CN112585161B 白介素15融合蛋白及其组合物和治疗方法 （医铭康达(北京)生物医药有限公司）

2021.01.04PCT/US2019/03059420WO2019/213517EN2019.11.07司WO2018071918A1,2018.04.19本发明提供了可用于治疗各种不同疾病和2述第四结构单元为小鼠的IL15受体β亚基的细胞外结构域或人类的IL15受体β亚基其中所述第一结构单元被共价连接到所述第四结构单元的C-端，并且所述第二结构其中所述连接物区段L2能够被在肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶识别并水解，所述在肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶是基质金属蛋白酶9述第四结构单元为小鼠的IL15受体β亚基的细胞外结构域或人类的IL15受体β亚基其中所述第二结构单元被共价连接到所述第四结构单元的C-端，并且所述第一结构其中所述连接物区段L2能够被在肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶识别并水解，所述在肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶是基质金属蛋白酶93.权利要求1-2中的任一项所述的融合蛋白，其中所述连接物区段L1还包含多个4.权利要求1-2中的任一项所述的融合蛋白，其中连接到所述第三结构单元的所述连接物区段L1的氨基酸序列为SEQIDNo.5.权利要求1-2中的任一项所述的融合蛋白，其中连接所述第一和第二结构单元的37.权利要求1或2中的任一项所述的融合蛋白，其中所述连接物区段L2的氨基酸序9.权利要求8所述的同二聚体或异二聚体蛋白，其包含RA-IL15-Fc的单体：IL15的融合蛋白，并且所述RA-IL15-Fc的单体的酸序列。氨基酸序列。基酸序列。12.权利要求8所述的同二聚体或异二聚体蛋白，其包含RB-IL15-RA-Fc的单体：IL15-RA-Fc的单体的氨基酸序列为SEQIDNo.28中阐述的氨基13.权利要求8所述的同二聚体或异二聚体蛋白，其包含RB-IL15-RA-Fc的单体：根据权利要求1-7中的任一项所述的融合蛋白，或权利要求8-13中任一项所述的同17.一种蛋白质在制造用于治疗选自淋巴癌肿瘤或结肠癌的药物中的用途，其中所述蛋白质包含治疗有效量的权利要求1-7中的任一项所述的融合蛋白、或权利要求8-13中4聚体或异二聚体蛋白在制备用于治疗或减轻淋巴癌肿瘤或结肠5[0004]白介素15(IL15)这种14–15kDa的糖蛋白是1994年首次发现的一种可溶性细胞因[0005]IL15受体(IL15R)属于造血系统超家族。异三聚体IL15R包含α、β(CD122)和γα可以将IL-15反式呈递到响应细胞例6IL15与IL2相比在治疗癌症中可能具有显著优点。最近的报道显示，IL15与其可溶性受体IL15Rα的预先形成的复合体的给药增加了IL15的半衰期并提高了T和NK细胞的增殖[0017]重要的是，通过柔性肽连接的IL15Rαsushi结构域和IL15的可溶性融合蛋白表现抗肿瘤效果或抑制肿瘤生长(Cheng等，2014JofHepatology61:1297-1303；Guo等，2017CytokineandGrowthFactorR7[0037]另一方面，本发明总的来说涉及蛋白例如本文公开的融8[0048]图4示出了通过RB-IL15-RA-Fc和超级IL15进行的淋巴细胞增殖测定法的示例性鼠的存活率的示例性数据；图5C示出了用A20肿瘤细胞重新激惹的肿瘤治愈的小鼠的示例[0050]图6示出了超级IL15在MC38肿瘤模型中的治疗效果的示例性结果。图6A示出了通[0051]图7示出了在给药较低剂量的情况下超级IL15在A20小鼠模型中的治疗效果的示[0052]图8示出了在静脉内注射后RB-IL15-RA-Fc和超级IL15在A20肿瘤模型中的治疗效[0053]图9示出了在腹膜内注射后RB-IL15-RA-Fc和超级IL15在小鼠A20肿瘤模型中的治[0054]图10示出了用或未用MMP14消化的纯化的人类IL15融合蛋白的示例性SDS电[0055]图11示出了使用HEK-BlueTMIL2报告细胞测定法评估的与或未与MMP14温育的人9范围被理解为包括来自于组合物和方法包括所叙述的要素并排除对所述组合物和方法具有任何重要意义的其他要(例如非共价异别和/或能够诱导体液免疫应答和/或导致B和/或T淋巴细胞活化的细胞免疫应答。抗原可以具有一个或多个表位(B和/或T细胞表位)。抗原优选地通常以高度选择性方式与其对应在的分子的结构、调控或生物化学功能或与代谢或生理过程相关或相伴的任何功能的实体。生物活性多肽或其片段包括可以参与生物过程或反应和/或可以产生所需效应的多肽免疫应答中具有预防价值时或当它在确定分子的存在中具有诊断和/或预后价值时，它表使得所述两种多肽可以在所述宿主细胞中或宿主细胞的培养基中相互作用或结合并形成一致(在形态或全套DNA方面)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷例如酵母菌属(Saccharomyces)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和多形汉逊酵母构域可能能够结合被称为Fc受体的细胞表面受体和/或补体系统的蛋白质，或者可能被修[0083]已报道了Fc融合蛋白，以将IgG的Fc区域与另一种蛋白质例如各种不同的细胞因子和可溶性受体的结构域合并(例如Capon等，1989Nature337:525-531；Chamow等，子(例如在美国专利号7,732,570中所述)。