CN113116928B 预防或治疗眼疾的组合物及方法 （佛教慈济医疗财团法人）

WO2019139137A1,2019.07.18TW201510220A,2015.03.16fractiononmorphologicalchar本公开提供一种预防或治疗眼疾的组合物数小时于以胎牛血清及间质干细胞培养基佐剂补充的培养基中，以取得间质干细胞条件培养开也提供用于预防或治疗例如干眼症的眼部上21.一种医药组合物在制备用于预防或治疗有其需要的个体中眼部上皮组织病症的用其中所述间质干细胞培养基佐剂包含纤维母细胞生长因子-2、N-乙酰基-L-半胱氨酸3.根据权利要求1所述的用途，其中所述纤维母细胞生长因子-2在所述间质干细胞培4.根据权利要求1所述的用途，其中所述N-乙酰基-L-半胱氨酸5.根据权利要求1所述的用途，其中所述L-抗坏血12.一种组合物，其由根据权利要求1至11中任一项所取得的小于10kDa的所述部分和3中的炎性细胞激素或酶(2)。外用使用自体血清滴液提供模拟天然泪液的润滑以及某些生因子可增强组织再生及愈合作用(4-6)。它们于上皮损害中的修复能力及抗炎效果也业经相关领域中亟待解决的问题是研发用于有效预防或治疗干眼的医药2)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)及L-抗坏血酸-2-磷酸盐(L-胞生长因子-2在间质干细胞培养基佐剂中的浓度范围为5ng/mL至15ng/mL。于某些实施方[0006]于至少一个实施方案中，N-乙酰基-L-半胱氨酸在间质干细胞培养基佐剂中的浓4[0007]于至少一个实施方案中，L-抗坏血酸-2-磷酸盐在间质干细胞培养基佐剂中的浓[0008]于某些实施方案中，间质干细胞培养基包含约10ng/mL纤维母细胞生长因子2清(fetalbovineserum，FBS)及间质干细胞培养基佐剂(mesenchymalstemcellcultureadjuvant，MCA)补充的无酚红伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove’s[0017]本公开也提供用于治疗或预防干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)，5[0019]本公开也提供用于治疗或预防干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)，[0021]本公开也提供用于治疗或预防干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)，后，使用CCK-8测定计数细胞。对照组代表未经空气干燥处理的HCEC。R代表清爽润滑CEM表示以角膜上皮细胞生长试剂盒组分补充的角膜上皮细胞基本培养基。数值呈现为三6[0037]图8A至8E显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜的[0038]图9A至9E显示，来自使用不同滴眼液治疗圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜的扫7[0041]图12显示，于干燥应激研究中，通过CCK-8测量不同培养基制剂及ADSC-CM的0-[0042]图13A至13C显示，使用不同ADSC-CM部分治疗圈养于CEC室中的小鼠的泪液体ADSC-CM(图17C)、ADSC-CM30-100kDa(图17D)及ADSC-CM0-30kDa(图17E)的小鼠。放大：ADSC-CM(图19C)、ADSC-CM0-3kDa(图19D)、ADSC-CM0-1kDa(图19E)及IMDM(图19F)的小滴眼液治疗者及干燥对照组相比，经ADSC-CM及ADSC-CM的0-30kDa部分治疗者中的结膜8相比，经ADSC-CM以及ADSC-CM的<10kDa部分及ADSC-CM的<3kDa部分治疗者中的结膜MUC16[0053]图23A显示，使用ADSC-CM的0-30kDa部分或ADSC-CM的30-100kDa部分治疗的小鼠[0056]图25A至25E显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜[0057]图26A至26G显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜[0058]图27A至27F显示，来自使用不同滴眼液治疗的圈养于CEC中的BALB/c小鼠的角膜9员选择。于至少一个实施方案中，培养基选自由α最小必需培养基(alphaminimum养基组成的组。细胞可于包含胎牛血清或其他生长因子的多种培养基中培养以进行扩张。为制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂与其投予途径为生理上相容1591,1672-1673,866-885(AlfonsoR.Gennaroed.19thed.1995))以及Ghoshetal.,[0065]本公开提供一种制备脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)的方法，包括从个体单离脂肪来源的干细胞(ADSC)；将脂肪来源的干细胞维持于间质干细胞维持培养基中；15％胎牛血清(FBS)及间质干细胞培养基佐剂(MCA)补充的无酚红伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(IMDM)中培养36小时至132小时，以获得脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-[0067]于本公开的一个实施方案中，MCA包含约5ng/mL至15ng/mL纤维母细胞生长因子2(FGF-2)、1mM至5mMN-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)及0.1mM至0.5mML-抗坏血酸-2-磷酸酯[0073]本公开也提供用于预防或治疗干眼的脂肪来源干细胞的条件培养基(ADSC-CM)。