CN112980897B 含有二高-γ-亚麻酸的微生物油的制备方法 （株式会社日水）

201480066445.82014.12.04号含有二高-γ-亚麻酸的微生物油的制备方法本发明提供了一种含有二高-γ-亚麻酸的养基中添加至少两种类型的Δ5去饱和酶抑制5去饱和作用活性或丧失了Δ5去饱和作用活性的微生物以产生所述含有二高-γ-亚麻酸的微生物油。通过本发明的制备方法得到的含有二高-γ-亚麻酸的微生物油中花生四烯酸含量低2在所述液体培养基中培养高山被孢霉SAM1860，以产生所述含有二高-γ-亚麻酸的微所述至少两种类型的Δ5去饱和酶抑制剂中的3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤((d)通过反相色谱从所述纯化的混合物进行二高-γ-亚麻酸或二高-γ-亚麻酸的低级3γ-亚麻酸的微生物油和含有二高-γ-亚麻酸的微生物生物质”的中国发明专利申请的被孢霉(Mortierellaalpina)的微生物中DGLA已知作为花生四烯酸(下文中也称为ARA)的[0005]例如，日本专利申请公开号(JP-A)H5-091887公开了一种制备DGLA或含有DGLA的脂质的方法，该方法包括培养具有产生花生四烯酸的能力但具有减小的或丧失了Δ5去饱ANo.H5-091887还公开了在Δ5去饱和酶胞通过从产脂质微生物的细胞萃取含甘油三酯的油/脂肪而获得，所述微生物产生含有长[0010]本发明的目的是提供能够用来有效地获得含有二高-γ-亚麻酸的油的微生物油和微生物生物质，所述含有二高-γ-亚麻酸的油的花生四烯酸含量低于通过传统方法获得的4生物油具有的花生四烯酸相对于二高-γ-亚麻酸(花生四烯酸/二高-γ-亚麻酸)的重量比为[0015]合意地，微生物油的甘油三酯含量大于或等于70％重量，更优选地大于或等于花生四烯酸相对于二高-γ-亚麻酸的重量比合意地小于或等于1/20，或本文中对此比率公[0020]另一个方面是衍生自微生物油且包含二高-γ-亚麻酸酯的低级醇酯组合物，或衍合物的药物施用于患有炎性疾病或变应性疾病或处于罹患炎性疾病或变应性疾病的风险[0024]本发明的更多的方面是与微生物细胞组合的含有如本文所定义的任意微生物油5[0028]一个方法方面是制备含有二高-γ-亚麻酸的微生物油，诸如本文公开的任何微生[0030]在所述液体培养基中培养具有减小的Δ5去饱和作用活性或丧失了Δ5去饱和作[0031]至少两种类型的Δ5去饱和酶抑制剂中的一个可以是芳基苯甲酰胺Δ5去饱和酶甲酰胺的所述Δ5去饱和酶抑制剂可以是由式(I)所表示的二氧杂二环[3.3.0]辛烷衍生基)-3,7-二氧杂二环[3.3.0]辛烷、2,6-双-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-3,7-二氧杂二环6[0041]另一个方法方面是由如本文提出的任何微生物油制备如上文所提出的低级醇酯[0042](a)通过所述微生物油的分别水解或醇解获得游离脂肪酸或脂肪酸的低级醇酯的酸具有至少20个碳原子的游离脂肪酸或低级醇酯如，可以通过反相分配型柱色谱通过制备如所述的低级醇酯组合物或游离脂肪酸组合物，然后进行二高-γ-亚麻酸的低级醇酯或二高-γ-亚麻酸的分级分离和纯化来纯化或制备低[0045]另一个方法方面是制备包含二高-γ-亚麻酸的低级醇酯组合物或游离脂肪酸组合[0046](a)通过在液体培养基中培养微生物以产生二高-种类型的Δ5去饱和酶抑制剂存在下减少或丧失Δ5去饱和作用活性而抑制了产生花生四烯酸的功能从而产生其中花生四烯酸相对于二高-γ-亚麻酸的重量比小于1/13的所述微生[0049]在步骤(c)中，可以纯化所述混合物以获得其中脂肪酸具有至少20个碳原子的脂[0050](d)通过反相色谱从所述纯化的混合物进行[0053]根据本发明，可以提供能够用来有效地获得含有二高-γ-亚麻酸的油的微