2026年高考生物终极冲刺：抢热点04 基因编辑技术实现HIV抵抗（解析版）

/热点04基因编辑技术实现HIV抵抗自2025年以来，科学家们在利用基因编辑技术实现HIV抵抗领域取得了重大科研突破，这些突破使该话题在公众视野和学术圈中同时处于高度关注状态，为高考命题提供了极为丰富的素材。“基因编辑+HIV抵抗”这一主题恰好串联了基因工程的基本原理、病毒遗传物质的结构与复制、突变与自然选择、生物技术与伦理等多个模块，天然适合用于综合性命题。猜押1HIV抵抗机制1.CCR5是HIV入侵人体Ｔ细胞的主要辅助受体之一、有科研人员为了使婴儿一出生就具有抵抗艾滋病的能力，通过基因编辑破坏了受精卵中的CCR5基因，该做法引起了民众普遍的担忧。下列叙述错误的是（

）A．CCR5基因可能还参与了其他生理过程的调控B．被编辑个体受其他疾病感染的风险可能会提高C．该技术符合人类伦理道德，但可能存在潜在的安全风险D．基因编辑技术有可能因编辑对象错误（脱靶）造成不可预知的后果2.以下为HIV的结构模式图，HIV主要侵入并破坏人体的辅助性T细胞，使免疫系统瘫痪、功能瓦解，最终使人无法抵抗其他病毒、病菌的入侵，或发生恶性肿瘤而死亡。下列说法正确的是（）A．病毒都只含有蛋白质和核酸这两种组成成分B．病毒可以看作一个系统，也可以看作生命系统的个体层次C．HIV侵入人体辅助性T细胞来合成所需物质体现了细胞是生命活动的基本单位D．德国科学家施莱登和施旺用不完全归纳法得出除病毒外的一切生物都是由细胞构成这一结论【答案】1．C2．C【解析】1.A、CCR5基因除了控制T细胞上与HIV识别的受体之外，可能还参与其他生理过程的调控，因此编辑受精卵中的CCR5基因，有可能影响其他生理过程，A正确；B、基因编辑后，基因的序列发生改变，而基因的表达具有选择性，也可以相互影响，若基因选择性表达受干扰后，可导致被编辑个体受其他疾病感染的风险可能会提高，B正确；C、胚胎就是人生命的一个自然阶段，他的发育成长决定于他的基因，而如果要改变他的某种属性，就必须将之看成一个人，并得到庄严的合法授权，而不能将之看成一个私自的实验品。因此对人类形成胚胎的受精卵进行基因组编辑将带来伦理道德问题，C错误；D、基因编辑时的引导序列改变可能导致识别错误，导致剪切错误，造成不可预知的后果，因此可能会引起民众的担忧，D正确。2.A、据图所示HIV的结构，有包膜且为来自宿主细胞的细胞膜，说明HIV的组成成分除核酸和蛋白质外，还有磷脂等脂质物质，A错误；B、系统是由彼此间相互作用、相互依赖的组分有规律地结合而形成的整体；病毒是由相应的组分形成的一个整体，故可视为系统，但因其没有细胞结构，故不能视为独立的生命系统，B错误；C、HIV虽没有细胞结构，但它侵入人体的辅助性T细胞来合成所需物质，就说明没有细胞结构的生物也需要寄生在活细胞内，体现了细胞是生命活动的基本单位，C正确；D、施莱登和施旺用不完全归纳法得出细胞学说，该学说的适用对象为动植物，不包括病毒和原核生物，即德国科学家施莱登和施旺用不完全归纳法得出一切动植物都是由细胞构成的这一结论，D错误。1.HIV的生命周期与潜伏病毒库①入侵：HIV表面gp120与CD4受体及CCR5/CXCR4共受体结合，融合进入细胞②逆转录：病毒逆转录酶以RNA为模板合成DNA③整合：病毒整合酶将病毒DNA整合到宿主细胞基因组中④转录与翻译：整合的前病毒DNA利用宿主转录翻译机制合成病毒蛋白⑤组装与释放：新的病毒颗粒组装后从细胞释放猜押2CRISPR/Cas9基因编辑原理与HIV抵抗1．HIV病毒是一种致病性强的逆转录病毒，其遗传物质是单链RNA。科学家利用基因编辑技术CRISPR-Cas9，精准识别并切割整合到宿主细胞基因组中的HIV病毒DNA，阻止其复制和表达。下列叙述正确的是（

）A．HIV病毒通过DNA聚合酶将RNA转化为DNA，并整合到宿主细胞基因组中，形成潜伏感染B．CRISPR-Cas9基因编辑技术能够精准切割宿主细胞DNA，阻止其复制和表达，可治疗艾滋病C．利用CRISPR-Cas9治疗艾滋病应针对患者的辅助性T细胞进行基因编辑D．与HIV感染者握手、拥抱、共用牙刷和剃须刀、纹眉器械不会使人感染HIV2．获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的治疗策略研究的持续深入和新兴技术的不断发展为人类免疫缺陷病毒（HIV）的清除提供了可能。其中，CRISPR-Cas基因组编辑作为一种为治愈HIV-1带来了希望的新型疗法，而逐渐步入医学领域的探讨课题中。某研究团队开发了一种工程化外泌体系统（EMT-Cas12a），实现了HIV-1前病毒DNA在体外和体内的切除。回答下列问题。(1)EMT-Cas12a作为一种递送系统，它承担了基因工程中_____的功能，能够将Cas12amRNA和crRNAs靶向递送至CD4+T细胞，从而独特地优化了细胞特异性靶向。(2)crRNA是CRISPR-Cas系统的核心向导分子，能携带与入侵核酸互补的序列信息，将Cas蛋白精准引导至HIV基因中的目标位点。该团队使用序列数据库和序列比对工具，鉴定出了碱基序列为5'-CUGGUACAGUUUCAAUAGGACUG-3'的多毒株靶向crRNA，由此确定受该病毒感染的宿主细胞模型的互补核DNA链的碱基序列为_____。(3)工程化的外泌体经CD4+T细胞表面的受体识别后而被选择性摄取，这体现了细胞膜_____的功能。之后，Cas12amRNA和crRNAs则被递送至细胞质中，Cas12a在靶细胞中表达，并在crRNAs的引导下切割HIV感染的CD4+T细胞中的前病毒基因组片段中的_____。在研究人员使用获得的上述前病毒基因片段构建PEC12cr质粒的首轮PCR中，只用引物甲和引物乙获取目的基因的原因是_____。经过八轮循环后，含有引物甲的前病毒基因片段有_____个（用数字作答）。随后，团队成员将目的基因和_____等元件构建多个不同的PECl2cr质粒。这些质粒分别与pECD63L和pENb1质粒共转染HEK293F细胞以包装加载活性EMT-Cas12a。(4)研究人员通过蛋白质印迹法，以BlankEXO为对照，分析了EMT-Cas12a中外泌体标志物CD63、TSG101和CD81的表达情况，发现EMT-Cas12a的外泌体蛋白独特地显示出一个额外的约65kDa（相对分子量）的CD63条带。设计实验验证EMT-Cas12a的表征与分泌蛋白的合成和运输中生物膜系统各部分之间的协调配合有关，简要写出实验思路和预期结果_____。