于本公开的至少一个实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于30kDa的活性成分。于本公开的某些实施方案中，脂肪来源干细胞的条件培养基包含分子量小于Systems)的间质干细胞维持培养基中培养，如先前所述(10,11)。实验使用传代2至5次的[0081]将ADSC以每烧瓶1×106个细胞接种至150cm2组织培养烧瓶(BDFalcon,355001,血酸-2-磷酸酯(AsA2P,Sigma)的间质干细胞培养佐剂(MCA)补充的无酚红伊斯科夫氏改良[0083]使用MilliporeAmiconUltra-15离心管或SpectrumLabs中空纤维过滤器制备用Amicon离心浓缩器(分子量截止值(MWCO)＝30kDa、3kDa或1kDa)浓缩至最终浓度为1mg/[0084]经浓缩的条件培养基以IMDM稀释，加入细胞中以通过细胞计数试剂盒8对有存活[0085]对于经冷冻干燥的条件培养基测试，于5mL冷冻干燥管中制备经渗析的样本的等斯)的正常原代HCEC。令HCEC于以角膜上皮细胞生长试剂盒组分补充的角膜上皮细胞基本的培养基中，该培养基包含CEM(RefreshPlusLubricant滴眼液，缩写为R；Allergan,酰氨及MCA补充的IMDM(缩写为IMMCA，用作尚未经ADSC条件化的对照培养基)，以及ADSC-NY,USA)计数细胞，或分解于放射免疫沉淀测定(radio-immunoprecipitationassay，[0092]对于细胞存活测定，将10μLCCK-8试剂添加至如上所述的于包含100μL不同培养基的96孔培养板中生长的细胞中。细胞在37℃温育3小时。使用微量酶标仪(MicroQuant,BioTekInstruments,Inc.,Winooski,VT,USA)测量在450nm的吸收。结果绘制为均值±三[0093]对于免疫印迹分析，细胞以冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并使用含有Halt蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合液(Pierce,ThermoFisherScientific,Rockford,IL,USA)的RIPA缓冲液(Millipore,Billerica,MA,USA)于冰上分解20分钟。将细胞提取物于4℃以13,200rpm离心10分钟，并收集上清液用于实验。细胞提取物的蛋白质浓度使用Bradford氏方法蛋白质检定试剂盒(Amresco,Ohio,USA)通过Bradford氏方法以已知浓度偏二氟乙烯(PVDF)膜(Sigma)上。以含有0.1％Tween-20(PBS-T)和5％脱脂奶的PBS于室温封闭该膜1小时，然后于4℃使用适宜的一抗温育过夜，该一抗为兔单克隆抗Erk1/2隆抗磷Erk1/2(Thr202/Tyr204)抗体、兔单克隆抗P38促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)抗酶/c-JunNH2-末端激酶)抗体、用Seppro去除缓冲液(Sigma)以1:1000稀释的兔单克隆抗磷SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)抗体(CellSignalingTechnology,Beverly,MA,USA)、或以1:5000稀释的兔单克隆抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶)抗体(CellSignaling磷酸化的P38(P-P38)的表达及经磷酸化的Erk1/2(P-Erk1/[0098]所有实验过程均得到慈济大学实验室动物护理及使用委员会的批准。如先前所周龄的BALB/c小鼠暴露于相对湿度为10±3％且温度为21-25℃的CEC中，并且监控并维持CEC干眼组中，作为干眼对照组的一组不接受任何滴眼液，而其他三组分别接受下列滴眼[0102]通过Zone-Quick酚红棉线(日本昭和药品化工株式会社)的泪液吸收变色区域的长度估算泪液分泌。简而言，以4秒的标准时间移除过量泪液，然后用小镊子夹持Zone-ADSC-CM组小鼠分泌的泪液体积仍具有显著高于干燥对照组及以IMMCA治疗的小鼠的泪液[0106]将一滴1μL的1％孟加拉玫瑰红徐徐滴加至结膜囊内15秒后，使用下述VanBSA的PBS于室温封闭至少1小时。将载玻片以兔抗ZO-1(Mid)(1:100；Invitrogen,抗细胞角蛋白12(1:50；SantaCruz,SantaCruz,CA,USA)于4℃温育越夜，之后以AlexaFluor488驴抗兔IgG(H+L)(1:800；JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,USA)、Dylight550偶联的山羊抗鼠IgG(H+L)或Dylight550接合驴抗山羊IgG(H+L)(1:用pH＝9的DAKO靶标修复溶液(DAKO,Glostrup,Denmark)执行抗原修复15分钟。