生物油和微生物生物质，所述含有二高-γ-亚麻酸的油的花生四烯酸含量低于通过传统方法获得[0054]根据本发明，可以提供制备含有的脂质的花生四烯酸含量低于通过传统方法获得的油的花生四烯酸含量)以及二高-γ-亚麻酸的游离脂肪酸和二高-γ-亚麻酸的低级醇酯(所述二高-γ-亚麻酸的游离脂肪酸和二高-γ-亚麻酸的低级醇酯的花生四烯酸含量低于通过传统方法获得的游离脂肪酸和低级醇7[0056]本发明的微生物油是包含DGLA作为油的脂肪酸成分并且按花生四烯酸相对于DGLA的重量比(ARA/DGLA)计具有小于1/13的含量脂肪酸成分并且按ARA相对于DGLA的重量比(ARA/DGLA)计具有[0058]尽管DGLA和ARA的含量比可以定义为重量比(ARA/DGLA)，但这也可以表示为重量[0059]根据本发明，提供了含有DGLA且DGLA相对于ARA的重量比(DGLA/ARA)大于或等于13的微生物油，以及含有DGLA且DGLA相对于ARA的重量比(DGLA/ARA)大于或等于13的微生物生物质。在此之前DGLA/ARA(重量比)大于或等于13的微生物油和微生物生物质是未知含有与常规油相比较高DGLA纯度的DGLA和较低ARA含[0060]本发明的微生物油是通过在合适的培养基中培养产生含DGLA的脂质的微生物并纯化工艺将DGLA与ARA分离是非常困难的。通过本发明可以提供在粗制微生物油的阶段时产品的精炼形式和/或化学加工下游形式中获得非常高的DGLA/ARA8术人员熟悉这些术语并且可以通过参照它们的具体组成来区分粗制微生物油和精制微生[0074]本发明的微生物油包含DGLA并且具有大于或等于13的DGLA/ARA(重量比)。DGLA/微生物油被精炼等，得到的ARA含量可以是接近10％重量使得DGLA纯度可能不足以通过纯9[0075]微生物油中DGLA的含量可以基于微生物油的总重量为10％重量或更大，优选地具有很少ARA。微生物油中ARA的含量可以为0.03％重量或更大，0.01％重量或更大，酯的重量含量小于或等于99％重量。微生物油中甘油三酯的重量含量可以是100％重量，[0079]微生物油的饱和脂肪酸含量优选地相对于粗制生物油的总重量为小于或等于[0080]应该理解的是对于微生物油的各种参数的上述可选值通常可独立地获得并且可[0084]根据本发明的含有DGLA的脂质的制备方法或微生物油的制备方法可以是包括以液体培养基中培养具有减小的Δ5去饱和作用活性或丧失了Δ5去饱和作用活性的微生物在所述液体培养基中培养通过使能够产生花生四烯酸的微生物突变而获得的具有减小的Δ5去饱和作用活性或丧失了Δ5去饱和作用活性的微生物，以产生含有二高-γ-亚麻酸的是如下方法：通过培养通过使能够产生花生四烯酸的微生物突变而获得的具有减小的Δ5来制备在脂质中具有相对于二高-γ-亚麻酸降低的花生四烯酸含量的脂质的方法，并且所[0087]已知的产生用于制备过程中的脂质的微生物优选地是选自由以下属的微生物组疫霉属(Phytophthora)、青霉菌属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉菌属(Mucor)、镰孢属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属[0088]微生物进一步优选地是具有减小的Δ5去饱和作用活性或丧失了Δ5去饱和作用进一步更优选地是属于被孢霉属并且通过在具有ARA产生功能的微生物中进行突变或使具有ARA产生功能的微生物突变而获得的具有减小的Δ5去饱和作用活性或丧失了Δ5去饱和[0089]具有ARA产生功能的被孢霉属的微生物的例子是属于被孢霉亚属的微生物，诸如长孢被孢霉(Mortierellaelongate)、微小被孢霉(Mortierellaexigua)、蓑衣被孢霉(Mortierellahygrophila)和高山被孢霉(Mortierellaalpine)。