(5)为检测外泌体递送的EMT-Cas12a系统靶向编辑HIV-1感染细胞的基因组的效果，科研人员对提取的细胞DNA的PCR扩增产物进行了琼脂糖凝胶电泳和T7核酸内切酶I（T7EI）酶切检测，其电泳图谱如下图所示：注：（1）不同的EMT-Cas12a处理组：MF/OS/PD：阳性对照：POS：阴性对照：RP：（2）图中“M”（DNA分子量Marker）为标准参照物；（3）T7EI是一种核酸内切酶，能特异性识别并切割DNA双链中碱基配对错误的区域，这一步是为了检测基因组编辑造成的突变：（4）检测原理：如果Cas12a成功编辑了靶位点，该区域会出现插入或缺失，导致PCR产物的两条DNA链不完全互补，形成错配。T7EI会切割这些错配区域，产生两条更小的DNA片段。与PCR扩增产物电泳图谱相比，T7EI酶切后出现了两条明显的小条带（MF/OS/PD组的条带旁出现两条明显的阴影小条带），这说明PCR产物中_____（填“存在”或“不存在”）DNA双链中碱基配对错误的区域。【答案】1．C2．(1)载体(2)5'-CAGTCCTATTGAAACTGTACCAG-3'（或3'-GACCATGTCAAAGTTATCCTGAC-5'）(3)控制物质进出细胞（或进行细胞间信息交流）磷酸二酯键PCR技术可以特异性扩增目的基因255启动子、终止子、标记基因(4)实验思路：用放射性同位素标记氨基酸，追踪其在细胞内的分布顺序；预期结果：放射性依次出现在核糖体、内质网、高尔基体、细胞膜、外泌体中(5)存在【解析】1．A、HIV病毒通过逆转录酶将RNA转化为DNA，而不是DNA聚合酶，DNA聚合酶是用于DNA复制过程中合成DNA子链的，A错误；B、CRISPR-Cas9基因编辑技术能够精准切割的是整合到宿主细胞基因组中的HIV病毒DNA，而不是宿主细胞DNA，B错误；C、HIV主要攻击辅助性T细胞，所以利用CRISPR-Cas9治疗艾滋病应针对患者的辅助性T细胞进行基因编辑，这样可以有效阻止HIV在辅助性T细胞内的复制和表达，C正确；D、与HIV感染者握手、拥抱一般不会使人感染HIV，但共用牙刷和剃须刀、纹眉器械可能会因接触到感染者的血液等体液而感染HIV，D错误。2．（1）EMT-Cas12a作为递送系统，将Cas12amRNA和crRNA靶向送至CD4⁺T细胞，承担了载体的功能，实现了细胞特异性靶向。（2）crRNA碱基序列为5'-CUGGUACAGUUCAAUAGGACUG-3'，根据碱基互补配对原则，对应的互补DNA链碱基序列为：5'-CAGTCCTATTGAACTGTACCAG-3'（或3'-GACCATGTCAAGTTATCCTGAC-5'）（3）外泌体经CD4⁺T细胞表面受体识别后被选择性摄取，体现了细胞膜控制物质进出细胞（或进行细胞间信息交流）的功能。Cas12a在crRNA引导下切割HIV前病毒基因组片段中的磷酸二酯键。只引入引物甲和引物乙和目的基因获取目的基因的原因是PCR技术可以特异性扩增目的基因。经过8轮PCR循环，含引物甲的前病毒基因片段有2⁸-1=255个。构建多个不同的PEC12cr质粒，需要将目的基因和启动子、终止子、标记基因等元件构建在一起。（4）实验思路：用放射性同位素（如³H-亮氨酸）标记EMT-Cas12a细胞中的氨基酸。追踪不同时间放射性在细胞内的分布，观察其在核糖体、内质网、高尔基体、细胞膜及外泌体中的出现顺序。若放射性依次出现在核糖体→内质网→高尔基体→细胞膜→外泌体，则验证了生物膜系统各部分在分泌蛋白合成和运输中的协调配合。预期结果：放射性标记的EMT-Cas12a依次出现在核糖体、内质网、高尔基体、细胞膜，最终富集到外泌体中，证明生物膜系统通过膜融合和运输协调完成分泌过程。（5）与PCR扩增产物电泳图谱相比，T7EI酶切后出现了两条明显的小条带，说明PCR产物中存在DNA双链中碱基配对错误的区域。（依据：T7EI特异性切割碱基配对错误的双链DNA区域，产生两条更小的片段，电泳中出现新条带即证明存在错配区域。）、1.CRISPR/Cas9系统的工作原理CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因编辑系统。其工作原理可概括为：引导RNA（gRNA/sgRNA）：一段约20个核苷酸的RNA序列，通过碱基互补配对特异性识别目标DNA序列；Cas9蛋白：一种核酸内切酶，在gRNA的引导下切割目标DNA，产生双链断裂；DNA修复：细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复断裂，实现基因敲除（NHEJ引入插入/缺失突变）或基因敲入（HDR引入外源序列）；在HIV抵抗的应用中，CRISPR/Cas9可通过两种路径发挥作用：一是敲除宿主细胞的CCR5基因，使病毒无法进入细胞；二是直接切割整合在宿主基因组中的HIV前病毒DNA，将其“剪碎”清除。一、单选题1．HIV侵入人体后会与T细胞相结合，是由于T细胞及一些黏膜上皮细胞表面含有CCR5的特殊蛋白质（由CCR5基因编码)。某医疗团队从一名天生具有HIV抵抗力、且CCR5基因异常的捐赠者（甲）身上取得骨髓，并将其移植到一名患有白血病、并患有HIV(感染HIV十多年）的患者身上。结果不但治愈了白血病，而且彻底清除了患者身上的所有HIV。下列说法不正确的是A．可通过对CCR5基因编辑或敲除实现艾滋病免疫B．捐赠者（甲）感染HIV后，体内既产生了体液免疫，也产生了细胞免疫C．艾滋病患者肿瘤的发病率大大上升，可能是因为HIV是一种致癌因子D．艾滋病患者的HIV不侵染B细胞，是因为B细胞的CCR5基因没有表达【答案】C【分析】本题以艾滋病的治疗为背景，考查遗传信息的转录和翻译、免疫等知识，要求考生识记HIV的致病原理，能紧扣题干信息“HIV侵入人体后只与T细胞相结合，是因为只有T细胞表面含有CCR5的特殊蛋白质”准确判断各选项，属于考纲识记和理解层次的考查．【详解】根据题意分析，通过对CCR5基因编辑或敲除可以阻止HIV与T细胞表面的CCR5结合，进而控制HIV患者体内的HIV对T细胞的感染，最终实现艾滋病免疫，A正确；捐赠者（甲）天生具有HIV抵抗力，捐赠者（甲）感染HIV后，体内既能分化出浆细胞产生抗体，与HIV结合，产生体液免疫，HIV进入细胞后，效应T细胞能与宿主细胞结合，使其裂解死亡，产生细胞免疫，B正确；艾滋病患者肿瘤的发病率大大上升，是因为T细胞被攻击，免疫系统的监控和清除功能下降，C错误；艾滋病患者的HIV不侵染B细胞，是因为B细胞的CCR5的基因没有表达，不会产生由CCR5基因编码的特殊蛋白质，D正确。2．下列关于生物技术、物质或工程在生产生活中的应用，对应错误的是（）A．CRISPR/Cas9系统——对特定基因进行编辑或敲除B．磷脂分子脂质体——运载药物或RNA疫苗进入细胞C．沼气发酵工程——生产燃料、作物肥料并减轻污染D．逆转录酶抑制剂——治疗HIV等各种RNA病毒感染【答案】D【分析】基因工程技术（重组DNA技术）的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。