Fc融合蛋白可以溶解在细胞质中或者可以结合结合位点的分子或序列。国际申请WO97/34631(1997年9月25日公布)和WO96/32478描述键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达后的N-端非均质性，苷(C)脱氧核糖核苷或鸟苷(G)和/或胞苷(C)核糖病症的最高标准推荐剂量高至少5％(例如至少10％、20％、50％、100％、200％或甚至因素过程来刺激免疫细胞和/或将免疫细胞从血液召集到淋巴系或非淋巴系组织的过程。当使用BLAST或BLAST2.0序列比较算法使用下文描述的缺省参数或通过人工比对和目测算法根据程序参数计算所述测试序列相对于参比序列[0092]适合用于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的优选实例是BLAST算法，其分别被描述在Altschul等，1977Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等，1990J.Mol.Biol.215:403-410中。BLAST软件可以通过美国国家生物技术信息中心来说，BLASTP程序使用3的字长(W)，10的期望值(E)和50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比对(B)，10的期望值[0096]IL15多肽的示例性功能测定法包括T-细胞的增殖(例如Montes等，2005ClinExp体的分离和增殖的检测(即3H-胸苷掺入)的方法在本领域中是公知的。细胞介导的细胞毒用可商购的试剂盒(OxfordBiomedicalResearch,Oxford,M；Cambrex,Walkersville,2004CellMolImmunol1:123)。凋亡测定法包括例如TUNEL测定法和膜联蛋白V测定法在序列可以在基因数据库例如GenBank中，通过美国国家生物技术信息中心(National等。示例性本源哺乳动物IL-15核酸序列的登记号包括NM_172200.1(人类亚型2)和NM_002189.2(人类亚型1前体)。示例性本源哺乳动物IL-15氨基酸序列的登记号包括NP_及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄耆胶粉(powered以通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现(Batzer等，1991NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsuka等，严重性或复发的减轻或延迟可以是减少约次药剂。预防可以包括在所有疾病症状已被消除的对象中预防疾病的复发或在复发-缓和起始与其可操作连接的下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调控区。启动子序列包括以高序列内可以存在转录起始位点以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序可能是偶然的。氨基酸在本文中可以通过它们通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生蛋白质相伴或相互作用的组分。可能实质上不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、[0115]本发明的蛋白质和前体药物在它们制备后优选被分离和/或纯化，以获得含有以半合成和/或合成起源的多核苷酸由于其起源或操作，并不伴有在自然界中与其相伴的全如在标准离心机中低于约30,000转每分钟)下不容易从水性缓冲液例如细胞培养基中沉[0120]本文中指称的水性溶液通常具有缓冲化合物以建立通常在约5-9的pH范围内的pH和约2mM至500mM之间的离子强度范围。有时添加蛋白酶抑制剂或温和的非离子型去污剂。改善这种病症或这种疾病或病症的一种或多种症状。治疗可以针对疾病和/或基础疾病的的一个或多个独特的识别位点(其可用于插入外来DNA)，并且通常带有可选择标记例如编[0130]本文公开的任何组合物或方法可以与一种或多种本文中提供的任何其他组合物[0135]在所述融合蛋白的某些实施方式中，所述IL15R的亚基选自α亚基、β亚基和γ亚[0137]在所述融合蛋白的某些实施方式中，所述片段是小鼠IL15R的α亚基的sushi结构[0138]在所述融合蛋白的某些实施方式中，所述片段是人类IL15R的α亚基的sushi结构所述连接物区段L1包含SEQIDNo.9中阐述的氨基酸序列。其中所述连接物区段L2能够被在肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶识别并其中所述连接物区段L2能够被在肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶识别并[0152]在所述融合蛋白的某些实施方式中，所述基质金属蛋白酶是基质金属蛋白酶9[0153]在所述融合蛋白的某些实施方式中，所述基质金属蛋白酶是基质金属蛋白酶14阐述的氨基酸序列。