低Δ5去饱和作用活性被靶向突变的微生物的形式可以是生长中的微生物胞体(菌丝等)或被孢霉SAM1860(发酵研究所(FermentationResearchInstitute)登记号3589)可以用作[0093]为了培养低Δ5去饱和作用活性微生物，微生物株的孢子或菌丝或通过预先培养[0097]对这些培养基组分没有特别的限制，只要这些组分的浓度不干扰低Δ5去饱和作期间的通气速率可以是对这种充气通常使用[0099]常规固体培养基可以用作用于培养低Δ5去饱和作用活性微生物的固体培养基。这样的固体培养基的例子是琼脂培养基、麦芽提取物琼脂培养基、麦芽琼脂培养基、萄糖琼脂培养基(商品名为“马铃薯右旋糖琼脂培养基”，马铃薯右旋糖琼脂：PDA)、发明人已经发现通过这种组合它们可以实现DGLA/ARA比的显著增加，能制备具有极高增加DGLA/ARA比。2-氨基-N-(3-氯苯基)苯甲酰胺是氨基苯甲酸苯胺(anthranilic[0105]第二种类型Δ5去饱和酶抑制剂的例子可以是由下式(I)所表示的二氧杂二环和R6各自独立地表示氢原子或具有1-3个碳原子杂二环[3.3.0]辛烷衍生物可以是化学合成的产物或来自天然产品的的添加方式没有特殊限制，且这种方式可以根据所采用的Δ5去饱和酶抑制剂的类型和形用基本上与芝麻油不混溶的有机溶剂从芝麻油获得的提取物、芝麻籽的溶剂提取物、这些天然提取物可以添加到培养微生物的液体培养基中。可以使用含有这些Δ5去饱和酶以是2-氨基-N-(3-氯苯基)苯甲酰胺(或前面列举的其他第一物的组合。更优选的是2-氨基-N-(3-氯苯基)苯苯氧基)-3,7-二氧杂二环[3.3.0但在液体培养基的情况下，每天在液体培养基中添加Δ5去饱和酶抑制剂的浓度为优选为虑到诸如提取物内包含的有效组分的量的因素，液体培养基中Δ5去饱和酶抑制剂的总量的量的比率没有特殊的限制，并且这种比率可以根据所采用的Δ5去饱和酶抑制剂的类型1-1:100,优选为10:1-1:10,且更优选为5:1-[0116]对Δ5去饱和酶抑制剂的添加时间没有特殊限制，并且这种添加可以每天进行一间隔的组合进行这些添加。Δ5去饱和酶抑制剂的添加时间可以根据微生物的生长状态适离。分离过程优选地包括从在培养中使用的培养基分离培养的微生物生物质(微生物生物醇-水的单层性溶剂的萃取可以获得良好的结果。通过减压从萃取物中蒸馏掉有机溶剂获[0130]被包含作为微生物油的脂肪酸成分的DGLA可以通过使用催化剂转变成低级醇酯通过所述微生物油的水解或醇解获得脂肪酸的游离脂肪酸或低级醇酯；(b)精馏所述脂肪肪酸具有至少20个碳原子；以及(c)通过反相分配型柱色谱从所述游离脂肪酸或低级醇酯进行二高-γ-亚麻酸的游离脂肪酸或低级醇酯的分级分离和纯化，其中所述脂肪酸具有至物油的醇解获得脂肪酸的低级醇酯；(b)精馏脂肪酸的低级醇酯的混合物以获得所述脂肪酯进行二高-γ-亚麻酸的低级醇酯的分级分离和纯化，其中所述脂肪酸具有至少20个碳原生物油的水解获得游离脂肪酸；(b)精馏所述游离脂肪酸的混合物以获得具有至少20个碳原子的游离脂肪酸；以及(c)通过反相分配型柱色谱从所述具有至少20个碳原子的游离脂[0134]本文中的低级醇的例子是具有3个或更少的碳原子的醇，特别是乙醇、甲醇等。室温对油进行1-24小时处理而获得。脂肪酸的乙酯通过用1％-20％的硫酸乙醇等在25℃-常用于萃取或精炼脂肪酸的方法从分解液萃取或精炼D[0140]使用本发明的微生物油作为原料制备通过上述方法获得的DGLA的游离酸或低级作为油的脂肪酸成分并且其ARA相对于DGLA的含量大于或等于13，如由重量比(DGLA/ARA)用于测量微生物生物质中的DGLA和ARA，只要该方法是通常用于测量微生物生物质中DGLA以使用气相色谱在萃取或不萃取酯形式的条件下对脂肪酸中的脂肪酸含量(％)进行分析。钠等以0.1M-10M的浓度在25℃-100℃进行15-60分钟的处理。