CN112703252A 用于最小化条形码交换的方法和系统 （10X基因组学有限公司）

PCT/US2019/045012201WO2020/028882EN2020.02用于在由单个细胞制备的条形码化下一代测序文库的制备期间最小化条形码交换的方法2(a)在多个分区中，使用来自多个核酸条形码分子的核酸条形码分子和多个核酸分子(b)从所述多个分区回收所述多个条形码化核酸分子，以产生包含所述多个核酸条形2.如权利要求1所述的方法，其中所述3’3.如权利要求1所述的方法，其中所述3’3(b)使所述反应混合物经受足以使所述模板核酸分子与所述多个核酸条形码分子中的(c)使所述反应混合物经受足以使所述RNase酶降解所述核糖核苷酸从而释放所述3’20.如权利要求17所述的方法，其中所述共同条形码序列在所述至少一个核糖核苷酸28.如权利要求27所述的方法，其中所述多个核酸条形码分子可释放地附接至所述珠38.如权利要求17所述的方法，其中在(b39.如权利要求38所述的方法，其中通过转座酶将所述衔接子序列添加至所述模板核442.如权利要求41所述的部分双链核酸条形码分子，其中所43.如权利要求42所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述无碱基位点位于与所述44.如权利要求43所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述无碱基位点位于与所述45.如权利要求41所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述无碱基位点在所述第二46.如权利要求41_45中任一项所述的部分双链核酸条形码分47.如权利要求41_45中任一项所述的部分双链核酸条形50.如权利要求49所述的部分双链核酸条形51.如权利要求50所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述非经典碱基位于与所述52.如权利要求51所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述非经典碱基位于与所述53.如权利要求52所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述非经典碱基与所述第一54.如权利要求49_53中任一项所述的部分55.如权利要求49_54中任一项所述的部分双56.如权利要求49_55中任一项所述的部分559.如权利要求58所述的部分双链核酸条形码分子，所述部分双链核酸条形码分子附62.如权利要求61所述的部分双链核酸条形码分子，其中所述阻断物包括C3间隔子、63.如权利要求61或62所述的部分双链核酸条形码分子，所述部分双链核酸条形码分核酸分子和权利要求41_64中任一项的部分双链核酸条形码分子来生成多个条形码化核酸70.如权利要求69所述的方法，其中所述生成包括将所述多个核酸分子中的核酸分子连接至权利要求41_64中任一项的所述部71.如权利要求70所述的方法，其中所述连接包括将所述多个核酸分子中的所述核酸74.如权利要求69_71中任一项所述的方75.如权利要求69_74中任一项所述的方法6链核酸条形码分子的第一链包含(A)共同引物退火序列的互补序列和(B)唯一条形码序列；ii)将所述部分双链核酸条形码分子连接至所述核酸分子，从而生成条形码化核酸分c)使用与所述共同引物退火序列退火的引79.如权利要求76_78中任一项所述的方法83.如权利要求76_82中任一项所述的方法，其7[0006]某些应用可能受益于对从更大的群体中获得的单细胞中获得的物质的扩增或测在一些实施方案中，所述3’阻断基被配置成当与靶核酸分子杂交时防止所述引物序列延8物经受足以使所述模板核酸分子与所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子杂交的条件；(c)使所述反应混合物经受足以使所述RNase酶降解所述核糖核苷酸从而释放所述3’阻断基的条件；以及(d)使用所述模板核酸分子和所述核酸条形码分子来生成条形码化模码分子包含(a)第一链，所述第一链包含(i)引物退火序列的互补序列和(ii)条形码序列；9基位点在所述第二链中的某个位置，其中如果在所述位置处存在碱基，则所述第一链的3’码分子包含(a)第一链，所述第一链包含(i)引物退火序列的互补序列和(ii)条形码序列；码分子包含(a)第一链，所述第一链包含(i)引物退火序列的互补序列和(ii)条形码序列；码分子包含(a)第一链，所述第一链包含(i)引物退火序列的互补序列和(ii)条形码序列；混合物经受足以将阻断寡核苷酸偶联至所述多个核酸条形码分子的所述剩余部分的条件，在一些实施方案中，所述3’阻断基被配置成当与靶核酸分子杂交时防止所述引物序列延码分子，其中所述多个核酸条形码分子中的每个核酸条形码分子包含：(A)共同条形码序应混合物经受足以使所述模板核酸分子与所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子在一些实施方案中，所述3’阻断基被配置成当与靶核酸分子杂交时防止所述引物序列延[0033]在一些实施方案中，用于核酸处理的方法还包括将反应混合物共同分配到分区[0036]在一些实施方案中，用于核酸处理的方法还包括在(b)之前将衔接子序列添加至引用程度如同特别且个别地指示每篇个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。