CN112703198B 用于跨血脑屏障递送试剂的方法和组合物 （布里格姆妇女医院）

2021.03.11PCT/US2019/0413862019.07.11WO2020/014471EN2020.01.16US2017166926A1,2017.06.15WO2014086835A1,2014.06.12WO2016138525A1,2016.09.01本发明基于增强试剂向细胞中和跨血脑屏2含插入在对应于SEQIDNO:85的氨基酸588和589的位置的靶向肽，和其中所述靶向肽由TVSALFK(SEQIDNO:8)或TVSALK(SEQID7.根据权利要求3所述的AAV载体，其中相对于包括所述转基因和没有所述靶向肽的9.根据权利要求5所述的AAV载体，其中相对于包括所述非编码RNA和没有所述靶向肽12.一种AAV9VP1衣壳蛋白，其包括插入在对应于SEQIDNO:85的氨基酸588和589的14.根据权利要求1至10任一项所述的AAV载体在制备用于通过以下方法递送转基因至X连锁中央核性肌病；溶酶体贮积病；巴氏综合征；杜氏肌营养不良；威尔逊病；或1型施用更昔洛韦。24.根据权利要求17所述的用途，其中所述细胞326.根据权利要求24所述的用途，其中所述鞘内递送是经由腰椎注射、小脑延髓池注4[0002]本申请要求2018年7月11日提交的美国临时申请序列号62/696,422的权益。前述[0004]本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式电子提交，在此通过引用将其全部并及其变体和本领域已知的或本文所述的其它AAV)。[0011]在一些实施方案中，靶向序列插入在衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:85的氨基酸5[0014]本文还提供包括V[S/p][A/m/t/]L(SEQIDNO:79)、TV[S/p][A/m/t/]L(SEQID(MetachromaticLeukodystrophy)；脊髓性肌萎缩；弗里德希共济失调(Friedreich’s综合征(BarthSyndrome)；杜氏肌营养不良(Duchennemuscular6[0022]图1A-1B描述通过将细胞穿透肽(CPP)插入AAV9的衣壳来工程化AAV9的示例性策[0023]图2A-2B显示在静脉内施用低剂量候选AAV后小鼠脑切片的代表性图像及其定量[0024]图2C-2D描述在重复试验中在静脉内施用AAV.CPP.11和AAV.CPP.12后小鼠脑切片的代表性图像及其定量分析。AAV.CPP.11和AAV.CPP.12分别包含CPPBIP1和CPPBIP2(参[0025]图3A显示BIP靶向序列的优化以便进一步朝向更好的脑转导地工程化AAV9。能够使AAV9更有效地转导脑(如在AAV.CPP.11中一样)的BIP1(VPALR,SEQIDNO:1)源自大鼠的自BIP2的序列再次插入AAV9衣壳中，以产生用于筛选的新的候选AAV。依次出现的序列是[0026]图3B-3C描述在静脉内施用更多候选AAV后小鼠脑切片的代表性图像及其定量分析。全部候选AAV表达核红色荧光蛋白(RFP)作为报告蛋白。AAV的剂量是每个动物1×1011[0027]图3D描述在静脉内施用候选AAV后肝脏中的转导效率的定量分析。显示转导的肝细胞。评价候选AAV从周围介质穿透至球状体内部并转导内部细胞的能力。图4B-4D显示[0029]图5A-5B描述在C57BL/6J近交系小鼠中在静脉内施用AAV9、AAV.CPP.16和AAV.CPP.21后的脑切片的代表性图像及其定量分析。全部候选AAV表达核红色荧光蛋白7[0030]图6A-6B描述在BALB/cJ近交系小鼠中在静脉内施用AAV9、AAV.CPP.16和AAV.CPP.21后的脑切片的代表性图像及其定量分析。全部候选AAV表达核红色荧光蛋白[0031]图7A-7B描述在C57BL/6J近交系小鼠中在静脉内施用高剂量的AAV.CPP.16和AAV.CPP.21后的脑切片的代表性图像及其定量分析。两个候选AAV表达核红色荧光蛋白区域转导成体神经元(由NeuN抗体标记)。转导神经元由NeuN抗体和RFP共同标记。将4×色观察脊髓的腹角中的运动神经元。RFP和CHAT信号的共定位显示运动神经元的特异性转×1011vg的AAV静脉内施用于成年C57BL/6J小鼠(6周龄)。显示RFP标记的细胞相对于全部[0036]图9C描述AAV.CPP.16相对于AAV9显示增强的靶向成年小鼠的背根神经节(DRG)的[0037]图10A描述静脉内施用于非人灵长类动物后，AAV.CPP.16和AAV.CPP.21相对于的抗体染色观察AAV转导的细胞(以黑色显示)。放大左图中的正方形区域，如右图所示。AAV.CPP.16相对于AAV9转导显著更多的细[0038]图10B描述静脉内施用于非人灵长类动物后AAV.CPP.16和AAV.CPP.21相对于AAV9显示增强的转导顶叶皮层中的脑细胞的能力。将2×1013vg/kgAA[0039]图10C描述静脉内施用于非人灵长类动物后AAV.CPP.16和AAV.CPP.21相对于AAV98脉内注射至3月龄的具有低的预先存在的中和抗体的食蟹猴中。使用针对AADC的抗体染色[0040]图10D描述静脉内施用于非人灵长类动物后AAV.CPP.16和AAV.CPP.21相对于AAV9脉内注射至3月龄的具有低预先存在的中和抗体的食蟹猴中。