阐述的氨基酸序列。VELCADEe,MillenniumPharm.)、氟维司群(AstraZeneca)、索坦(SU11248，Pfizer)、来曲唑(FEMARA8,Novartis)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC8,Novartis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、奥沙利铂(Eloxatin8,Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(西罗莫司，RAPAMUNE89006，BayerLabs)和吉非替尼(IRESSA@,AstraZeneca)、AG1478、AG1571(SU5271；生素类例如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素特别是卡里奇霉素γ11和卡里奇霉素ω11春地辛，达卡巴嗪，甘露醇氮芥，二溴甘露醇，二溴卫矛醇，哌泊溴烷，格塞图辛油)、白蛋白工程化的紫杉醇纳米粒子制剂(AmericanPharmaceuticalPartners，Schaumberg，Illinois)和(多西他赛；Rhone-PoulencRorer，Antony，[0180]所述第二种(或另外的)药剂或疗法的实例可以包括但不限于免疫疗法(例如PD-1[0181]另一方面，本发明总的来说涉及蛋白例如本文中公开的[0194]可以使用任何适合的纯化方法。示例性的纯化方法是通过蛋白A/G的亲和层析或生物学现代方法》(CurrentProtocolsinMolecu蛋白质编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。可以利用各种不同的宿主-载体系统以使用大量适合的转录和翻译元件中的任一者。(对于与这些方法相关的公开内容，参见1989)；和Ausubel等，《分子生物学现代方法》(CurrentProtocolsinMolecular合体打算用于对抗可能具有或具有发展出血清型的能力的病原体时，以盒的格式配置的从适合的细胞系分离DNA或通过已知的合成方法例如磷酸三酯方法来获得(《寡核苷酸合可以通过PCR或本领域中已知的其他手段来扩增。适合用于扩增所述生物活性多肽基因的PCR引物可以向所述PCR产物添加限制性位点。所述PCR产物优选地包括用于效应物肽的拼接位点和所述生物活性多肽-效应物融合复合体的正确表达和分泌所必需的前导序列。所述PCR产物还优选地包括为所述连接物序列或用于连接这种序列的限制性酶位点编码的序列。活性多肽的DNA分子被分离后，可以将序列连接到编码所述效应物多肽的另一个DNA分子。所述编码生物活性多肽的核苷酸序列可以被直接联结到编码所述效应物肽的DNA序列，或者更通常地，可以使用适合的连接酶将本文中所讨论的编码所述连接物序列的DNA序列插入到所述编码生物活性多肽的序列与所述编码效应物肽的序列之间并联结。得到的杂合生物活性多肽编码的序列的表达的启动子序列或将所述融合蛋白导向细胞表面或培养基的前导序列，可以被包括在所述构建物中或出现在所述构建物被插入到其中的表达载体含量的序列来说，40-50℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)和0.1％SDS(十二烷基硫酸也是可用的。可容易获得的序列比较和多重序列比对算法分别是基本局部比对搜索工具述融合蛋白(对于与这些方法相关的公开内容，参见Sambrook等，《分子克隆实验指南》[0208]适合的载体的选择可以在与克隆方案相关的多种因素的基础上凭经验做出。例体必须能够容纳编码所述待表达的融合蛋白复合体的DNA序列。适合的宿主细胞包括真核以使用的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括CHOdhfr-细胞(Urlaub和Chasm，[0210]能够繁殖编码所需融合蛋白复合体的核酸的宿主细胞也涵盖非哺乳动物真核细[0211]编码所需融合蛋白的核酸可以通过用于转染细胞的标准技术引入到宿主细胞中。中的蛋白质表达水平，通常使用诱导型启动子例如tac。蛋白质过表达可能对宿主细胞有[0215]所述表达构建物可以利用已知的重组DNA技术组装。限制性酶消化和连接是用于建物的构建的大量克隆载体在本领域中是已知的其中引入有可操作连接到调控序列的编码所述感兴趣的蛋白质的核酸的宿主细胞(例如酵包括使用结合所述表达的融合复合体例如连接的TCR或其免疫球蛋白区域的单克隆抗体的公开内容，参见Sambrook等，《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:ALaboratory促进通过细胞膜的易位的化合物例如源自于HIV-1的TAT蛋白的Tat肽、黑腹果蝇酸的寡聚物和例如在WO07069090中描述的肽(Lindgren等，2000TrendsPharmacol.Sci21:99-103；Schwarze等，2000TrendsPharmacol.Sci.21:45-48；Lundberg等，句话说大约4.4×1016个拷贝/kg体重或低于[0225]根据具体情况，所述每日剂量可以在单次给药中或在两次或更多次给药中给[0226]本发明的组合物按照本领域专家已知的方法给药，包括但不限于静脉内、口服、[0234]IL15Rαsushi-IL15-Fc(被命名为RA-IL15-Fc)和IL15-IL15Rαsushi-Fc(被命名为[0237]IL15RβECD-L2-IL15-IL15Rαsushi-Fc(被命名为RB-IL15-RA-Fc)的示意图示出在IDNo.7。