在以引用的方式并入的公布和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容矛盾的程度[0047]图7A示出了具有用于进行受控分配的几何特征的微流体通道结构的另一实例的酸复合物。图10B示出了使用基于连接或基于线性扩增的条形码缀合方法进行的对标记片[0054]图14A至图14C说明了示例性的含有3’阻断基的含核糖核苷酸的条形码分子。图[0058]图18A至图18D示出了可防止条形码延伸的核酸条形码分子的示例性设计的示意[0059]图19示出了显示使用包含非经典碱基例如尿嘧啶的核酸分子的条形码匹配百分[0060]图20示出了显示使用包含非经典碱基例如尿嘧啶或无碱基位点的核酸分子防止的内源特征(例如分析物的尺寸或末端序列)外附连至分析物(例如核酸分子)的标签或标后加入至脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段。条形码可允许鉴定和/或量化序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸限于Illumina&、PacificBiosciences(pacBio8)、OxfordNanoporeE或Life(例如人类)的遗传信息相对应的多个原始遗传数据，如通过系统从受试者提供的样品产以与蛋白质组学信息一起使用。可以是用包含一种或多种聚合物的涂层覆盖的固体颗粒(例如基于金属的颗粒，包括但不含DNA。大分子成分可以包含RNA。RNA可以是编码或非编码的。RNA可以是例如信使RNA核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5SrRNA、转运RNA(tRNA)、微型RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、源自tRNA的小RNA(tsRNA)和源自小rDNA的RNA空间或体积分隔开。液滴可以是在与第一相不可混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如开的分区可以包含一个或多个生物颗粒和/或其大分子成分。分区可以包含一个或多个凝与能够聚合或胶凝的前体的聚合而包裹在凝胶或聚合物基体内的生物颗粒和/或其大分子体112不可混溶的第二流体116从通道区段104和106中的每一个递送至接点110处以产生第颗粒114)来实现，以便确保至少一个生物颗粒包封在分区中，但是泊松分布(Poissonian生成的分区中不超过约50％、所生成的分区中不超过约25％或所生成的分区中不超过约在许多情况下，本文所述的系统和方法的使用可以产生所得分区，所得分区具有小于约线性聚合物材料)的情况下，活化剂可以包括交联剂或活化所形成的液滴内的交联剂的化混合物的情况下，可以在通道区段104和106中的第二流体流116内提供例如四乙基亚甲基可以从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性流体112中，这样将活化液滴118、的情况下，微囊的降解可通过引入适当的还原剂例如DTT等来裂解使聚合物基质交联的二合物或凝胶可以具有与珠粒相似的大小。聚合物或凝胶可具有与珠粒相似的机械强度(例择孔径以保持对外源化学物质(例如氢氧化钠(NaOH))和/或内源化学物质(例如抑制剂)的基)4甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。可将聚丙烯酰胺共丙烯酸暴露于4(4,6二甲氧基1,文公开的系统和方法可适用于含有生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴和其他分区)和含有生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液以破坏微囊，这是一种使条形码化核酸分子偶联至微囊或处于微囊内或两者的相互作用。[0099]图2示出了用于将携带条形码的珠粒递送至液滴的微流体通道结构200的一个实个生物颗粒216的水性流体212沿通道区段202转运至接点210处。所述多个生物颗粒216可201和202中的每一个的水性流体212与来自通道区段204和206中的每一个的第二流体218[0100]作为替代，通道区段201和202可以在接点210上游的另一接点处会合。在此接点[0103]生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒216。