肿瘤细胞的培养

肿瘤细胞的培养

Cultivationoftumorcells

肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性和癌细胞生物学特性的重要手段。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：

①可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化学和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。②既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理。③可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。④可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。⑤研究周期短，比较经济。但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。一、体外培养肿瘤细胞生物学特性

（－）形态和性状LM：细胞形态不规则，比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核仁较多。

EM：细胞表面微绒毛多而细密，细胞骨架系统（微丝和微管）排列杂乱。（二）生长增殖

肿瘤细胞在体内、体外具有不受控增殖性。

1、肿瘤细胞在低浓度血清（2～5％）中仍能生长；2、正常细胞转化后能在低浓度血清中生长；3、癌细胞形成集落的能力（克隆）比正常细胞强。肿瘤细胞有产生促增殖因子的能力分散生长接触抑制消失（肿瘤细胞、转化细胞）接触抑制（正常细胞〕NIH3T3细胞经癌基因转化后出现转化灶（100×）转化区（密集重叠生长）非转化区NIH3T3细胞经癌基因转化后出现转化灶（200×）转化区（密集重叠生长）非转化区（三）永生性

永生性也称不死性，在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡，体外培养的肿瘤细胞系（株）都表现有这种特性。1、在反复传代培养中获得永生性；2、永生性不等于恶性。NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞有永生性而无恶性。myc基因+ras基因恶性体内致瘤性试验。常用裸鼠或受射线照射过的小鼠，皮下接种一定数量癌细胞悬液后，如长成肿瘤即表明有致瘤性。（四）恶性（五）浸润性

浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中。

（六）异质性

已经证明，瘤体周边的细胞增殖旺盛，中心区的细胞有的衰老退化，有的处于周期阻滞状态。呈活跃增殖状态的细胞称为肿瘤干细胞。所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性。（七）其它

细胞遗传性：体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈异倍体或多倍体。依赖性：肿瘤细胞虽有较强的克隆生长能力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存的关系。二、培养方法

（一）取材选癌细胞集中和细胞活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。如不能立即培养，可贮存于4℃，但不宜超过24小时。

1、体瘤取材方法：取术后或活检标本，要尽早浸入无血清培养液保鲜，尽快进行培养。尽可能去除溃疡及坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含二性霉素B2μg/mL，青霉素200～1000u/mL，链霉素500μg/mL的培养液中浸泡10～20分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。2、腔液的取材方法：在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝剂，可直接以1200r/min收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。3、血液(骨髓)取材法：白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌抽取5～10mL外周血，置于试管中立刻分离培养。(二)培养方法

一般常用的

RPMIl640、

DMEM等培养基;

肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低;

不同细胞需要添加不同的生长因子。

1、织块培养法：37℃5%CO2培养箱中培养接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中剪碎组织，切成1~2mm3小块在平皿中用Hanks液洗3次将取得的瘤组织去除脂肪\结缔组织及坏死部分2、酶消化法：在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000u/ml胶原酶；37℃水浴消化30分钟或更长，去除消化液；洗液洗3次，培养液洗1次后，用完全培养基悬浮制成细胞悬液，计数；以5×108～10×108/L细胞密度，在含有10%小牛血清的RPMI1640、或DMEM中，在37℃5%CO2下分瓶(或皿)培养。3、钽网培养法：在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块(1~2mm3大小)用镊子轻压，使其粘于网上；再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触于37℃5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次；5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。4、脱落细胞法：将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织；洗液洗2次后；用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来,脱落细胞经洗涤后；加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶(或皿)中、37℃5%CO2下培养，每隔2～3天换液，7～10天上皮细胞逐渐长成单层。（三）成纤维细胞的排除

1．机械刮除法：

（1）标记：在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；

（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，刮除无标记空间；

（3）用Hanks液冲洗一两次；

（4）注入培养液继续培养。

2．反复贴壁法：

（1）用胰酶消化后，加入不含血清的培养液；（2）把悬液接种入A培养瓶中，培养5～20min；

（3）吸出全部A培养液，移入B培养瓶中，培养

5～20min；

（4）向A瓶中补充含血清培养液继续培养；（5）把B瓶培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加含血清培养基。

A瓶主要为成纤维细胞；

B瓶两类细胞相杂;