【详解】A、CRISPR-Cas9系统是一种基因编辑技术，它能够通过向导RNA识别特定的DNA序列，然后利用Cas9蛋白对特定基因进行编辑或敲除，A正确；B、磷脂分子可以形成脂质体，脂质体具有和细胞膜类似的结构，能够运载药物或RNA疫苗等物质进入细胞，B正确；C、沼气发酵工程是利用微生物在无氧条件下分解有机物产生沼气，沼气可作为燃料，发酵后的沼渣、沼液可以作为作物肥料，同时还能够减少有机废弃物造成的污染，C正确；D、逆转录酶抑制剂可以抑制逆转录酶的活性，HIV是一种逆转录RNA病毒，逆转录酶抑制剂可以用于治疗HIV感染。但并非所有的RNA病毒都是逆转录病毒，只有逆转录RNA病毒才依赖逆转录酶进行复制，对于非逆转录RNA病毒，逆转录酶抑制剂没有治疗作用，D错误。故选D。3．2024年6月，科研人员对HIV疫苗的研发取得了进展，该技术的成功源于对HIV衣壳蛋白结构和功能的新认知。该药通过阻断衣壳与细胞蛋白的相互作用，阻止病毒进入细胞核或形成新的病毒颗粒，从而显著抑制病毒传播。下列说法错误的是（

）A．HIV是一种RNA病毒，容易变异，因此疫苗研发较困难B．HIV侵染的主要是人体的辅助性T细胞C．HIV可以将其逆转录出的基因整合到人体染色体DNA上，可能会引起细胞癌变D．HIV只将其遗传物质注入到宿主细胞内【答案】D【分析】疫苗是将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生产生相应的抗体和记忆细胞；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，产生更强烈的免疫反应，起到预防的作用。【详解】A、HIV是一种RNA病毒，RNA为单链结构，稳定性差，因而容易变异，因此疫苗研发较困难，A正确；B、HIV侵染的主要是人体的辅助性T细胞，辅助性T细胞不仅参与体液免疫，而且还参与细胞免疫，因此HIV侵染人体会引起获得性免疫缺陷病，B正确；C、HIV是一种RNA逆转录病毒，HIV可以将其逆转录出的基因整合到人体染色体DNA上，因而有可能会引起细胞癌变，C正确；D、HIV是一种RNA逆转录病毒，其表面的蛋白与人体的辅助性T细胞膜上的受体结合，进而以胞吞的方式进入宿主细胞，蛋白质与核酸一起进入，在细胞内进行脱壳，释放RNA，D错误。故选D。4．艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的。HIV主要侵入并破坏人体的辅助性T细胞，逐渐使免疫系统瘫痪，功能土崩瓦解，下列表述错误的是（

）A．HIV侵入人体后最终使人无法抵抗其他病毒、病菌的入侵或发生恶性肿瘤而死亡，这属于免疫防御功能异常B．HIV是逆转录病毒，能够在病毒进入宿主细胞后将RNA转化成DNAC．免疫系统主要包括免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质D．辅助性T细胞属于淋巴细胞的一种，参与体液免疫和细胞免疫【答案】A【详解】A、HIV破坏辅助性T细胞后，人体无法抵抗病毒、病菌入侵（免疫防御功能异常），同时无法清除异常细胞（如癌细胞，属于免疫监视功能异常）。因此该表述仅提及免疫防御，忽略了免疫监视的异常。A错误；B、HIV是逆转录病毒，其遗传物质为RNA，进入宿主细胞后需在逆转录酶作用下合成DNA，该表述符合病毒特性，B正确；C、免疫系统由免疫器官（如胸腺、骨髓）、免疫细胞（如淋巴细胞、吞噬细胞）和免疫活性物质（如抗体、细胞因子）组成，C正确；D、辅助性T细胞属于淋巴细胞，在体液免疫中激活B细胞，在细胞免疫中激活细胞毒性T细胞，参与两种特异性免疫过程，D正确。故选A。5．2025年12月1日是第38个“世界艾滋病日”，艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的传染病。HIV是一种逆转录病毒，变异速度非常快，甚至在一个感染者体内就能产生多种毒株，一旦感染几乎终生携带。下列叙述错误的是（）A．感染HIV初期机体免疫系统发挥作用会使体液中HIV浓度下降B．HIV的逆转录酶以病毒RNA为模板合成DNA，该过程需要宿主细胞提供原料和ATPC．可通过国民全人群接种HIV疫苗以构建社会群体免疫屏障D．HIV在体内难以清除可能是逆转录的相关基因整合到了人体染色体上【答案】C【详解】A、感染HIV初期，机体免疫系统尚未被严重破坏，体液免疫和细胞免疫会共同发挥作用。免疫系统可识别并清除部分HIV，导致体液中HIV浓度暂时下降，A正确；B、HIV是逆转录病毒，逆转录酶的功能是以病毒自身RNA为模板合成DNA。病毒没有独立的代谢系统，该过程需要宿主细胞提供四种脱氧核苷酸（原料）和ATP（能量），B正确；C、构建群体免疫屏障的前提是存在有效且稳定的疫苗，而HIV变异速度极快，感染者体内可产生多种毒株。目前尚未研发出能应对所有HIV变异株的有效疫苗，因此无法通过全人群接种HIV疫苗构建群体免疫屏障，C错误；D、HIV的逆转录产物（DNA）可整合到人体染色体上，成为宿主基因组的一部分。这种整合状态使HIV难以被免疫系统识别和清除，导致感染者几乎终生携带病毒，D正确。故选C。二、实验题6．P24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白（大小约为26KD），是P24基因的表达产物。P24单克隆抗体在HIV感染的诊断、治疗等方面有重要意义，P24单克隆抗体的制备主要包括三个阶段：利用基因工程生产P24蛋白：利用细胞融合技术生产单克隆抗体；单克隆抗体活性的鉴定。请回答下列问题：(1)提取HIV的总RNA，经_______过程获得总cDNA．通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出P24基因的cDNA．(2)在构建重组质粒时，需对质粒和P24基因的cDNA用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，双酶切的优点除了防止质粒和目的基因的自身环化外还可以防止______。研究发现，P24基因的cDNA缺乏这两种限制酶的识别序列。为此，在设计PCR引物时，需要在引物的_____端加入限制酶的识别序列。(3)将重组质粒（含卡那霉素抗性基因）导入宿主菌体细胞后，进行的部分操作及结果如下图所示。图中①②两处的接种方法______（填“相同”或“不同”）。蛋白凝胶分析结果图中，1为蛋白Marker，2为不含物质A的菌液，3为含物质A的菌液，实验结果说明P24较高的是______（填“2”或“3”），据此推测物质A的作用是______。(4)用P24蛋白对小鼠以静脉注射的方式进行加强免疫3次，其目的是_____。