生成的离散液滴可以包括携带条形码或其他试剂的珠粒214。生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒和携带条形码的珠是一种包含二硫键的有机试剂，可以用作珠粒的单独的单体或聚合物前体之间的交联剂。二硫连键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包含可化学还原的交联剂的可化学降解的珠粒)。寡核苷酸)。丙烯酰胺基部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团修饰或者可以用已经包含二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(通过二硫化物交换)可以用作要附接的物质的锚定使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。所述一个以上的条形码序列可以包括对于偶联至给定珠粒的所有核酸分子相同的序列和/或在偶联至给定珠粒的所有核酸分子中和系统一起使用的，提供于美国专利公布第2014/0378345和2015/0376609号(其各自以引流动池附接序列(例如，用于Illuminae测序系统的P5序列)测序引物序列(例如，用于同一分区中的一个或多个珠粒的所有核酸分子所共有。核酸分子802可以包含特异性引物核酸分子的相应条形码可以包括在偶联至同一珠粒的不同单独核酸分子之间的共有序列任何后续扩增之后，不同UMI的数量可以指示来源于给定分区并因此来源于生物颗粒(例1乙基3(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4(4,6二甲控制用于生成游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的形码分子和珠粒之间的连键的裂解而释放或可释放，或通过基础珠粒本身的降解而释放，珠粒在分区内降解并且任何缔合的物质(例如，寡核苷酸)都在液滴内释放。游离物质(例或更高的离子浓度和/或将珠粒从电场中移除来完成。珠粒的去溶胀可以通过各种去溶胀裂解地或可逆性地附接至本文所述的珠粒的条形码包括通过条形码分子和珠粒之间的连和/或用于一个或多个测序平台的模板制备(例如，标签化)的试剂(例如，用于Illumina@括但不限于以上提到的也可以包封在珠粒中的物[0138]可降解珠粒可以包含一种或多种具有不稳定键的物质，使得当珠粒/物质暴露于如，二硫化物连接子)与可降解珠粒连接。可降解连接子可与可降解珠粒响应于相同的刺可以指具有小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100下限的用于降解珠粒的此类材料[0143]在一些实施方案中，珠粒可由包含可降解的化学交联剂例如BAC或胱胺的材料形来源的微囊，同时确保进入分区的此类珠粒与给定数量的生物颗粒的给定配对或组合(例粒的内容物。在此类情况下，可以在将生物颗粒引入到分配接点/液滴生成区(例如接点[0155]在示例性操作中，通道区段301可以将包括多个生物颗粒314的水性流体312沿通点310上游并且就在到达第二接点之前，通道区段301可在第一接点309处遇到通道区段点309之后，通道区段301中的水性流体312可以将生物颗粒314与试剂315两者携带到第二从通道区段304和306中的每一个递送至第二接点310处。在来自通道区段301的水性流体312与来自通道区段304和306中的每一个的第二流体316在第二通道接点310处会合时，水性流体312可以在第二流体316中分配为离散液滴318并且沿通道区段308从第二接点310处[0158]生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒314和/或一种或多种试剂315。在一些[0161]裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性酶(labiase)、立枯丝核菌裂解酶(及用于消除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分的负面活性或对核酸后续处理的影响以便允许包封的生物颗粒在与核酸分子释放到分区中[0163]其他试剂也可以与生物颗粒共同分配，例如用于使生物颗粒的DNA片段化的内切核酸酶，用于扩增生物颗粒的核酸片段并将条形码分子标签附接至扩增片段的DNA聚合酶特异性地分配给单独的生物颗粒或多组生物颗粒来提供将特征归属于单独生物颗粒或多[0169]共同分配的核酸分子还可以包含可用于处理来自于共同分配的生物颗粒生物颗物或引物识别位点，杂交或探测序列(例如用于鉴定序列的存在或用于下拉带条形码的核约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下为至少约10亿个核酸分子或更多。给定珠粒[0175]图4示出了用于将珠粒受控分配到离散液滴中的微流体通道结构的一个实例。