使用针对AADC的抗体染色观AAV.CPP.21两者相对于AAV9都转导显著更AAV.PHP.eB在某些小鼠品系中跨BBB的强大作用(Hordeaux等人MolTher201927(5):LY6A显著增加AAV.PHP.eB与细胞表面的结合(图11A)。相反地，过表达LY6A不会增加对作为受体的AAV.PHP.eB分享LY[0042]图12A-12C描述AAV.CPP.21可用于在胶质母细胞瘤(GBM)的小鼠模型中全身递送治疗性基因至脑瘤。如图11A，静脉内施用的AAV.CPP.21-H2BmCherry显示为靶向肿瘤块有力的脑组织的转导。在成年小鼠(>6周龄)中进行的AAV的脑内注射(1×1011vg)，并且在[0044]与跨BBB的递送相关的困难阻碍了治疗包括癌症和神经退行性病症的脑病症的治[0045]通过基于已知的细胞穿透肽(CPP)的合理设计和靶向筛选(参见，例如，Gomez等人,Bax-inhibitingpeptidesderivedfromKu70andcell-penetratingpentapepti[0047]本发明方法识别了许多潜在的靶向肽，这些肽例如在插入至例如AAV1、AAV2、91X2X3的任何四个不相同的氨基酸；的任何四个不相同的氨基酸；Pathak,等人,IndoAmericanJournalofPharmaceuticalResearch,2015.8；Kazmierski,W.M.,编辑,PeptidGoodman等人,编辑,Houben-WeylMethodsofOrganicChemistry:SynthesisofPeptidesandPeptidomimetics,ThieleVerlag(NewYork2003)；和Mayo等人,末端至C末端的顺序是反向的，使得原始肽的N末端至C末端的氨基酸残基的顺序变成修饰以由排列成以使拟肽中N末端至C末端的氨基酸残基的顺序对应于原始肽中C末端至N末端3至不同的细胞类型(参见例如Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470(1984)；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1985)；Wondisford等人,至AAV9衣壳蛋白VP1的氨基酸588和589之间来基因工程化AAV衣壳以增加跨BBB的穿透、或所述的靶向序列的衣壳蛋白的AAV，所述衣壳蛋白为例如包括其中靶向肽序列已插入至序列的诸如氨基酸588和589之间的SEQID的或本领域已知的治疗剂、或报告蛋白如荧光蛋白列。[0092]用作治疗剂的示例性转基因包括神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)、神经生长因子和粘蛋白结构域3；HAVCR2)；TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T-细胞免疫受体)；B7-H3衰减因子，CD272)；GARP(糖蛋白A为主的重复序列(GlycoproteinARepetitions；[0094]其它转基因可以包括改变/降低靶基因表达的小的或抑制性核酸，例如改变基因[0095]病毒还可以包括一种或多种促进转基因表达的序列，例如一种或多种启动子序向肽，例如，如Chen等人(2008)NatMed15:1215-1218或Xu等人,(2005)Virology341:(Washington,DC:SocietyforNeuroscience；)1–9,在/～/media/SfN/Documents/Short％20Courses/2011％20Short％20Course％20I/2011_SC1_Gray.ashx上生物分子表达为融合蛋白的一部分来增加其它(异源)分子跨BBB的穿透。除了本文所述的治疗剂或报告蛋白以及表2中所列出的那些以外，这些可以包括基因组编辑蛋白或复合物[0099]在一些实施方案中，用作非-AAV融合蛋白的一部分的靶向序列不包括VPALR(SEQIDNO:1)或VSALK(SEQIDNO:2)、或不由VPALR(SEQIDNO:1)或VSALK(SEQIDNO:2)组背根神经节或脊髓(周围神经系统)递送例如目标序列等任何组合物。在一些实施方案中，[0102]在一些实施方案中，所述方法和例如AAV等组合物用于递送核酸序列至患有例如[0105]在一些实施方案中，所述组合物和方法用于治疗脑癌。脑癌包括神经胶质瘤(例药更昔洛韦一起例如静脉内等全身施用至已被诊断为脑癌[0109]通常将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃[0110]配制合适的药物组合物的方法是本领域已知的，参见，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,2005；和DrugsandthePharmaceutical[0112]可以通过将所需量的活性化合物与所需的以上列举的成分的一种或组合掺入适和聚乳酸。这样的制剂可以使用标准技术来制备，或者例如从AlzaCorporation和Nova体的选定细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员NO:2)以及其衍生物例如AAV.CPP.16中的TVSALK(SEQIDNO:4)和AAV.CPP.21中的TVSALFK如由普遍存在的EF1a启动子驱动的核定向的RFPH2B-mCherry)共转染到HEK293T细胞中。