取免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，用______促进细胞融合，为选出能产生专一抗体的细胞，要从HAT培养基上筛选出杂交瘤细胞，然后稀释滴入多孔培养板中，使多孔培养板每孔中有____个细胞，然后筛选出抗体检测呈______（填“阳性”或“阴性”）的细胞进行克隆化培养；该克隆化培养细胞具有的特点为______。(5)T细胞被HIV感染后，会与未被感染的T细胞发生融合，从而形成多核巨细胞，多核巨细胞不久死亡又释放出大量新病毒。多核巨细胞的数量可作为P24单克隆抗体活性鉴定的指标。请完善以下鉴定P24单克隆抗体活性的实验思路：将未被感染的T细胞等分为三组，处理如下：A组：HIV感染的T细胞+未被感染的T细胞+细胞培养液：B组：HIV感染的T细胞+未被感染的T细胞+_______；C组：未被感染的T细胞+细胞培养液。【答案】(1)逆转录(2)反向连接5'(3)不同3物质A能诱导P24基因的表达(4)促使小鼠产生更多的（能分泌抗P24抗体的）B细胞仙台病毒或聚乙二醇或电刺激法1阳性既能产生P24抗体，又能无限增殖(5)P24单克隆抗体【详解】（1）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录。（2）双酶切法的优点是可以使质粒和目的基因两端产生不同的黏性末端，进而保证目的基因和质粒正向连接，防止自身环化和反向连接。由于P24基因的cDNA缺少BamHⅠ和XhoⅠ的识别序列，所以在设计PCR引物时，由于PCR扩增时，子链的延伸方向是5'3'端，所以需要在引物的5'端加入限制酶的识别序列。（3）由图可知，图中①为接种在固体培养基上，用的是稀释涂布平板法，②为接种到液体培养基中，不用稀释涂布平板法，二者使用接种方法不同。由图可知，1作为对照，3中P24含量较高，由于其加入了A，说明物质A能诱导P24基因的表达。（4）对小鼠多次接种P24蛋白（抗原），目的是使其产生更多的（能分泌抗P24抗体的）B细胞，动物细胞融合可用仙台病毒或聚乙二醇或电刺激法进促进细胞融合。此后需要经过两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞（即效应B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的），第二次筛选出既能产生特异性抗体P24又能无限增殖的杂交瘤细胞。即从HAT培养基上筛选出杂交瘤细胞，然后稀释滴入多孔培养板中，使多孔培养板每孔中有1个细胞，然后筛选出抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化培养；该克隆化培养细胞具有的特点为既能产生特异性抗体P24又能无限增殖。（5）由题意可知，该实验目的是验证P24单克隆抗体的活性，其中C组作为对照，A组验证T细胞被感染后形成大量多核巨细胞，B组验证P24抗体的活性，所以B组应为HIV感染的T细胞+未被感染的T细胞+P24单克隆抗体。预期C组无多核巨噬细胞，A组有较多多核巨细胞，B组多核巨细胞数量较A组少。7．水稻His基因控制合成的酶参与除草剂的代谢解毒过程。科研人员利用基因编辑工具Cre-LoxP系统和CRISPR/Cas9系统提高His基因表达水平。(1)Cre-LoxP系统包含三种载体，载体1、载体2携带Lox序列，载体3携带Cre酶基因。三种载体通过________法导入水稻细胞后，载体1、2的Lox序列会分别插入目的基因左侧、右侧，载体3表达的Cre酶可特异性识别Lox序列，催化如图1所示的剪切过程，实现一对lox序列间的基因敲除。(2)His基因所在的染色体部分片段如图2，其附近的RPL基因带有强启动子。RPL基因表达水平变化不会对水稻植株的生命活动造成影响。科研人员优化了Cre-LoxP系统，使其能引起315kb片段位置颠倒，导致________，提高His基因的表达。请根据图3中Cre酶切割位点，在下表中选出可行的Lox序列组合________，使该系统在Cre酶切割及细胞内DNA连接酶修复后，能实现上述实验目的。组合左侧Lox5'——3'右侧Lox5'——3'一AGCATATATGCT二AGCATAAGCATA三TATGCTTATGCT四TATGCTAGCATA(3)科研人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术去除Cre-LoxP操作后残留的Lox序列（“痕迹”）。为了检验CRISPR/Cas9去除痕迹的情况，建立荧光报告系统：将载体A、载体B和CRISPR/Cas9共同导入水稻原生质体中。若Lox序列被去除，则原生质体可检测到绿色荧光。无绿色荧光无绿色荧光注：GFP-1、GFP-2和GFP-3片段可以通过同源重组的方式拼接成完整的GFP（绿色荧光蛋白基因）有绿色荧光请根据表中信息解释此系统的检验原理：________。(4)通过上述技术的优化，科研人员成功制备出抗除草剂的水稻。请分析此工程的优势。【答案】(1)农杆菌转化(2)RPL基因的强启动子与His基因的弱启动子交换一、四(3)若成功删除Lox序列，则载体A与载体B发生同源重组，GFP基因能拼接完整并表达，可检测到绿色荧光:若未成功删除，GFP基因无法拼接完整，检测不到绿色荧光。(4)能提高His基因表达水平:同时，因强启动子来自水稻自身基因且去除残留Lox，避免引入外源基因的干扰，提高了产品安全性。【详解】（1）植物基因工程常用的导入法是农杆菌转化法，因此三种载体通过农杆菌转化法导入水稻细胞。（2）RPL基因带有强启动子，启动子是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录。原本His基因远离强启动子，表达水平低。315kb片段颠倒后，His基因所带的弱启动子与RPL强启动子互换，His基因受RPL强启动子驱动，转录大幅增强，His基因的表达提高。Cre酶切割后要实现片段颠倒，必须两侧Lox方向相反；若两侧Lox同向→Cre酶切割后会删除片段；若两侧Lox反向→Cre酶切割后片段会颠倒（倒位），因此必须让左侧Lox与右侧Lox方向相反。结合图3中Cre酶切割位点的方向与基因排列（RPL强启动子位置），组合一和组合四在切割重接后，能让His基因正好被颠倒到强启动子下游，实现表达增强，因此选组合一和四。（3）根据图示，若成功删除Lox序列，则载体A与载体B发生同源重组，形成完整绿色荧光蛋白基因，GFP基因能拼接完整并表达，可检测到绿色荧光；若未成功删除，GFP-1与GFP-2被隔开，GFP基因无法拼接完整，检测不到绿色荧光。（4）根据题意，能提高His基因表达水平；同时，因强启动子来自水稻自身基因且去除残留Lox，避免引入外源基因的干扰，提高了产品安全性。