通道结构400可以包括在通道接点406(或交叉点)处与储槽404连通的通道区段402。储槽404成液滴。可以通过将水性流体408从通道区段402连续注射通过接点406而将多个液滴收集的离散液滴可以包括多于一个珠粒。可替代地，生成的离散液滴可以不包括任何珠粒(例到通道区段402中的频率和/或通道区段402和单独的通道中流体的相对流速来控制通道区和图2中描述的)。在一些情况下，水性流体408可以具有浓度或频率基本上均一的生物颗生物颗粒引入到通道区段402中的频率和/或通道区段402和单独的通道中流体的相对流速一单独通道可以将珠粒引入到通道区段402中并且第二单独通道可以将生物颗粒引入到其[0180]在一些情况下，第二流体410可以不经受和/或不被引导流入和流出储槽404。例[0181]在接点406处或附近的通道结构400可以具有至少部分地决定了由通道结构400形通过增加通道区段402中的水性流体408的流速来增[0187]图5示出了用于增加液滴生成通过量的微流体通道结构的一个实例。微流体通道及对其部件的任何描述可对应于通道结构500中的所述多个通道区段502中的给定通道区对应于来自通道结构500的储槽504以及对其[0188]所述多个通道区段502中的每个通道区段均可以包括含有悬浮珠粒512的水性流[0189]在操作时，包括悬浮珠粒512的水性流体508可以沿所述多个通道区段502转运到过将水性流体508从所述多个通道区段502连续注射通过所述多个接点506而将多个液滴收含水性流体508的入口通道区段的通道结构生成液滴的频率可以是具有一个入口通道区段[0192]图6示出了用于增加液滴生成通过量的微流体通道结构的另一实例。微流体通道400的通道区段402以及对其部件的任何描述可对应于通道结构600中的所述多个通道区段602中的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构400的储槽404以及对其部件的任何描述可对应于来自通道结构600的储槽604以及对其[0193]所述多个通道区段602中的每个通道区段均可以包括含有悬浮珠粒612的水性流[0194]在操作时，包括悬浮珠粒612的水性流体608可以沿所述多个通道区段602转运到的扩展角等)的因素而形成液滴。可以通过将水性流体608从所述多个通道区段602连续注射通过所述多个接点606而将多个液滴收集在储槽604中。用通道结构600基本上平行的通[0196]储槽604在与所述多个通道区段602的不同通道接点处可以具有相同或不同的扩便在所述多个通道连接子606处或附近为每个通道区段602提供相同或基本上相同的扩展[0198]图7A示出了具有用于进行受控分配的几何特征的微流体通道结构的另一实例的横截面视图。通道结构700可以包括在通道接点706(或交叉点)处与储槽704连通的通道区[0199]包括多个颗粒716的水性流体712可以沿通道区段702转运到接点706处以会合与[0200]生成的离散液滴可以包含所述多个颗粒716中的一个或多个颗粒。如本文其他地段702和单独的通道中流体的相对流速来控制通道区段702中的颗粒716的频率。在一些情702中并且第二单独通道可以将生物颗粒生物颗粒引入到其中。引入珠粒的第一单独通道[0202]在一些情况下，第二流体714可以不经受和/或不被引导流入和流出储槽704。例[0203]在接点706处或附近的通道结构700可以具有至少部分地决定了由通道结构700形成之前，水性流体712从接点706处离开通道区段702并且进入储槽704的部分)长度增加并线性地或非线性地可变地增加和/或减小。虽然图7A和7B说明了为线性的扩展储槽横截面[0208]例如，如上所述或本文其他地方所述的通道网络可与适当的流体部件流体[0209]本文所述的方法和系统可用于大大增加细胞应用和/或接收基于液滴的输入的应可以与带条形码化珠粒一起共同分配的其他试剂可以包括阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷分区中，使用来自多个核酸条形码分子的核酸条形码分子和多个核酸分子(例如，源自细胞)来生成多个条形码化核酸分子；(b)从所述多个分区回收所述多个条形码化核酸分子，以产生包含所述多个核酸条形码分子和所述多个核酸条形码分子的剩余部分的混合物；[0214]在ATAC_seq方法中，使用加载有含转座子末端序列的核酸分子的转座酶分子(例如，Tn5转座酶)的转座酶核酸复合物对来自细胞或细胞核的含基因组DNA的染色质进行标连接的条形码化方案的杂交位点，以将条形码序列附接至衔接子侧接的模板核酸片段(参序列)退火来生成条形码化的衔接子侧接的模板核酸片段，将所述模板核酸片段使用聚合接酶(例如T4DNA连接酶))将核酸条形码分子1701连接至标记片段化的衔接子侧接的模板在一些情况下，使条形码化的衔接子侧接的模板核酸片段经受足以进行缺口填充的条件 子可引发模板核酸片段，导致PCR产物含有与亲本模板分子不同的条形码序列(此过程称为[0218]条形码交换反应的代表性实例示于图12A中。