在转染后72h和120h从无血清培养基中收集rAAV载体，并且在转染后120h从细胞中收集颗粒的细胞沉淀物重悬并通过超声处理裂解。将来自PEG沉淀和细胞裂解物的组合的病毒载体在37℃下用DNA酶和RNA酶处理30分钟，然后使用超速离心法(VTi50转子,40,Amicon过滤器单元(UFC910008,100KMWCO)浓缩rAAV，并在含有0.001％PluronicF68(Gibco)的杜氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(SEQIDNO:91)和ITR反向引物5'-CGGCCTCAGTGAGCGA(SEQIDNO:92)进行定量PCR。将载体滴度相对于rAAV-2参考标准材料(RSMs,ATCC,货号:VR-1616,[0129]对于静脉内施用，在成年小鼠(6周龄以上)中通过尾静脉注射施用在无菌盐水(0.2ml)中稀释的AAV。使动物存活三周，然后安乐死以组织收获。对于脑内注射，使用[0131]将麻醉的动物用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)、接着用4％多聚甲醛(PFA)进行心脏灌质细胞(LonzaBioscience)、人脑微血管周细胞(HBVP,ScienCellResearchLaboratories)和人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3；Cedarlane)以1:1:1的比例(每种类型1500个细胞)接种至琼脂糖凝胶中。将细胞在37℃下于5％CO2培养箱中孵育至NuncLab-TekII薄玻璃8孔室盖玻片(ThermoScientific)中，并使用ZeissLSM710共[0135]所有NHP研究均由CRO在IACUC批准的AAALAC认可的设施中进行。对食蟹猴进行很少或没有的预先存在的针对AAV9的中和抗体的预筛(<1:5的滴度)。使用蠕动泵静脉内(通[0137]用在含10％驴血清和2％TritonX-100的PBS中稀释的一抗对小鼠组织切片进行Fluor555或AlexaFluor647的荧光团缀合的二抗以1:200的稀释应用于一抗的宿主物[0138]对于NHP组织的石蜡切片，进行DAB染色以可视化由AAV-AADC转导的细胞。兔抗AADC抗体(1:500,Millipore[0140]将HEK293T细胞在37℃下在5％CO2培养箱中孵育。在将HEK293T细胞以每孔250,上冷却10分钟。然后将培养基换成500ul的含有MOI为10000的rAAV-mCherry的冰冷无血清[0142]所有实验均按照布里格姆妇女医院(BrighamandWomen’sHospital)和哈佛医学院(HarvardMedicalSchool)动物保护和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。使用重鼠胶质母细胞瘤细胞)。使用立体定向框架(stereotacticframe)定位植入部位(前囟坐[0150]将表达核RFP(H2B-RFP)的AAV静脉内注射至具有混合的C57BL/6和BALB/c遗传背[0154]使用体外球状体BBB模型筛选一些AAV变体跨人BBB的能力。球状体包含在表面形AAV，评价它们从周围介质穿透至球状体内部并转导内部细胞的能力。图4A显示实验示意年小鼠(图5A中脑切片中的白点，在图5B中量化)和BALB/c成年小鼠(图6A中脑切片中的白[0161]还评价AAV-CAG-H2B-RFP和AAV.CPP.16-CAG-H2B-RFP转导小鼠中各种组织的相对[0163]向3月龄的食蟹猴静脉内注射2非人类灵长类动物后，AAV.CPP.16和[0165]LY6A作为AAV.PHP.eB的受体并介导AAV.PHP.eB在某些小鼠品系中跨BBB的强大作用。培养的293细胞中的过表达小鼠LY6A显著增加AAV.PHP.eB与细胞表面的结合(参见图H2B-RFP和AAV.CPP.21-H2B-RFP(图13)的脑内注射导致在AAV.CPP.21处理的脑切片中相对于AAV9处理的脑切片的更广泛且更高强度的RFP信号。有关更多详细信息，参见材料和方[0002]<110>布里格姆妇女医院(THEBRIGHAMANDWOMEN'SHOS[0662]<223>V,A,L,I,G,P,S,T,或M[0666]<223>K,R,H,D,或E[0681]<223>V,A,L,I,G,P,S,T,或M[0685]<223>K,R,H,D,或E[0700]<223>V,A,L,I,G,P,S,T,或M[0704]<223>K,R,H,D,或E[0723]<223>F,L,W,或Y[0727]<223>V,A,L,I,G,P,S,T,或M[0731]<223>K,R,H,D,或E[0746]<223>V,A,L,I,G,P,S,T,或M[0750]<223>K,R,H,D,或E[0769]<223>V,A,L,I,G,P,S,T,或M[0773]<223>K,R,H,D,或E[0800]<223>A,M,或T[0819]<223>A,M,或T[0838]<223>A,M,或T[0857]<223>A,M,或T151515