8．近年来，诱导多能干细胞（iPSC）技术凭借取材便捷、体外高效扩增及长期稳定保存的优势，成为物种遗传资源保存的核心手段。野猪拥有抗病力强、繁殖力高和适应性强等优良遗传特性，科研人员尝试建立野猪诱导多能干细胞系（iPSCs），并探寻将外源基因定点整合于iPSCs的X染色体上的操作路径，为后续野猪的资源保存和开发利用提供技术支撑。回答下列问题：(1)野猪iPSCs的建立:用载体将特定基因导入野猪成纤维细胞使其_______经过筛选、扩大培养后，获取具有持续增殖能力的细胞群体。(2)外源基因导入iPSCs方式的筛选:分别采用化学法1、2和电击法3、4、5将携带荧光蛋白基因的质粒导入野猪iPSCs，在荧光显微镜下可观察到部分细胞表达荧光蛋白（图），比较结果并筛选出导入细胞的最适方式。据图可知，应选择______介导的导入方式作为后续实验的基因导入方式，理由是______。(3)利用HITI技术通过CRISPR/Cas9系统在DNA特定位点产生双链断裂后，细胞通过自身修复机制将外源基因精准整合到断裂位点。该过程分为三个步骤：①构建并筛选靶向质粒：选取野猪X染色体上基因1、基因2的片段作为定位点，构建靶向质粒1和靶向质粒2（二者均可表达生成由sgRNA和Cas9蛋白组装而成的基因编辑系统，不同的sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到基因1或基因2上，并对基因目标位点进行切割产生DNA双链断裂，可用于基因编辑），分别导入两组iPSCs并培养一段时间后，分别提取基因1所在片段和基因2所在片段进行扩增并测序。测序结果的每一个峰对应基因片段每一位置的碱基，同一碱基位置检测到两个或多个信号导致峰重叠的现象称为“套峰”。与导入靶向质粒前相比，测序发现出现“套峰”，说明该位置可能发生了_______。对比图的左右部分可知，_____的靶向编辑效率可能更高，选择其作为靶向质粒进行后续实验。②构建含如图元件的外源基因（GFP）质粒，使EF1a（启动子）和GFP能在受体细胞内能被完整的切割下来。图中，在不考虑图中Scaffold元件作用的前提下，hU6的作用是驱动sgA转录生成_______。③最后将_______，可建立X染色体定点插入GFP的野猪iPSCs。【答案】(1)去（脱）分化(2)化学试剂2化学试剂2介导的导入方式其荧光表达细胞所占百分比高，导入效率高(3)基因编辑靶向质粒2靶向sgA序列的sgRNA靶向质粒和目的基因质粒共同导入野猪iPSCs【分析】1.诱导多能干细胞（iPSCs）的原理，即通过导入特定基因使已分化的体细胞发生去（脱）分化，恢复多能性。2.外源基因导入受体细胞的方法筛选（化学法与电击法），以及利用荧光蛋白基因作为标记基因判断转化效率。3.CRISPR/Cas9基因编辑系统的组成与作用机理（sgRNA引导Cas9蛋白切割），以及利用DNA测序结果分析基因编辑。【详解】（1）诱导多能干细胞（iPSCs）去（脱）分化——即通过导入特定基因，使已分化的体细胞逆转分化状态，恢复多能性和持续增殖能力。因此，用载体将特定基因导入野猪成纤维细胞的目的是使其去（脱）分化，经筛选和扩大培养后，即可获得具有持续增殖能力的iPSCs群体。（2）实验通过观察“表达荧光蛋白的细胞比例”判断基因导入效率，荧光强度越高（或表达荧光的细胞越多），说明基因导入方式越优。结合图中数据，化学试剂2介导的导入方式其荧光表达细胞所占百分比高，即外源基因导入效率最高，因此应选择该方式。（3）①选取野猪X染色体上基因1、基因2的片段作为定位点，构建靶向质粒1和靶向质粒2（二者均可表达生成由sgRNA和Cas9蛋白组装而成的基因编辑系统，不同的sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到基因1或基因2上，并对基因目标位点进行切割产生DNA双链断裂，可用于基因编辑），导入靶向质粒后，Cas9蛋白在sgRNA引导下切割X染色体上的基因1或基因2，进行基因编辑，导致测序结果同一碱基位置检测到两个或多个信号，测序时出现“套峰”。对比基因1和基因2的测序结果：基因2所在片段的“套峰”数量更多、信号更明显，说明其被编辑的位点更多，即靶向质粒2的靶向编辑效率更高。②构建含如图元件的外源基因（GFP）质粒，使EF1a（启动子）和GFP能在受体细胞内能被完整的切割下来，分析图像，在CRISPR/Cas9系统中，hU6是启动子，作用是驱动sgA转录生成靶向sgA序列的sgRNA，sgRNA再引导Cas9蛋白切割特定位点。③要实现X染色体定点插入GFP，需同时提供“靶向切割工具”和“外源基因片段”：先将筛选出的高效靶向质粒（靶向质粒2）导入野猪iPSCs，使Cas9-sgRNA复合物切割X染色体特定位点；再导入含目的基因（GFP基因）质粒，细胞通过自身修复机制将GFP整合到切割位点。因此，最后一步操作是将靶向质粒和目的基因质粒共同导入野猪iPSCs。三、解答题9．新冠病毒的治疗和预防研究之所以进展迅速，得益于科学家们对艾滋病的防治方法的研究。早期，科学工作者从被HIV感染后自愈者的体内获取相应免疫细胞，使之与骨髓瘤细胞结合，生产HIV的抗体，具体过程见下图：图1（1）上述过程①的生物技术称为__________________；要获得单克隆抗体，上图1过程最关键的操作要点是：首先筛选出________________；再进一步筛选出________________。（2）随后，下图所示的技术被运用到了HIV疫苗的研制工作中，科学家用该方法产生的疫苗进行预防接种，该技术的核心步骤为［］_______（［

］中填图2中序号，填步骤名称），图中①过程为________________；该过程提取疫苗的化学本质为________________。与上述图1方法相比，其关键的优势是________________。图2（3）为获取图2中的DNA片段（目的基因），科学家需要根据____________设计引物，若有a条起始的RNA片段，经过图2的①过程，再进行PCR循环30次，理论上获得的目的基因片段数为_____________。（4）HIV能通过细胞表面的CD4（一种受体蛋白）识别T细胞，如果给AIDS患者大量注射用CD4修饰过的红细胞，红细胞也会被HIV识别、入侵。科学家认为红细胞会成为HIV的“陷阱细胞”，可以为治疗AIDS提供新的思路，这种认知的理由是哺乳动物成熟红细胞的特点是____________________，这种特点使得入侵的HIV________________。