使用Histofine小鼠染色试剂盒(Nichirei,Tokyo,Japan)于8μm厚的切片上执行MUC16染色。以抗MUC16(1:50；SantaCruz,SantaCruz,CA,USA)将切片于4℃温育越夜，并最终使用Histofine简单染色最大PO染色10分钟。使用3,3’-二氨基联苯验，但不使用一抗。于分级的乙醇及二甲苯中脱水后，将切片封固于Histokit(HechtAssistent,Sondheim,Germany)中用帮助保持MUC16的连续表达。此外，该结果也显示，ADSC-CM组具有最佳的MUC16表达。脂中包埋8小时。最终，将样品于62℃聚合48小时，然后于透射电子显微镜(HitachiH-[0123]如上文制备例3中所述，制备不同ADSC-CM分子量大小的部分。获得了含有>进行的干燥应激研究如上文实施例2中所述。对于高渗透压应激研究，令HCEC生长至大约60％融合度，然后用新鲜培养基(311毫渗透克分子(mOsM))或含有90mM30kDa的ADSC-CM部分具有维持ADSC-CM的保护细胞的效果，该保护效果使细胞免于干燥应估，结果显示于图12中。含有0-1kDa的ADSC-CM部分于保护细胞不被干燥应激破坏中仍有[0128]使用动物活体研究进一步评估上文所制备的ADSC-CM部分的治疗干眼的效果。如透射电子显微镜(TEM)分析及扫描电子显微镜(S鼠中观察到小鼠角膜上皮中紧密连接相关蛋白ZO-1及紧连蛋白的表达量降低，但可通过[0131]如上文所述进行组织学分析，以比较不同分子大小的ADSC-CM部分对于角膜上皮[0132]图18A至图18H中，具有<10kDa及<3kDa的ADSC-CM部分逆转了于CEC诱导干眼中观图19G中，具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分逆转了于CEC诱导干眼中观察到的结膜杯MUC16表达。图20A至图20E显示圈养于CEC中以ADSC-CM及不同ADSC-CM部分治疗的小鼠的[0134]图21A至图21G显示圈养于CEC中以ADSC-CM及不同ADSC-CM部分治疗的小鼠的MUC16表达结果。经ADSC-CM(图21C)、具有<10kDa的ADSC-CM部分(图21D)及具有<3kDa的ADSC-CM部分(图21E)治疗的干眼具有比经具有>10kDa的ADSC-CM部分(图21F)及具有>3kDa的ADSC-CM部分(图21G)治疗者更高的MUC1[0135]图22A至图22F显示圈养于CEC中以ADSC-CM及0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分治有0至1kDa的ADSC-CM部分(图22E)治疗的干眼具有与非干燥对照组及以ADSC-CM治疗者类结果。其显示，具有0至30kDa、<10kDa及<3kDa的ADSC-CM部分显示与非干燥对照组及以ADSC-CM治疗者类似的MUC4表达水平，而于干燥对照组及以具有>10kDa及>3kDa的ADSC-CM[0137]图24显示以ADSC-CM及具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分治疗者的MUC4表达<30kDa的ADSC-CM部分的外部施用(图25E)保持了角膜上皮的微绒毛，并且具有与施用部施用保持了角膜上皮的微绒毛，并且具有与施用ADSC-CM者(图26C)及非干燥对照组(图(图26F)治疗的干眼不能保持干眼中诱导的角[0140]再者，图27A至图27F显示经具有0至3kDa及0至1kDa的ADSC-CM部分治疗的干眼的SEM结果。具有0至3kDa的ADSC-CM部分(图27D)及具有0至1kDa的ADSC-CM部分(图27E)两者均显示与非干燥对照组(图27A)及以ADSC-CM治疗者(图27C)中观察到类似的角膜上皮细胞小于1kDa的活性成分的ADSC-CM部分得以显著弥补该存活率下降。同时进行的免疫印迹分[0143]干燥CEC中的小鼠具有更多的蒸发，并因此具有更多的角膜荧光素染色及孟加拉味着保持角膜上皮的特征。ADSC-CM及其部分对于角膜的紧密连接的有益效果不仅通过共[0144]ADSC-CM及其部分不仅保护角膜上皮细胞的紧密连接，而且也保护结膜杯状细胞及膜相关粘蛋白MUC16表达。CEC小鼠的结膜杯状细胞密度显著下降，这一现象通过[0146]总之，本公开证明了ADSC-CM对于干燥诱导的眼表面损伤的效果，可能是通过[0149]1.ThedefinitionandclDefinitionandClassificationSubcommitteeoftheInternationalDryEye[0150]2.CourseyTG,dePaivaCS.ManagingSjogreSyndromedryeyewithanti-inflammatorytherapy.Clinicalophthalmology.2014；8:1447-58.