CN112912400B Nk接合子分子及其使用方法 （明尼苏达大学董事会）

2021.04.14PCT/US2019/0567772019.10.17WO2020/081841EN2020.04.23WO2005000894A2,2005.01.06WO2017062604A1,2017.04.13NKCellExpansion,Activation,and页.NKCellExpansion,Activation,and页.提供了用于激活NK细胞以刺激免疫应答以并与NK激活结构域和NK接合结构域可操作地连2靶向结构域，其结合至靶细胞并且可操作地连接到所述NK其中所述化合物的氨基酸序列由SEQIDNO.:1或SEQID3.根据权利要求1所述的化合物在制造治疗受试者中急性髓性白血病(AML)的药物中3[0004]本发明是在政府的支持下，在美国国立卫生研究院授予的CA111412和CA65493且使用WindowsOS的计算机上使用MicrosoftWor[0009]自然杀伤(NK)细胞是能够进行免疫监视的先天性免疫系统的细胞毒性淋巴细NK细胞表达CD16，一种与IgG抗体的Fc部分结合并参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性细胞的存活和体内扩增时，NK细胞的过继转移可以诱导患有难治性急性髓性白血病(AML)的患者的缓解。这种疗法可能受到抗原特异性的缺乏和IL-2介导的调节性T(Treg)细胞诱[0011]本发明涉及用于激活NK细胞以刺激免疫应答以用于治疗癌症和其他障碍的化合域和NK接合结构域可操作地连接的靶向结构域，其中所述靶向结构域选择性地结合至4中，NK接合结构域部分包含抗体或其结合片段或纳米体，也被称为单结构域抗体(sdAb或5[0024]图1A-1C示出了在用CLEC12ATriKE治疗后的NK细胞增殖(图1A)、NK细胞杀伤(图[0029]图6A-6C示出了针对AML靶细胞的CD16-IL15-CLEC12ATriKE诱导脱颗粒(图6A)和[0034]图11A-11C示出了在实时成像测定中靶细胞杀伤的CD16-IL15-CLEC12ATriKE诱[0038]图15A-15B示出了在实时成像测定中靶细胞杀伤的CD16-IL15-CLEC12ATriKE诱[0039]图16A-16B示出了CD16-IL15-CLEC12ATriKE介导的靶杀伤。示出了靶门控策略[0041]图18A-18B示出了在骨髓中CD34pos祖细胞室内CLEC12A和CD33的表达。示出了来[0043]自然杀伤(NK)细胞是能够进行免疫监视的先天性免疫系统的细胞毒性淋巴细NK细胞表达CD16，一种与IgG抗体的Fc部分结合并参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性6细胞的存活和体内扩增时，NK细胞的过继转移可以诱导患有难治性急性髓性白血病(AML)的患者的缓解。这种疗法可能受到抗原特异性的缺乏和IL-2介导的调节性T(Treg)细胞诱CD33+和/或CD33-肿瘤细胞)杀伤的两个结构域和能够生成NK细胞自我维持信号的分子内[0046]本发明基于使用天然杀伤(NK)细胞靶向急性髓性白血病(AML)细胞的CD16/IL-对抗AML靶。该临床前数据已经促成了明尼苏达大学在难治性AML患者中建立了临床试验，[0047]AML患者的高死亡率和较差的五年存活率(26％)可以归因于化疗耐药性和疾病复细胞和正常骨髓细胞均表达CD33，因此靶向该抗原可以导致严重的造血功能缺陷和靶点/的TriKE的开发。CLEC12A在AML细胞上高度表达，并且超过70％的CD33阴性细胞表达编码C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。该家族的成员共享共同的描述了该基因的几种选择性剪接的转录物变体，但尚未确定这些变体中的一些的全长性质。该基因与染色体12p13上自然杀伤基因复合区域中的其他CTL/CTLD超家族成员密切相[0049]已经进行了双特异性融合，其结合了来源于人噬菌体展示文库技术的抗人抗导诱导钙通量和ITAM的磷酸化，触发溶解颗粒和细胞因子诸如干扰素(IFNγ)和肿瘤坏死7特征为具有外周血(PB)血细胞减少的正常或高细胞骨髓(BM)和或一个或多个靶向结构域(其靶向例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)和一个或多个细胞因[0052]在WO2017062604(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中描述了示例性的活结构域或靶向结构域)与其结合伴侣(例如抗原或受体)的相互作用的术语“选择性地结8间隔区的示例性His标签是SEQIDNO:3。SEQIDNO:3可以置于本文所述的化合物的C-末至CLEC12A的靶向结构域包含SEQIDNO:4的分离的氨基酸序列。氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列的核酸序列。[0059]NK接合结构域可以包含结合至和/或激活NK细胞的任何部分和/或阻断NK细胞的选择性地结合至NK细胞的表面组分的配体包含表现出所述结合特性的配体的合结构域可以选择性地结合至激活NK细胞的受体，并且因此也具有激活功能。如上所述，需的免疫接合特性。例如，CD16已经被确定为Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb9想要接合NK细胞但不接合中性粒细胞的情况下，技术人员可以设计TriKE的NK接合结构域[0063]虽然本文在其中NK接合结构域包含抗CD16受体scFv的各种实施例的上下文中进行了描述，但是NK接合结构域可以包含选择性地结合至CD16受体的任何抗体或其他配体。