【答案】动物细胞融合杂交瘤细胞能产生特异性强、灵敏度高的抗体的杂交瘤细胞②构建基因表达载体逆转录蛋白质血液中抗体含量因代谢会逐渐降低，而注射疫苗可激发B细胞产生记忆细胞，较长时间维持较高抗体浓度目的基因DNA片段上游和下游的部分核苷酸序列a230不具备细胞核和核糖体等结构无法完成复制增殖【分析】1、基因工程技术的基本步骤：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。2、艾滋病的致病原理：HIV病毒进入人体后，与人体的T淋巴细胞结合，破坏T淋巴细胞，使免疫调节受到抑制，使人的免疫系统瘫痪，最后使人无法抵抗其他细菌、病毒的入侵，让人死亡。3、分析图1：①表示细胞融合，②表示筛选获得杂交瘤细胞。4、分析图2：①是获取目的基因的过程，②是基因表达载体的构建过程，③是将目的基因导入受体细胞的过程。【详解】（1）图1中①为HIV自愈者免疫细胞与骨髓瘤细胞融合的过程，该过程需要采用动物细胞融合技术，要获得单克隆抗体，最关键的操作是：首先在选择培养基上筛选出杂交瘤细胞，再进一步筛选出能产生特异性强、灵敏度高的抗体的杂交瘤细胞。（2）图2为利用基因工程技术生产HIV疫苗的过程，基因工程的核心技术为构建基因表达载体，图中①过程为由RNA通过逆转录得到DNA的过程，该过程提取疫苗的化学本质为蛋白质。与单克隆抗体获得的方法相比，其关键的优势是血液中抗体含量因代谢会逐渐降低，而注射疫苗可激发B细胞产生记忆细胞，较长时间维持较高抗体浓度。（3）为获取图2中的DNA片段(目的基因)，科学家需要根据目的基因DNA片段上游和下游的部分核苷酸序列设计引物，通过PCR技术获得目的基因，若有a条起始的RNA片段，经过图2的①过程，再进行PCR循环30次，理论上获得的目的基因片段数为a230。（4）HIV能通过细胞表面的CD4(一种受体蛋白)识别T细胞，如果给AIDS患者大量注射用CD4修饰过的红细胞，红细胞也会被HIV识别、入侵。科学家认为红细胞会成为HIV的“陷阱细胞”，可以为治疗AIDS提供新的思路，这种认知的理由是哺乳动物成熟红细胞的特点是不具备细胞核和核糖体及多种细胞器等结构，这种特点使得入侵的HIV无法完成遗传物质的复制及有关蛋白质的合成，进而使HIV无法进行增殖。【点睛】本题主要考查基因工程及单克隆抗体的制备过程的相关知识，要求学生识记基因工程的概念、原理、操作步骤及单克隆抗体的制备过程，进而分析题图信息准确答题。10．HIV侵入人体后能识别并结合辅助性T细胞表面的受体进入细胞。HIV的RNA经逆转录生成的前病毒DNA整合到宿主细胞基因组后，很难被清除。基因编辑技术CRISPR/Cas12为敲除患者基因组中的前病毒DNA、治疗艾滋病提供了广阔的前景。图1为CRISPR/Cas12切割前病毒DNA示意图，crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，协助Cas12精准定位，完成DNA的精准切割，图2是用于构建基因表达载体的部分组件示意图。回答下列问题：(1)图1中，Cas12切割前病毒DNA后在非靶标链上生成的黏性末端是5′-______-3′（写出切割位点右侧4个碱基即可），与基因工程中常用的限制酶相比，Cas12具有______的特点。(2)分析图2，crRNA基因转录的模板链是_________（填“α链”或“β链”）。为了定位前病毒DNA插入染色质的位置，利用PCR技术构建表达“Cas12蛋白—绿色荧光蛋白”融合基因，所用引物2的碱基序列和_______（填“α链”或“β链”）对应区段的碱基序列相同。融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，再通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的扩增片段连接起来。欲将Cas12基因片段、绿色荧光蛋白基因片段连接形成图3所示融合基因，除引物1、2外，还需要的引物（起搭桥作用）请在图3中画出_________。最初应设计______个PCR反应体系，引物和模板链的投入情况分别是_________。(3)HIV的RNA经逆转录生成前病毒DNA时，常发生碱基替换，这是HIV变异类型多、难以防治的主要原因。寻找脱靶率低、T细胞存活率高的crRNA序列，可提高治疗效果。（注：脱靶是指crRNA不能与前病毒DNA结合，进而失去敲除作用）。现筛选到三个crRNA基因（片段长度相同），导入受体细胞后，检测结果如图4.①你认为比较理想的crRNA基因是片段______，选用该片段的理由是_______。②能否用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术对上述三个片段进行区分，为什么？______。【答案】(1)TAGT灵活性高、靶向性强(2)α链β链2一个体系投入引物1、引物3和Cas12基因片段模板链；另一个体系投入引物2、引物4和绿色荧光蛋白基因片段模板链(3)片段3脱靶率低，T细胞存活率高不能，因为三个crRNA基因片段长度相同，PCR扩增后产物长度相同，在琼脂糖凝胶电泳中无法区分【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：利用PCR技术扩增和化学合成法等。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法常用农杆菌转化法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态法。4、目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）从图1可知，Cas12切割前病毒DNA后在非靶标链上生成的黏性末端是5'-TAGT-3'。Cas12的识别依赖于向导RNA与DNA的碱基互补配对，只要设计合适的向导RNA，理论上可以识别几乎任何DNA序列，与基因工程中常用的限制酶相比，具有更高的灵活性和靶向性。（2）根据crRNA基因终止子的位置，以及基因转录的模板链是3'端→5'端，则crRNA基因转录的模板链是α链。为了定位前病毒DNA插入染色质的位置，利用PCR技术构建表达“Cas12蛋白-绿色荧光蛋白”融合基因，引物的延伸方向是5'→3'，所用引物2的碱基序列与β链对应区段的碱基序列相同。欲将Cas12基因片段、绿色荧光蛋白基因片段连接形成图3所示融合基因，除引物1、2外，还需要添加另一对引物，设计的这对引物2和引物3部分碱基是能够互补配对的，具体引物的位置如图所示：。最初应设计2个PCR反应体系分别扩增Cas12基因和绿色荧光蛋白基因，因此引物和模板链的投入情况分别是：一个体系投入引物1、引物3和Cas12基因片段模板链，另一个体系投入引物2、引物4和绿色荧光蛋白基因片段模板链。（3）①观察图4，比较理想的crRNA基因是片段3，选用该片段的理由是其脱靶率低（图中片段3脱靶率在三个片段中最低），T细胞存活率高（片段3对应的T细胞存活率在三个片段中最高）。②不能用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术对上述三个片段进行区分，因为三个crRNA基因片段长度相同，PCR扩增后产物长度相同，在琼脂糖凝胶电泳中无法区分。11．CRISPR-Cas9系统是一种高效的基因编辑工具。科研人员计划利用该技术敲除小鼠细胞中的某致病基因（靶基因），需通过基因工程构建包含Cas9基因和sgRNA（向导RNA）的表达载体。相关图示如下，请回答以下问题。

