3.1 重组DNA技术的基本工具（第2课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具（第2课时）例：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。①不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏

和

。目的基因质粒上的抗生素抗性基因一、限制酶的选择技巧技巧1：选择不会破坏目的基因和抗性基因的限制酶例：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。②不宜只选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，

,

。目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中技巧2：目的基因的两侧都要使用限制酶切割一、限制酶的选择技巧例：③由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成

连接的环状产物以及

连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是

，后者可能会导致目的基因无法正常表达。一、限制酶的选择技巧活动2：探究单酶切与双酶切第1步：分别将质粒1、质粒2、目的基因1和目的基因2裁开成4个条状第2步：分别将质粒1和质粒2首尾相连制作成环状DNA分子，即质粒第3步：分别找到质粒1、质粒2、目的基因1和目的基因2的限制酶识别序列、写出限制酶名称，并标记切割位点EcoRⅠHind

Ⅲ一、限制酶的选择技巧活动2：探究单酶切与双酶切EcoRⅠHind

Ⅲ第4步：比较质粒1和质粒2的限制酶差别第5步：比较目的基因1和目的基因2的限制酶差别单酶切：一种限制酶切割目的基因和质粒缺点：①质粒、目的基因会自身环化；②目的基因会反向插入质粒，导致目的基因无法正常表达。一、限制酶的选择技巧活动2：探究单酶切与双酶切EcoRⅠHind

Ⅲ第4步：比较质粒1和质粒2的限制酶差别第5步：比较目的基因1和目的基因2的限制酶差别双酶切：两种限制酶切割目的基因和质粒第6步：观察质粒2能否与目的基因1相连接一、限制酶的选择技巧例：③由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成

连接的环状产物以及

连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是

，后者可能会导致目的基因无法正常表达。反向连接目的基因与目的基因质粒片段与质粒片段一、限制酶的选择技巧例：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。④为避免目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，例如可选择用

和

这两种限制酶。PstIEcoRI技巧3：目的基因和质粒最好使用双酶切法，且不为同尾酶一、限制酶的选择技巧思考：使用Spe

Ⅰ和Xba

Ⅰ两种限制酶可以防止自身环化吗？课堂小测1、某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的（）A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C课堂小测2、图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRI、BamHI、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是（）A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoRⅠB.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRI酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRI酶切割位点有1个C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHI和HindⅢ两种限制酶同时处理D.图1所示的一个质粒分子经EcoRI切割后，含有2个游离的磷酸基团B二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定1.实验原理(1)提取DNA的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液(2)鉴定DNA的原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定2.材料用具(1)选材：草莓香蕉菠菜菜花猪肝①选什么样的材料实验更易成功？思考选取DNA含量相对较高的生物组织②猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？猪血中的红细胞（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和细胞器，几乎不含DNA，不适合；鸡血中的红细胞有细胞核，且核DNA的量较多，适合。加入柠檬酸钠，可防止血液凝固洋葱二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定2.材料用具破坏细胞，释放出细胞内的物质析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用稀释NaCl溶液研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水(2)试剂：二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨过滤DNA析出DNA鉴定称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？思考1研磨不充分，会使DNA分子从细胞核中不能完全被释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA含量。研磨液成分作用SDSEDTATris缓冲液使蛋白质变性抑制DNA酶的活性维持pH的稳定，保证DNA结构正常二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨过滤DNA析出DNA鉴定称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨生活小实验中：植物材料在切碎后、研磨前需要加入一定的洗涤剂和食盐如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？思考1研磨不充分，会使DNA分子从细胞核中不能完全被释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA含量。溶解细胞膜溶解DNA二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨过滤DNA析出DNA鉴定方法1：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。过滤过滤的纱布能用滤纸代替吗？思考2不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失方法2：直接将研磨液倒入塑料离心管，1500r/min转速离心5min，取上清液放入烧杯。上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？思考3可能含有核蛋白、多糖等杂质二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨过滤DNA析出DNA鉴定在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用冷却的酒精析出DNA加体积分数为95%的酒精的目的是什么？思考4使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出酒精预冷的作用是什么？思考5①抑制DNA水解酶活性，防止DNA降解②低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨过滤DNA析出DNA鉴定用冷却的酒精析出DNA如何将析出的DNA展示并保存？思考6方法1：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分方法2：将溶液倒入塑料离心管中，10000r/min转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。减少DNA断裂应尽量不使用或少使用玻璃器皿（玻璃表面易吸附DNA）二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨过滤DNA析出DNA鉴定将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。实验组对照组加入2mol/L的NaCl溶液加入2mol/L的NaCl溶液不加入丝状物或沉淀物加入丝状物或沉淀物加入4ml的二苯胺试剂加入4ml的二苯胺试剂(蓝色)二、【探究·实践】DNA的粗提取与鉴定4.结果分析(1)如果提取出丝状物或沉淀物不是白色的，说明了什么？说明DNA中的杂质较多(2)如果用二苯胺试剂鉴定的结果呈现较浅的蓝色，可能的原因是什么？①材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分④加入酒精后搅拌时过猛或不同方向