连接物区段L2是MMP9或MMP14的底物。MMP9底物连接物的氨基酸序列是SEQID[0242]合成IL15、IL15RA和IL15RBECD并将它们克隆到含有小鼠IgGκ前导序列和人类[0246]融合蛋白使用蛋白A-琼脂糖凝胶柱，按照手册(RepligenCorporation)进行纯[0253](2)如果所述柱用20％乙醇防腐，将它用5倍柱体积的蒸馏水以50至100cm/h的线[0259]纯化的融合蛋白的SDS电泳的结果示出在图2中，其中S1道[0262]首先表征白介素15(IL-15)刺激鼠类T细胞系CTLL-2的增殖的能力。在这个方案[0269](6)添加20μLCCK8。2～4hrs后，使用微量滴定板读板器读取每个孔的OD450和[0272]通过CCK8测定法检查了鼠类RB-IL15-RA-Fc和超级IL15对CTLL2的增殖能力。图4中示出的结果表明RB-IL15-RA-Fc的生物学活性降低100倍。这表明IL-15Rβ的细胞外结构第13天将带有肿瘤(60～80mm3)的小鼠用25μg超已经历完全肿瘤消退的小鼠用致死量的A20细胞重新激惹。所有小鼠排斥所述重新激惹的[0284]将A20细胞(3×106)皮下注射到Balb/c小鼠的右胁中。在第10天和第13天将带有肿瘤(60～80mm3)的小鼠用12.5测量肿瘤生长。在第二次注射后20hr收集血清。通过细胞测量珠阵列(CytometricBead管来说，将每种捕获珠的2μL等分试样添加到单一管中。向所述管添加小鼠Th1/Th2/Th17[0294]治疗效果示出在图8A中，表明静脉内给药的RB-IL15-RA-Fc的治疗效果与超级[0296]将A20细胞(3×106)皮下注射到Balb/c小鼠的右胁中。在第10天和第13天将带有肿瘤(60～80mm3)的小鼠用25μg超级量肿瘤生长。在第二次注射后20hr收集血清。通过细胞测量珠阵列(CytometricBead[0299]也产生了各种不同IL15融合蛋白和前体药物的类似的人类版本并进行了体外测[0300]将重组人类MMP-14/MT1-MMP(R&DSystems)活化并与IL15融合蛋白在37℃下温育[0301]所述与或不与MMP14在37℃下温育24hrs的纯化的人类融合蛋白的SDS电泳[0302]人类RB-IL15-RA-Fc的功能性使的SEAP的水平可以使用QUANTI-BlueTM容易地监测。由于IL15与由IL-2/IL-15受体β链和共[0305](2)将样品在平底96孔板中连续稀释，并在CO2温育箱中与每孔50μL细胞悬液(~[0306](3)在平底96孔板的每个孔中，将20μL诱导的HEK-BlueIL-2细胞上清液与每孔[0311]NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFI[0313]NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFI[0315]EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ[0317]GTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPS[0319]ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPAL[0321]AVKNCSHLECFYNSRANVSCMWSHEEALNVTTCHVHAKSNLRHWNKTCELTLVRQASWACNLILGSFPESQSLTSVDLLDINVVCWEEKGWRRVKTCDFHPFDNLRLVAPHSLQVLHIDTQRCNISWKVSQVSHYIEPYLEFEARRRLLGHSWEDASVLSLKQRQQWLFLEMLIPSTSYEVQVRVKAQRNNTGTWSPWSQPLTFRTR[0323]AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTK[0357]GTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[0359]ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF[0361]NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQGTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[0363]NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMS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