(1)Cas9与向导RNA构成的复合体能与DNA分子特定碱基序列结合，作用时向导RNA与DNA单链结合，然后Cas9将特定位点的________键断开。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，与限制酶相比，CRISPR-Cas9系统的优点在于________。(2)为获取Cas9基因，科研人员需通过PCR扩增其DNA片段。PCR扩增需要合适的引物，PCR循环过程中引物发挥作用的阶段是_______。已知Cas9基因部分序列如下：5'-GAATTC…（Cas9基因）…GAATTC-3'，据该基因两端的已知序列设计的引物序列为______，但该引物并不能实现目的基因的大量扩增，原因是_____。(3)科研人员将Cas9基因某一端改为BamHI识别的序列，然后用两种限制酶进行处理，这样处理的好处是_______。(4)基因编辑技术比传统的基因工程技术更准确、目的性更强，推测CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因敲除的应用价值可能是_______（答出2点）。【答案】(1)磷酸二酯打破了限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列的局限性(2)复性和延伸5'-GAATTC-3'引物序列互补，形成引物二聚体，不会与模板链结合，所以扩增不出产物(3)防止质粒和目的基因自身环化，防止质粒和目的基因反向连接(4)进行基因治疗、研究基因功能、构建疾病研究模型等【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）Cas9与向导RNA构成的复合体能与DNA分子特定碱基序列结合，作用时向导RNA与DNA单链结合，Cas9相当于限制酶，因而可在相应的部位实现切割，可催化磷酸二酯键断裂，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，与限制酶相比，CRISPR-Cas9系统的优点在于打破了限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列的局限性。（2）为获取Cas9基因，科研人员需通过PCR扩增其DNA片段。PCR扩增需要合适的引物，PCR循环过程中引物发挥作用的阶段是复性和延伸。已知Cas9基因部分序列如下：5'-GAATTC…（Cas9基因）…GAATTC-3'，据该基因两端的已知序列设计的引物序列为5'-GAATTC-3'，由于引物序列互补，形成引物二聚体，不会与模板链结合，所以扩增不出产物。（3）科研人员将Cas9基因某一端改为BamHI识别的序列，然后用两种限制酶进行处理，防止质粒和目的基因自身环化，防止质粒和目的基因反向连接。（4）基因编辑技术比传统的基因工程技术更准确、目的性更强，推测CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因敲除的应用价值可能是进行基因治疗、研究基因功能、构建疾病研究模型等。12．学习以下材料，回答(1)～(4)题。表观遗传调控因子在免疫治疗中的应用近年来，免疫检查点阻断剂(ICB)疗法和CAR-T细胞疗法为癌症患者带来了新的治疗希望。ICB可解除肿瘤细胞对T细胞的抑制，增强T细胞功能；而CAR-T细胞疗法则通过基因工程改造T细胞，使其能够特异性识别并杀伤肿瘤细胞。然而，T细胞的功能耗竭显著限制了治疗效果。近期研究发现，表观遗传调控因子(ASXL1等)在T细胞耗竭中发挥作用，为T细胞免疫治疗提供了新的研究方向。在慢性抗原刺激下，小鼠CD8T细胞逐渐耗竭，最终转化为耗竭性T细胞(Tex)。通过基因编辑技术敲除小鼠CD8T细胞中的表观遗传调控因子后，T细胞能保持干细胞样特性并抵抗耗竭，形成持久的耗竭前体T细胞(Tpex)。进一步研究显示，ASXL1可能通过与蛋白复合物PR-DUB结合，促进相关组蛋白(H2A)去泛素化(Ub)，改变染色质构象并影响基因表达，进而使T细胞转化为Tex；而敲除ASXL1的T细胞表现出更强的抗肿瘤活性，其作用机理如图所示。该研究为开发新的T细胞免疫治疗方法提供了新的思路。(1)表观遗传是指在生物体中，基因的____保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象。CD8T细胞分化为Tex的实质是基因的____。(2)表观遗传调控因子在表观遗传中发挥重要作用。通过调控表观遗传调控因子可延缓T细胞的功能耗竭，进而增强其抗肿瘤活性。下列叙述正确的是____(多选)。A．敲除ASXL1的T细胞表现出更强的抗肿瘤活性B．阻断ASXL1与PR-DUB的结合，使T细胞对ICB无响应C．相关组蛋白的泛素化可促进CD8T细胞转化为TpexD．ASXL1可以提高机体的免疫监视功能E．CD8T细胞参与机体的体液免疫过程(3)敲除ASXL1可避免____，提高了ICB疗法和CAR-T细胞疗法的治疗效果。(4)结合以上材料，提出一个肿瘤免疫治疗的新思路____。【答案】(1)碱基序列选择性表达(2)AC(3)T细胞功能耗竭(4)阻断ASXL1与PR-DUB的结合【分析】细胞免疫是依靠T细胞直接接触靶细胞来“作战”，机体清除肿瘤细胞是通过细胞免疫来实现的｡【详解】（1）表观遗传是指在生物体中，基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象。细胞分化的实质是基因的选择性表达，因此CD8T细胞分化为Tex的实质是基因的选择性表达。（2）A、由题图可知：敲除ASXL1的T细胞，导致H2A泛素化(Ub)增强，使T细胞转化为Tpex，对ICB有响应，表现出更强的抗肿瘤活性，A正确；B、阻断ASXL1与PR-DUB的结合，会抑制相关组蛋白(H2A)去泛素化(Ub)，最终使T细胞对ICB有响应，B错误；C、由题意和题图可知：相关组蛋白的泛素化(Ub)，可促进小鼠CD8T细胞能保持干细胞样特性并抵抗耗竭，形成持久的耗竭前体T细胞(Tpex)，C正确；DE、由题意和题图可知：在慢性抗原刺激下，ASXL1通过与蛋白复合物PR-DUB结合，最终使小鼠CD8T细胞转化为耗竭性T细胞(Tex)，降低其抗肿瘤活性，说明ASXL1可以降低机体的免疫监视功能，CD8T细胞参与机体的细胞免疫过程，DE错误。