[0151]3.PanQ,AngelinaA,MarroneM,StarkWJ,AkpekEK.Autologousserumeye[0152]4.ChenL,TredgetEE,WuPY,WuY.Paracrinefactorsofmesenchymalstemcellsrecruitmacrophagesandendotheliallineagecellsandenhancewound[0153]5.OsugiM,KatagiriW,YoshimiR,InukaiT,HibiH,UedaM.Conditionedmediafrommesenchymalstemcellsenhancedboner[0154]6.KwonSH,BhangSH,JangHK,RhimT,KimBS.Conditionedmediumofadipose-derivedstromalcellcultureinthree-dimensionalbioreactorsfor[0155]7.BeyazyildizE,PinarliFA,BeyazyildizO,HekimogluER,AcarU,DemirMN,etal.Efficacyoftopicalmesenchymalstemcelltherapyinthetreatment[0156]8.PawitanJA.Prospect[0157]9.GriescheN,LuttmannW,LuttmannA,StammermannT,GeigerH,BaerPC.Asimplemodificationoftheseparationmethodreducesheterogeneityof[0158]10.SunLY,HsiehDK,YuTC,ChiuHelectromagneticfieldontheproliferationanddifferentiationpotentialof60.[0159]11.SunLY,HsiehDK,SyuWS,LiYS,ChiuHT,ChiouTW.Cellproliferationofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsonbiodegradablemicrocarriers[0160]12.MatsuoT.Trehalosep[0161]13.HiguchiA,KawakitaT,TsubotaK.IL-6inductionindesiccated[0162]14.ZhengX,GotoT,ShiraishiA,OhashiY.Invitroefficacyofocular[0163]15.BarabinoS,ShenL,ChenL,RashidS,RolandoM,DanaMR.Thecontrolled-environmentchamber:anewmousemodelofdryeye.Investigative[0164]16.PaulyA,Brignole-BaudouinF,LabbeA,LiangH,WarnetJM,BaudouinC.Newtoolsfortheevaluationoftoxicocularsurfacechangesinthe[0165]17.vanBij[0166]18.SchaumbergDA,SullivanDA,BuringJE,DanaMR.Prevalenceofdryeye[0167]19.TsubotaK,KawashimaM,InabaT,DogruM,OgawaY,NakamuraS,etal.Theeraofantiagingophthalmologycomesofage:antiagingapproachfordryeye[0168]20.TsubotaK,KawashimaM,InabaT,DogruM,MatsumotoY,IshidaR,etal.Theantiagingapproachforthetreatmentofdryeye.Cornea.2012；31Suppl.1:S3-8.[0169]21.HarmanD.Aging:atheorybasedonfreeradicalandradiation[0170]22.YangD,WangW,LiL,PengY,ChenP,HuangH,etal.Therelativecontributionofparacrineeffectversusdirectdifferentiationonadipose-e59020.[0171]23.BurlacuA,GrigorescuG,RoscaAM,PredaMB,SimionescuM.Factorssecretedbymesenchymalstemcellsandendothelialprogenitorcellshave53.[0172]24.BianS,ZhangL,DuanL,WangX,MinY,YuH.Extracellularvesiclesderivedfromhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsprom[0173]25.Lopez-VerrilliMA,CaviedesA,CabreraA,SandovalS,WynekenU,KhouryM.Mesenchymalstemcell-derivedexosomesfromdifferentsourcesselectively[0174]26.MonselA,ZhuYG,GudapatiV,LimH,LeeJW.Mesenchymalstemcellderivedsecretomeandextracellularvesiclesforacutelunginjuryandother