C瓶可能主要为癌细胞。

3．消化排除法：

（1）0.25%胰蛋白酶/0.02％EDTA（1：1）混合液消化细胞；

（2）半数细胞脱落下来后，立即停止消化；

（3）把消化液吸入离心管，离心去上清；（5）向原瓶内也补加新的培养液继续培养。

（4）制成细胞悬液培养于另瓶；

4．胶原酶消化法：

（1）0.5mg/ml的胶原酶消化，当成纤维细胞被除掉后，即终止消化；

（2）D-Hanks洗涤，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。

5.其它方法：（1）聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用。（2）用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液。（3）用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长。（四）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施①完全无细胞游离出或移动。②有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代。③传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才呈现旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。1、适宜底物：如鼠尾胶原层、饲养细胞层等。2、应用促细胞生长因子：常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。3、动物体媒介培养：采用动物体转嫁接种成瘤后，再进行培养，常用裸鼠。

裸鼠是来自小鼠的一种变异品种，无毛，缺乏胸腺，有先天性免疫缺陷，接种肿瘤细胞后易生长成瘤，但对外界环境有害因素的抵抗力也差，易于感染，并惧严寒和高温，难以饲养和繁殖。裸鼠虽无胸腺，体内仍有NK杀伤细胞，对外仍有一定抵抗力，只要饲养环境基本无菌即可维持动物正常生存。裸鼠培养（1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1～3毫米3小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块；

（2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；

（3）进行体外培养。

（4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。

三、体外培养肿瘤细胞生物学检测2、形态观察：3、细胞生长特点：4、细胞核型分析：1、组织起源:5、软琼脂培养：检测集落形成能力。6、动物致瘤试验：检测成瘤能力。7、其他：同位素标记、组织化学成分分析、荧光显微镜观察等。应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、什么样供体、何种疾病等，必要时要提供病理诊断鉴定资料。组织起源形态观察（1）一般形态观察：可做活细胞相差显微镜观察并摄影。主要观察细胞形状、大小、核浆比例、染色质和核仁大小、及多少等。（2）超微结构观察：超微结构观察有助于比较确切地说明细胞的性质和特点，如注意微绒毛的形态、多少，桥粒的有无，微丝微管的多少和排列状态等。细胞生长特点

（1）细胞生长曲线是测定细胞绝对增长数值最简易的方法，是把逐日检查的数值绘成图即为细胞生长曲线。

（2）细胞分裂指数NormalcellsgrowinmonolayerCancercellsgrowinclumps（3）克隆形成率（接种存活率）克隆形成率：向底物上接种单细胞悬液，贴壁后能形成细胞群或克隆的细胞百分数，也称接种存活率，也表示细胞活力。克隆形成率＝形成克隆数接种细胞数×100（接种存活率）细胞接种率：细胞被制成分散的悬液后，接种到底物上能贴壁并能存活生长的细胞百分数值，用以表示细胞群的活力。细胞接种率与细胞活力成正比。细胞接种率＝接种细胞数×100贴壁存活细胞数细胞接种密度和克隆形成率有一定关系做接种率测定时，一般在接种后一周进行检查，每一细胞群数量达8或10个以上细胞时才能算做一个克隆，用解剖镜检查甚好。细胞克隆形成

※（4）细胞周期时间测定应用同位素标记自显影法。用支持物细胞培养法在细胞进入增生期时用（3H）胸腺嘧啶核苷标记30分钟后，每间隔30分钟取材处理，至48小时止。主要观察和计算细胞分裂相出现的时间，高峰和消失分裂相数，绘制成图进行分析。通过同位素自显影测定细胞周期同时，亦可借以了解DNA合成情况。癌细胞大多为异倍体，多倍体，并有标记染色体。体外培养细胞核型常不稳定，应定期检查。可作为细胞转化及恶性程度的检查。4、细胞核型分析5、软琼脂培养软琼脂培养，特别是双层软琼脂培养，是当前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法，与细胞恶性程度有很大的符合率。双层软琼脂培养用来检测成瘤能力。即向异种动物体内接种细胞悬液，看是否能生长成瘤。受体动物可用小鼠或大鼠。如系一般动物，需做射线照射处理，以压制动物免疫反应，用乳鼠较好。近年多用裸鼠，优点是无需射线照射、比较方便，但裸鼠要求的饲养条件较高。6、动物致瘤试验由人肿瘤组织来源居多数。四、肿瘤细胞系或株是现有细胞系中最多的一类;大多由癌细胞建成，呈上皮型细胞;均已传百代以上;具有不死性和异体接种致瘤性;1、特点：

HeLa：

为供体患者的姓名

CHO：

中国地鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovary）

宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立

NIH3T3：

美国国立卫生研究所（NationalInstituteofHealth）建立，每隔3天传代，接种3X105/毫升。2、命名：无统一规定。3、建立细胞系（或株）的要求：（1）组织来源细胞供体所属物种个体性别、年龄取材的器官或组织临床和病理诊断、病历号（2）细胞生物学检测：细胞一般和特殊的生物学性状；细胞接种率应力求