对于在酯化后所述酯形式的上述的DGLA和DGLA/ARA比大于或等于13的微生物油。为了从此液体培养基回收微生物油，液体培养基优选地具有按干燥的微生物生物质的重量计大于或等于2.5g/L的微生物含量。这样的液体培养基有效地获得具有高DGLA/ARA比的疮和银屑病。类固醇或其他治疗剂共同给药而用于上述医疗用途中的任一种或供[0162]在本发明的其他方面中，炎性疾病可以是来自由下[0163]需要理解的是，用于治疗炎性疾病/变应性疾病的药物是当发现或怀疑一种或多另一方面，用于预防炎性疾病/变应性疾病的药物是用于抑制一种或多种症状的发生的药其中添加了0.02％重量芝麻素的平板培养基D和其中添加了0.01％重量芝麻素和0.01％重基添加或不添加所提到的一种或多种Δ5去饱和酶抑制剂以达到所列举的浓度。每个平板[0169]使用每个为100μL的高山被孢霉突变株SAM1860的孢子悬液接种平板培养基A-E中[0170]在培养结束后，每个含有其微生物生物质的平板培养基被切成大致1cm的样品楔收己烷的上清液层。然后通过蒸馏去除溶剂以获得微生物油A-E的每个单个平板培养基约脂肪酸乙酯组合物A-E中的脂肪酸成分(％)进行气相色谱分析。用于气相色谱的分析条件体培养基H和添加了10mg芝麻素和10mg2-氨基-N-(3-氯苯基)[0188]在液体培养基F-I在121℃灭菌15分钟后，将1mL高山被孢霉突变株SAM1培养液体培养基接种到各个液体培养基中并且以200rpm的旋转速度和28℃温度进行振荡的2-氨基-N-(3-氯苯基)苯甲酰胺加入到液体培养基H,以及将5获自液体培养基G。0.6g干燥的微生物生物质(干燥的微生物生物质H)获自液体培养基H。0.6g干燥的微生物生物质(干燥的微生物生[0189]将175mL己烷加入到微生物生物质F-I中的每个以萃取液体，在室温下搅拌30分溶液，并且在80℃进行反应30分钟以进行乙基酯化。在中和反应后向液体中加入0.18mL脂肪酸乙酯G。从微生物油H获得67.6mg脂肪酸乙酯,即脂肪酸乙酯H。从微生物油I获得[0197]提供了在两级中装有圆盘涡轮式搅拌桨的1升(1L)发酵缸。调整搅拌桨在发酵缸[0198]将500mL含有2％葡萄糖和1％酵母提取物的培养基(pH6.0)置于4个1L发酵缸中加了50mg芝麻素的液体培养基K，添加了50mg2-氨基-N-(3[0199]在液体培养基J-M中的每一个在120℃灭菌20分钟后，将20mL缺少Δ5去饱和酶的第11天，将50mg灭菌的芝麻素加入到液体培养基K,将50mg灭菌的2甲酰胺加入到液体培养基L,并将50mg灭菌的芝麻素和50mg2-氨基-N-(3-氯苯基)苯甲酰燥的微生物生物质L获得195.5mg微生物油，即微生物油L。从干燥的微生物生物质M获得552.0mg微生物油，即微生物油M。通过薄层色谱/火焰离子化检测器(TLC/FID)法乙醇溶液，并且在80℃进行反应30分钟以进行乙基酯化。在中和反应后向液体中加入微生物油L)进行培养时,和当在两种类型Δ5去饱和酶抑饱和酶抑制剂的微生物油M抑制了液体培养基基-N-(3-氯苯基)苯甲酰胺将DGLA/ARA比被控制在[0242]表5显示了当HPLC收率为65％时ODS-HPLC纯化每种脂肪酸乙酯级分后的脂肪酸成[0248]因此要理解的是，本发明提供了包含具有高DGLA/ARA比的油的微生物和微生物有的花生四烯酸相对于二高-γ-亚麻酸(花生四烯酸/二高-γ-亚麻酸)的重量比为小于1/[0252]3.根据项1或2所述的微生物油，其中所述微生物油的甘油三酯含量大于或等于[0255]6.根据项1-5中任一项所述的微生选地，所述甘油三酯含量大于或等于90％重量并且所述花生四烯酸相对于二高-γ-亚麻酸[0257]8.根据项1-6中任一项所述的地，所述甘油三酯含量大于或等于90％重量且所述花生四烯酸相对于二高-γ-亚麻酸的重通过如