T-CVMA 308-2025 非洲猪瘟病毒抗体检测化学发光免疫分析方法

中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。1非洲猪瘟病毒抗体检测化学发光免疫分析方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语ASF：非洲猪瘟（Africanswinefever）ASFV：非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus）BSA：牛血清白蛋白（BovineserumalbumCLIA：化学发光免疫分析（ChemiluminescenceimmunoaHRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidasNBSJ：抗ASFVp72蛋白抗体NBSJ（NanobodyNBSJagainstASFVp72protein）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersalin26.2抗ASFVp72蛋白抗体NBSJ，制备方6.3HRP标记抗ASFVp72蛋白抗体NBSJ，制备方法见若在1周内检测，可置2℃~8℃条件下保存；若超过39检测操作步骤9.1配置洗涤液将25×浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至工作浓度备9.2包被弃去液体，每孔加300μL洗涤液洗板3次，弃去残液，置9.4封闭每孔加200μL封闭液，置37℃条件下孵育1h；洗涤1次后，置于吸水纸上拍干。9.5加待检样本和对照样本孵育别在对应的检测孔中加入稀释的样本100µL，同时设置阳性对照和阴性对照各2孔，每孔100µL。封板膜封板，37℃条件下孵育45min。9.7加酶标记抗体孵育9.9加底物显色结果计算以样本的阻断率（PI）为标准，即PI=（1-检测样本的CLIA值/阴性对照平均CLIA值）4若样本PI值≥30%时，判定为非洲猪瘟5ASFVp72抗原的制备A.1生产用菌种的培养表达ASFVp72蛋白的工程菌种为BL21-ASFV-p72，将工程菌种按1:100比例接种TB培养液μg/mL卡那霉素），在37℃条件下，以220r/min振荡培养5h。A.2ASFVp72蛋白的表达A.3ASFVp72蛋白的纯化将收集的菌液置2℃~8℃、以6000r/min离心10min，收集12000r/min离心10min，收集包涵体沉淀，将包涵体沉淀用BindingBuffer混匀重悬，冰浴1h，尽量使过夜结合；打开柱子阀门收集流穿液，使用BindingBuffer洗涤杂蛋白，吹打混匀后打开柱子阀门，将度不低于1mg/ml。6表达抗ASFVp72蛋白抗体NBSJ的工程菌种为BL21-ASFV-NBSJ，将工程菌种按1:100比例接种TB培养液（含100μg/mL卡那霉素），在37℃条件下，以220r/min振荡培养5h。取新鲜培养的工程菌种BL21-ASFV-N37℃条件下，以220r/min振荡培养至OD600nm值为0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，37℃条12000r/min离心10min，收集包涵体沉淀，将包涵体沉淀用BindingBuffer混匀重悬，冰浴1h，尽量使将溶解完成的菌体沉淀，4000r/min，4℃离心20阀门，将流出的液体进行收集；经SDS凝胶电泳分析，收集含有NBSJ目的蛋白的洗脱液；NBSJ的纯度不低于90%，浓度不低于1mg/ml。7HRP标记抗ASFVp72蛋白抗体NBSJ加入160mmol/L的乙二醇0.5mL，室温30min。加入纯化的抗ASFVp72蛋白抗体N上述溶液装入透析袋中，置2000mL的0.05mmol/L碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜。透析液吸至硫酸铵溶液，4℃放置30min，4℃条件下4000r/min离心20min，弃上清。将沉淀溶于少量PBS溶液中离心30min，吸取上清，无菌定量分装，-20℃以下备用。8将纯化的ASFVp72重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，颈部肌肉注射免疫健康猪，1mg/接ELISA方法进行检测，当血清效价不9溶液配制称取1.59gNa2CO3称取20gBSA，加入PBS溶液定容至100称