故选AC。（3）敲除ASXL1，可以使小鼠CD8T细胞保持干细胞样特性并抵抗耗竭，形成持久的耗竭前体T细胞(Tpex)，可避免T细胞功能耗竭，提高了ICB疗法和CAR-T细胞疗法的治疗效果。（4）在慢性抗原刺激下，ASXL1通过与蛋白复合物PR-DUB结合，小鼠CD8T细胞逐渐耗竭，最终转化为耗竭性T细胞(Tex)，由此可推知：可以通过阻断ASXL1与PR-DUB的结合，来对肿瘤进行免疫治疗。13．帕金森病是一种因脑内中脑多巴胺能细胞（mDAC）受损导致的神经退行性疾病，基因编辑与干细胞诱导结合的细胞疗法为其治疗带来新希望。某团队开展相关研究，流程如下，请回答问题：(1)团队先从患者皮肤获取成纤维细胞，通过重编程技术诱导为诱导多能干细胞（hiPSC）。hiPSC的全能性与胚胎干细胞（ESC）相近，其优势在于____（答出1点即可）。随后采用优化方案将hiPSC分化为mDAC，分化的本质是____。(2)为提高mDAC的安全性，需通过CRISPR-Cas9系统编辑潜在致瘤基因。设计sgRNA时长度一般为20个核苷酸左右。靶向序列过长影响基因编辑效率，过短会造成____。(3)腓骨肌萎缩症（CMT1A）是危害人类健康的另一种疾病，是神经胶质细胞中PMP22基因过量表达引起的。为了进一步探究CRISPR/Cas9治疗CMT1A的可行性，科研人员构建了如图所示表达载体，并利用CMT1A疾病模型小鼠进行了相关实验，请完成下表。实验目的简要操作步骤构建表达载体PCR扩增gRNA对应的DNA序列，并在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列____和____控制自变量A组为正常小鼠，不做处理；B组为疾病模型小鼠，坐骨神经中注射构建成功的表达载体；C组为疾病模型小鼠，不做处理测定相关指标通过____技术测定三组是否表达出PMP22蛋白，最后还需从个体水平测定三组小鼠运动功能【答案】(1)可来源于患者自身，避免免疫排斥（或无需破坏胚胎，伦理争议小）基因的选择性表达(2)特异性降低，可能会结合到其他非目标区域（或脱靶、破坏其他基因等均可）(3)5′-GTCGAC-3′5′-GGATCC-3′抗原-抗体杂交【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【详解】（1）诱导多能干细胞（hiPSC）相比于胚胎干细胞（ESC），因为胚胎干细胞获取涉及对胚胎的操作，存在伦理问题，而hiPSC从患者自身皮肤细胞诱导而来，无此争议，同时避免免疫排斥。所以，hiPSC的全能性与胚胎干细胞（ESC）相近，其优势在于可来源于患者自身，避免免疫排斥（或无需破坏胚胎，伦理争议小）。细胞分化的本质是基因的选择性表达，即不同细胞中遗传信息的执行情况不同，导致细胞在形态、结构和生理功能上产生稳定性差异。所以，随后采用优化方案将hiPSC分化为mDAC，分化的本质是基因的选择性表达。（2）设计sgRNA时，靶向序列过短会造成脱靶效应，即sgRNA不能准确地与目标基因序列结合，而是错误地结合到其他非目标基因位点，从而对其他基因进行不必要的编辑。所以，设计sgRNA时长度一般为20个核苷酸左右。靶向序列过长影响基因编辑效率，过短会造成特异性降低，可能会结合到其他非目标区域（或脱靶、破坏其他基因等均可）。（3）构建表达载体时，为了便于将扩增的DNA序列插入表达载体中，需要在上游引物的5'端添加与载体上限制酶识别序列相同的碱基序列，根据图中提供的限制酶信息，由于复制原点中存在EcoRI识别序列，所以不能选择EcoRI，故上游引物应选择添加SalI识别序列即5'—GTCGAC—3'。SalI与XhoI是同尾酶，故下游不能选择XhoI，应选择添加BamHI识别序列，即5'—GGATCC—3'。所以，PCR扩增gRNA对应的DNA序列，并在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列5′-GTCGAC-3′和5′-GGATCC-3′。检测蛋白质是否表达，常用的技术是抗原-抗体杂交技术，利用抗体与特定蛋白质的特异性结合来判断该蛋白质是否存在。即测定是否表达出PMP22蛋白可以通过抗原—抗体杂交技术。14．斑翅果蝇是农业害虫。我国研究者利用基因编辑技术培育带有雌性不育基因的斑翅果蝇，若将其释放到野外可降低野生斑翅果蝇种群数量。(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统中的gRNA与靶基因特异性结合，引导Cas9酶切断靶基因。断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的______，引起基因突变；也可能发生同源重组修复，导致靶基因被供体DNA中的片段替换（图1）。(2)果蝇2号染色体上T基因控制合成一种信号物质，该物质由神经细胞分泌，是雌蝇产卵的必需信号，对雄蝇育性无影响。研究者制备图2所示供体DNA，将其与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵。继续培养后在低倍镜下挑选出_______的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。(3)理论上，当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，同时作为同源重组修复的模板，导致_______，使雌蝇不育。用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1雌蝇育性情况为______。(4)有的G0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别。用携带t基因的G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1自由交配，若整个过程中没有t基因的新发产生，F2雌蝇中可育个体占比为______，可见t基因对驱动片段在种群中的传播有抵抗作用。(5)研究者对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点。请评价改造后的驱动片段的优点________。【答案】(1)增添、缺失或替换(2)发出红色荧光(3)另1个T基因也被驱动片段替换均不育(4)3/8(5)T基因中即使发生末端连接修复，也可以被其它gRNA识别，引发同源重组修复，降低t基因产生概率【分析】DNA分子