胞细胞毒性受体2B4、低亲和力Fc受体CD16、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、CD2、NKG2A、3273-3284)以使CD16接合子人源化，现在被称为HuEF91。HuEF91的结合等同于使用标准CD16scFv观察到的结合，表明将美洲鸵纳米体可变重链整合到人源化的主链中并未阻碍性的氨基酸序列。NK激活结构域可以是或可以衍生自一种或多种可以激活和/或维持NK细NK激活结构域包含细胞因子的完整氨基酸序列、细胞因子的任何合适的氨基酸片段和/或野生型IL-15氨基酸序列相比包含有氨基酸取代的NK激活结构域，诸如例如IL-15N72D或[0070]在TriKE中使用IL-15NK激活结构域可以提供持续的NK细胞活性(如在小鼠模型中改变这些分子的化学性质，使得它们更容易地重新折叠和/或以更高的产率回收，从而使本分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比被一个或多个核苷酸和/或氨基酸改变的核苷酸和/换句话说，亲本结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不会显著影响或改变由核苷修饰可以通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和随机PCR介导的诱[0073]功能性变体还可以包含但不限于在一级结构序列上基本上相似但含有例如在亲本结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这样的修饰尤其包[0075]靶向结构域可以包含选择性地结合至预期的靶的任何部分，诸如例如肿瘤细胞、癌基质中的靶、抑制性细胞诸如作为CD33+的髓系来源的抑制性细胞上的靶或病毒感染的合结构域、具有IL-15的激活结构域和选择性地结合至CLEC12A的靶向结构域。术语都可以是侧翼序列或接头序列。一个示例性的侧翼序列包含SEQID[0083]在一些实施例中，本文所述的化合物包含连接两个结构域的至少一个侧翼序在本领域中是众所周知的。除了任何常规的介质或药剂与活性成分不相容的情况之外，其分子一起施用于个体，而不引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的药物组合物的任何其他组分相互作用。具有药学上可接受的载体的组合物的方法包含使TriKE分子与构成一种或多种辅助成分的地刺激受试者中NK细胞扩增的量向受试者施用本文所述的化合物或分子。在一些实施例性和慢性髓性白血病(AML和CML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性粒单核细胞白血病[0099]施用的TriKE分子的量可以根据各种因素而变化，包含但不限于所使用的特定[0100]在一些实施例中，所述方法可以包含施用足够量的TriKE分子以向受试者提供例如约100ng/kg至约50mg/kg的剂量，尽管在一些实施例中所述方法可以通过施用该范围外[0102]在一些实施例中，所述方法可以包含施用足够量的TriKE分子以提供例如约分可以同时或顺序共同施用。可以在一种或多种药物组合物中提供同时共同施用的组分。两种或更多种组分的顺序共同施用包含其中施用这些组分使得每种组分可以同时存在于细胞群体的激活等)在治疗部位持续，直到一种或多种另外的组分被施用到治疗部位。因[0107]在一些实施例中，本文提供的方法可以包含施用足够的如本文所述的TriKE分子和施用至少一种另外的治疗剂，其中施用TriKE分子和至少一种另外的治疗剂证明治疗协观察到的对治疗的应答的测量比单独施用TriKE分子或另外的治疗剂后观察到的对治疗的[0110]如本文所使用的，通过端点对数值范围的叙述包含在该范围内包含的所有数字[0116]对于本文公开的包含离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进[0121]在哺乳动物细胞系统中开发了1615CLEC12ATriKE，以确保存在适当的翻译后修导比CLEC12AscFv或IL-15更多的靶细胞杀伤(53.9±1.9％/103.3±3.4％/71.1±常综合征(MDS)的患者的癌细胞和LSC上表达。这些发现强调了1615CLEC12ATriKE单独或与CD33TriKE联合用于治疗MDS和AML的临[0124]来自造血系统恶性肿瘤的所有死亡中的大多数由急性髓性白血病(AML)引起，其[0126]图2示出了通过流式细胞术分析来自10个患者的原代AML样品所测得的CD33和CLEC12A表面表达的百分比。CLEC12A在AML细胞上高度表达。约70％的CD33阴性细胞表达[0127]这些数据确立了CLEC12A作为表达CD33和缺乏CD33表达的原代AML细胞上的表面[0130]为了使用天然杀伤(NK)细胞靶向癌细胞，开发了一种三特异性杀伤接合子分子以及与癌症靶接合的抗CLEC12A单链可变片段(scFv)。在图3A-B中示出了CD16-IL15-[0131]TriKE含有一种通过将美洲驼抗CD16VHH的CDR整合到人源化的VHH主链中而构建的抗CD16重链抗体(图3A)。这与野生型IL-15分子有关，该分子与来自抗CLEC12A抗体的的TriKE分子可能适合用于临床应用，虽然也可以使用含有His标签的TriKE。