键2、种类：E.coliDNA连接酶连接平末端时效率远低于T4DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。E.coli

DNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体3.E·coliDNA连接酶的作用两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能连接起来。2分子缝合针——DNA连接酶DNA连接酶→磷酸二酯键DNA连接酶→磷酸二酯键DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA!DNA连接酶作用没有特异性。可以连接多种末端T4DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。4.T4DNA连接酶的缝合作用2分子缝合针——DNA连接酶DNA连接酶→磷酸二酯键DNA连接酶→磷酸二酯键“分子缝合针”：DNA连接酶02DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？思考注：DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。“分子缝合针”：DNA连接酶02DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质都能催化两个脱氧核苷酸之间形成

；化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都是蛋白质 不需要需要DNA的一条链作模板脱氧核苷酸链连接起来脱氧核苷酸从头合成基因工程DNA复制游离的DNA片段磷酸二酯键游离的脱氧核苷酸DNA连接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用对象作用结果磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNADNA将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链习题巩固根据所学知识，完成以下填空。①限制酶

②解旋酶

③DNA连接酶

④DNA聚合酶

⑤RNA聚合酶A.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：

；b：

。TGAATCTGAATCba磷酸二酯键氢键03基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”2分子运输车重组DNA技术的基本工具2、怎样才能将Bt蛋白基因送入棉花细胞呢？1、能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？

游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。Bt蛋白基因5’3’3’5’拟核DNA质粒细菌结构示意图2分子运输车运载体需具备的条件：条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：对受体细胞无害。问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题1：载体要与目的基因连接，需要具备什么条件？供外源基因插入其中如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因等最常用的载体——质粒一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。其基因属于细胞质基因。基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。便于重组DNA筛选与鉴定DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制最常用的载体——质粒：终止子:

转录的终点，在转录过程中起调控作用。启动子:

转录的起点，在转录过程中起调控作用。质粒DNA分子质量一般为拟核DNA的0.5%~3%2分子运输车三基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”什么是质粒？大肠杆菌细胞拟核DNA质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？复制原点(2)作用不同：拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。(1)分子量不同：拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。“分子运输车”：基因进入受体细胞的载体03最常用的载体——质粒如何筛选出含质粒(载体)的受体细胞？思考提示：质粒(载体)上的标记基因一般是

，而受体细胞本身

抵抗该抗生素的能力。用含有

的培养基培养受体细胞，能够生存的是

。某种抗生素的抗性基因没有该抗生素被导入了载体的受体细胞“分子运输车”：基因进入受体细胞的载体03最常用的载体——质粒根据标记基因的作用，在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因的受体细胞吗？为什么？思考提示：

；原因：导入

的和导入

的受体细胞均能在该培养基中存活。不一定空载体含目的基因载体①空载体(含抗性基因的质粒)氨苄青霉素抗性基因②含目的基因载体(含抗性基因和目的基因的质粒)氨苄青霉素抗性基因目的基因“分子运输车”：基因进入受体细胞的载体03最常用的载体——质粒如何提高筛选的准确性?思考提示：当质粒(载体)上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上含有

标记基因，普通质粒上含有

标记基因。则

的受体细胞不具有标记基因控制的性状，

的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，

的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。未导入导入导入一个两个没有导入质粒导入普通质粒导入重组质粒现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？27g1g2g3请同学找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。实例：重组DNA分子的模拟操作(P73)三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…重组DNA分子GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对?

如果不能，可能是什么原因造成的？

如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能。因为基因的长度一般在100个碱基对以上。三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”用相同的限制酶切割目的基因和运载体。产生相同末端，便于连接。1.目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)目的基因自身环化、质粒的自身环化、目的基因与质粒连接（正反向）三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”单酶切的缺点abcd限制酶切割DNA连接酶连接缺点1缺点2缺点3反向连接重组DNA质粒自身环化目的基因自身环化双酶切用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。双酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd质粒不会重新环化目的基因不会被环化优点1优点2优点3目的基因与质粒不会发生反向连接确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。习题巩固

记！

获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是为了

。但是使用该法缺点是容易发生

以及

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因与质粒反向连接目的基因、质粒的自身环化分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体小结不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选(2)选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时：

。②切割质粒时：

。③切割目的基因和质粒时：

。理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接最好选用不同的限制酶切割三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”四DNA的粗提取与鉴定DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：DNA的粗提取与鉴定4一、实验原理00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度

利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNADNA的粗提取与鉴定4二、材料用具1.材料

富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、研磨液、体积分数为95％的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。2.用具烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：1.破碎细胞——称取

，切碎，放入研钵，倒入

，

研磨。洋葱研磨液充分问题:如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？

研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：2.去除杂质——在漏斗中垫上

过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。纱布上清液上清液问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？

不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：3.DNA的粗提取——在上清液中加入体积相等的

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物用冷却的酒精析出DNA问题:此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。预冷的酒精的优点①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。DNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：3.DNA的粗提取——用玻璃棒沿

搅拌，卷起

，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取

晾干。一个方向沉淀物丝状物问题:为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？

避免破坏DNA用冷却的酒精析出DNADNA的粗提取和鉴定探究.实验三、实验步骤：4.DNA的鉴定——将丝状物或沉淀物溶于

溶液中，加入

试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。二苯胺2mol/L的NaCl空白对照组：

在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。加入2mol/L氯化钠溶液不加入丝状物加入4mL二苯胺试剂加入2mol/L氯化钠溶液加入丝状物加入4mL二苯胺试剂实验组对照组水浴加热DNA的粗提取与鉴定4四、结果分析与评价

二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？

观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。四、结果分析与评价①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。以血液为实验材料时：每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，

分析产生差异的原因。1.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取