将条形码化的衔接子侧接的模板核酸分子1202从分区中取出并在本体SI_PCR反应中合并后，本体混合物包含条形码化片段，板核酸分子1202。衔接子侧接的模板核酸分子1202还可包含衔接子序列1210(例如，P5序在SI_PCR期间，包含条形码序列1220b的此条形码分子1201b可杂交并扩增含1220a的片段以产生含1220b的模板核酸分子，从而将1220a条形码序列交换为1220b条形码序列。因为[0219]条形码交换反应的示例性机制示于图12B中。将条形码化的衔接子侧接的模板核形码分子1201b还可包含衔接子序列1210(例如P5序列，衔接子序列可与例如1110、1310、互补序列基本上类似)。在扩增反应1280(例如线性扩增或SI_PCR)期间，核酸条形码分子混合物经受足以将阻断寡核苷酸偶联至所述多个核酸条形码分子的所述剩余部分的条件，第一茎序列至少75％互补的第二茎序列以及与核酸条形码分子的剩余部分中的序列至少与第一茎序列至少75％互补的一个或多个区域，和(2)与第一茎序列不互补的一个或多个码分子的剩余部分中的序列(1330)互补的序列，并且1390代表防止经聚合酶延伸和/或连[0227]阻断寡核苷酸的第一茎序列和/或第二茎序列的序列和长度可改变，其中所述序其中该二聚体有效地阻止遗留的条形码分子在SI_P13B)。在一些实施方案中，本文所公开的组合物的第二茎序列与第一茎序列75％、76％、[0233]本文所公开的阻断寡核苷酸也可用于防止多种基于核酸的反应中的不想要的相合物经受足以使所述模板核酸分子与所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子杂交条形码分子中的互补序列退火，其中3’阻断基通过RNase酶裂解核糖核苷酸而释放(图位点等的任何组合或变型。核酸条形码分子可与标记片段化的衔接子侧接的模板DNA缔合可以与标记片段化的衔接子侧接的模板DNA上的一个或多个序列互补并且/或者能够与所接酶))将核酸条形码分子连接至标记片段化的衔接子侧接的模板DNA，以生成条形码化核[0251]图18A示意性地示出了示例性核酸条形码分子1801，其可防止核酸条形码分子并且/或者能够与所述序列退火，并且可包含防止扩增和/或延伸的碱基对、位点或序列形码序列1820和引物序列1830(例如，R1测序引物序列)或这些序列中任一者的互补序列。[0253]本文所公开的阻断寡核苷酸也可用于防止多种基于核酸的反应中的不想要的相样品标志PCR(SI_PCR)反应中合并后，任何剩余的未掺入的核酸条形码分子都可能会发生其产物的SI_PCR的引物竞争并导致高条形码交换率，因此使用包含防止扩增和/或延伸的[0256]本公开提供被编程用于实施本公开的方法的计算机系统。图9示出一种计算机系设备能够与计算机系统901耦合以起到客户端或服务器的作用。的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存的术语是指参与提供指令给处理器来执行的任何介令、输送这类载波的电缆或链路或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介形码交换的区域相关联等。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户[0271]实施例1.在分区中通过线性扩增使用本体标记片段化和条形码化生成条形码化[0272]以基本上维持天然染色质组织的方式从目标细胞群体中的细胞中大批收获细胞所述，可将细胞掺入细胞珠粒中。然后在转座酶_核酸复合物的存在下孵育透化的细胞核[0273]然后将包含衔接子侧接的模板核酸片段的细胞核(或细胞)分配到多个分区(例单链条形码寡核苷酸分子附接至凝胶珠粒并进行分配，以使至少一些分区包含(1)单个细[0274]然后使含单个细胞核的分区经受条件以使衔接子侧接的模板核酸片段从细胞核[0276]实施例2.在分区中通过线性扩增使用标记片段化和条形码化生成条形码化核酸[0277]将来自目标细胞群体的细胞(或来自目标细胞群体中的细胞的完整细胞核)分配件，使得转座酶核酸复合物将第一衔接子序列和第二衔接子序列整合到模板核酸中以产生双链的衔接子侧接的模板核酸片段。因为转座酶一核酸复合物只能作用于无核小体的DNA，所以衔接子侧接的模板核酸片段代表单个细胞中可接近染色质的全基因组区域。或[0282]测试了本公开的阻断寡核苷酸，以确定它们是否可成功地阻断聚合酶链反应与衔接子侧接的核酸分子中的R1和R2序列互补的引物进行扩增(参见图15A)。在PCR之前，如由包括阻断寡核苷酸但不包括DNA连接酶的反应所示，阻断寡核苷酸与引物序列的杂交核酸分子(含有与用于对模板核酸片段进行条形码化的条形码序列不同的条形码序列)掺换的频率下降了约50并且似乎与所利用的阻断寡核苷酸的浓度无关(图16)。[0285]实施例5.在分区中通过连接使用本体标记片段化和条形码化生成条形码化核酸[0286]以基本上维持天然染色质组织的方式从目标细胞群体中的细胞中大批收获细胞[0287]然后将包含衔接子侧接的模板核酸片段的细胞核(或细胞或细胞珠粒)分配到多