TriKE在国专利第7,741,443号的SC02-357)，TriKE靶向结构域还可以包括能够靶向或结合至CLEC12A的任何序列，诸如scFvsSC02-378和SC02-161以及scFvsSC02-357、SC02-378和[0135]将CLEC12A+HL-60和CLEC12A-Raji靶与等摩尔浓度的1615CLEC12ATriKE或scFv一[0136]使用针对CD16(图14A)、IL15受体α(图14B)和CLEC12A胞外结构域(ED；图14C)的[0137]这些数据表明，1615CLEC12ATriKE的每种组分都与其各自的靶分子结合，并且CD16-IL15-CLEC12ATriKE特异性地结合至表[0142]汇总的数据(图9A)和代表性的直方图(图9B)示出了不同治疗组的NK细胞增殖(通+HL-60和THP1细胞以2:1的效应子与靶的比率孵育。通过流式细胞术在CD56+CD3-NK细胞上到在NK细胞上更高百分比的CD107a表面染色和更高百分比的IFNg和TNFa细在4小时测定中估计CD107a表达作为脱颗粒(图10A)、细胞内IFNg产生(图10B)或NK细胞中[0148]与无治疗、用IL-15治疗或用scFv治疗THP1靶细胞和HL60靶细胞相比，在与[0149]这些数据表明，1615CLEC12ATriKE诱导了针对AML靶细胞(包含THP1和HL-60靶)胞与CLEC12A+HL-60(图7A)和THP1(图7B)靶以2:1的效应子与靶比率一起孵育。用CellTraceFarRed染料和半胱天冬酶3/7绿色凋亡测定试剂(EssenBiosciences)标记靶细[0155]图11C示出了在不同的效应子与靶比率(1:1、2:1和5:1)下活THP-1肿瘤靶的百分于5:1NK+CLEC12ATriKE。与单独的NK细胞相比，对于所有效应子与靶的比率，观察到活[0156]在其他实验中，将富集的NK细胞与CellTraceFarRed标记的HL-60细胞以2:1效应子与靶的比率在IncuCyteS3成像仪中以指定的治疗(每种30nM)一起孵育48小时。使用[0157]图15A示出了相对于单独的靶和0小时时间点标准化的活的HL-60肿瘤靶在CLEC12ATriKE的存在下观察到活HL-[0159]这些数据表明，CD16-IL15-CLEC12ATriKE诱导了AML靶(包含THP-1和HL-60靶细[0161]本示例说明了在体外CD16-IL15-CLEC12ATriKE诱导的原代AML原始细胞靶的杀上评估表面CD107a表达以估计脱颗粒(图8C)和细胞内IFNg以估计炎性细胞因子产生(图[0163]在其他实验中，使用流式细胞术评估了原代AML原始细胞(SSCh低，CD45中等，[0164]来自健康供体(n＝10)的富集的NK细胞(CD56+，CD3-)与原代AML原始细胞以指定的治疗(30nM)一起孵育，以在2:1的效应子/靶比率的4小时测定中估计CD107a表达作为脱颗粒(图12B)和细胞内IFNg产生(图12C)的标记物。CLEC12ATriKE和CD33TriKE诱导了脱[0165]在48小时内跟踪不同组AML原始细胞的比例(基于CD33和CLEC12A表达)，以评估1615CLEC12ATriKE与1615CD33TriKE相比的特异性(图12E)。显示AML原始细胞存活％的(ii)对于IL-15，CLEC12A+CD33+CD33+和CLEC12A+CD33-。这些数据证实了1615CLEC12ATriKE与1615CD33TriKE相比的特者的骨髓样品以指定的治疗(30nM)一起孵育，以评估在2:1的效应子/靶比率下的4小时测[0167]图12G示出了来自癌症干细胞杀伤测定的综合数据，示出了在测定结束时存在的样品中诱导了对原代AML原始细胞杀伤的轻激活过夜的1×106个正常人供体NK细胞(根据磁衰竭的CD3/CD19产物计算)。在接下来的3[0173]在NK输注后第7天、第14天和第21天来自四个治疗组的发光的定量在图13B中示存在至少1％的AML原始细胞。然后输注用1NK细胞(根据磁衰竭的CD3/CD19产物计算)。在接下来的3周研究中，施用1615CLEC12A较的单向方差分析(ANOVA)来计算针对1615CLEC12A组的差异。误差条表示平均值+/-标准肿瘤或肿瘤+NK治疗相比，NK+CLEC12ATriKE治疗导致骨髓(图13F)和外周血(图13G)中NK[0179]图18A示出了来自两个代表性健康供体的骨髓中CD34pos祖细胞室中CLEC12A和TriKE治疗后，计数爆发形成单位红系(BFU-E)集落和集落形成单位红系(CFU-E)集落(图[0180]数据显示，CLEC12A在正常供体干细胞和祖细胞群体中被差异表达，并且与用[0184]可以设计包含多于一个靶向结构域的TetraKE(四聚体)分子。作为一个示例，何NK接合结构域和NK激活结构域。例如，靶向结构域可以靶向不同的靶或肿瘤抗原。在[0185]本文所述的任何靶或肿瘤抗原可以包含在具有结合至CLEC12A的第一靶向结构域的NK激活结构域、选择性地结合至CLEC12A的第一靶向结构域和选择性地结合至CD33的第[0187]MKWVTFISLLFLFSSAYSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYNMGWFRQAPGQGLEAVASITWSGRDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAANPWPVAAPRSGTYWGQGTLVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPDYNPSLKSRVTISVDKSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKVSTGGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIELTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGPGTKV[0189]MKWVTFISLLFLFSSAYSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYNMGWFRQAPGQGLEAVASITWSGRDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAANPWPVAAPRSGTYWGQGTLVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPDYNPSLKSRVTISVDKSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKVSTGGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIELTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGPGTKV[0193]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPDYNPSLKSRVTISVDKSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKVSTGGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIELTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ[0195]atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggcctcaccttcagtagctataacatgggctggttccgccaggctccagggcaaggccttgaggctgtagcatctattacctggagtggtcgggacacattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaactccaagaacactctctatctgcaaatgaacagcctgcgcgcggaggacacggccgtttattattgtgctgcaaacccctggccagtggcggcgccacgtagtggcacctactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctcatctggcggcggcggttctggtggaggaggtagtggggggggaggaagcggagggggtggctcagggaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttctggcagtaccagcgggtcagggaaacctggcagtggggaaggttccacaaaaggtcaagtacaactccaggagtccgggccagggttggtcaagccatccgagacgcttagtttgacctgtgttgtcagcggaggctctatatcatcttcaaactggtggtcttgggtacggcaaccaccgggcaaggggctcgaatggatcggggaaatctaccactccggaagccccgactataatccgtcactgaagagcagagtcactatatccgtggacaagagcagaaaccaattttctcttaagctctcctcagtgacagcagcagatacagcggtctattattgtgccaaggtatcaacaggcggattcttcgattattggggacagggcactttggttacggtttcttctggaggcgggggaagtggtggaggggggtctgggggaggtggctcagaaatcgaacttacgcagtcaccctcctccctctcagcatccgtaggtgacagagttacgataacctgtagagcaagtcaatccatttctagctaccttaactggtatcagcaaaaacctgggaaagcccccaagctgcttatctatgcggcatcctccctccaaagtggagttcccagtcggttcagtggttccggctcagggactgactttaccctcacaatcagctcattgcaaccagaggactttgcaacgtattactgtcagcaaagctactcaacgccgcctacgttcggtcccggaaccaaagttgagattaaagtagacgaacaccatcatcatcatcaccat[0197]atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggcctcaccttcagtagctataacatgggctggttccgccaggctccagggcaaggccttgaggctgtagcatctattacctggagtggtcgggacacattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaactccaagaacactctctatctgcaaatgaacagcctgcgcgcggaggacacggccgtttattattgtgctgcaaacccctggccagtggcggcgccacgtagtggcacctactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctcatctggcggcggcggttctggtggaggaggtagtggggggggaggaagcggagggggtggctcagggaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccag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