CN113293138B 经修饰的自然杀伤细胞、医药组合物、其制备方法及其使用方法 （富禾生医股份有限公司）

IL-12,IL-15,andIL-18InducesaFunctionalHigh-AffinityIonHumanCytokine-InducedMemNaturalKillerCells.BioMarrowTransplantation.2014,第20本公开内容提供具有自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞功能与树突细胞功能的经修饰21.一种经修饰的自然杀伤细胞，包含CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+从所述第二培养的细胞群中分离出具有CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-表型的经修饰的3.如权利要求1所述的经修饰的自然杀伤细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途，将有效量的包含所述经修饰的自然杀伤细胞的药物施用于有此从所述第二培养的细胞群中分离出具有CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-表型的经修饰的3[0004]由于仍然没有满足有效治疗及/或预防癌症的需求，这些发现为开发针对癌细胞的基于自然杀伤细胞的疗法以及产生更多的用于临床应用的具有治疗能力的自然杀伤细[0005]鉴于本领域的迫切需要，本文提供在癌症治疗中安全有效的经修饰的自然杀伤自然杀伤细胞。在优选的实施方式中，该经修饰的自然杀伤细胞可进一步包含胞可包含CD45+CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-HLA-ABC+的表[0009]某些实施方式提供经修饰的自然杀伤细胞或医药组合物在制备用于治疗癌细胞4[0014]其他实施方式提供一种培养具有自然杀伤细胞功能以及树突细胞功能的经修饰[0017]从所述培养的细胞群中分离出具有CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-表型的该经修述培养的细胞群与包含IL-15以及IL-12及HLA-ABC的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞对NK表型以及DC表型的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析5γ的情况下针对NK表型及DC表型培养的经修饰的自然杀伤细胞的流式细胞仪分析图像的集[0032]图4A说明在各种IL-12暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图4B及4C分别说明以各种IL-12暴露时间培养的自然杀伤细胞表型及树突细胞表型的经修饰的饰的自然杀伤细胞对T淋巴细胞增殖的抗原呈递细胞(antigenpresentingcell，APC)活[0033]图5A说明以各种IL-18暴露浓度培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图5B说[0034]图6A说明在各种IL-18暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞的细胞数。图6B为流式细胞仪图像的集合，说明在各种IL-18暴露时间下培养的经修饰的自然杀伤细胞的9B说明根据本发明的实施方式的由经修饰的自[0038]本公开内容的前述及其他方面现将更详细地描述关于本文所述的其他实施方6或这些术语的任何变化包含任何可测量的降低或完全抑制以达到期望巴瘤(霍奇金氏病以及非霍奇金氏淋巴瘤)、多发性骨髓瘤，以及白血病(淋巴细胞性白血7胚层；小脑肉瘤，未明确分类(NOS)；神经节8临床上可触知的团块或通过各种影像方法在[0052]在本公开中，使用FACS/流式细胞仪分析的细胞表面抗原的表达水平或表面密度-+参考文献通过全文引入作为参考，以用于与其中存在该参考文献的句子及/或段落有关的[0058]在一个实施方式中，本发明内容提供了一种经修饰的自然杀伤细胞，包含CD3-------++NKG2D+++9-+-+--其中该CD16dimCD56hi自然杀伤细胞不含CD83细胞表面抗原(具有CD16dimCD56hiCD83-的表[0062]WO2015/100495公开一种包含CD3-CD19-CD14-CD56+CD16+NKG2D+CD11c-CD发明内容的经修饰的自然杀伤细胞具有一般的树突细胞表面抗原CD11c，但缺乏完全活化论的束缚，据信经修饰的自然杀伤细胞通过一种或多种自然杀伤细胞/树突细胞功能抑制[0068]所述医药组合物或经修饰的自然杀伤细胞的施用途径包含但不限于静脉内、肌[0070]将本发明的经修饰的自然杀伤细胞配制为医药组合物，以递送至哺乳动物受试[0071]制备此类剂型的实际方法对于本发明所属领域中的一般技术人员而言为已知的[0075]自细胞培养测定法以及动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范在一个实施方式中，这种自然杀伤细胞的剂量在包含很少或没有毒性的ED50在内的循环浓然杀伤细胞的示例性的非限制性范围为每剂至少约1×103个细胞至每剂约1×109个细胞。包含IL-15、IL-12，以及IL-18的第一培养基接触以获得培养的细胞群；以及以细胞标记CD3-CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-从该培养的细胞群中分离出同时具有自然杀伤细胞功能以及树突细胞功[0080]优选地，本文用于筛选或产生经修饰的自然杀伤细胞的单核细胞为纯化的CD3-[0084](c)在步骤(b)中，从其他单核细胞中耗竭一个或多个包含CD3细胞表面抗原(例如，单核细胞表型CD3+CD56-以及CD3+CD将步骤(b)中一或多个包含CD14的单核细胞以及一或多个包含CD19的单核细胞除去。在又的单核细胞除去。在又一实施方式中，在样品中将步骤(b)中一或多个包含CD19的单核细[0089]在一个实施方式中，用于培养细胞的组合物还包含IFN-γ。在一个替代实施方式[0090]包含IL-12的组合物的培养时间对于经修饰的自然杀伤细胞的功能可能是关键[0096]用于培养细胞的组合物的非限制性实例包含(a)造血细胞培养基+IL-15+IL-18；(b)造血细胞培养基+IL-12+IL-18；(c)造血细胞培养基+IL-15+IL-12+IL-18；(d20+IL-15+IL-18；(e)X-vivo20+IL-12+IL-18；(f)X-vivo20+IL-15+IL-12+IL-18；(g)胞培养基+IL-15+IL-12+IL-18+血清蛋白；(m)X-vivo20+IL-15+IL-18+血清蛋白；(n)X-[0098]根据本发明内容的某些实施方式的组合物增强了该经修饰的自然杀伤细胞的增的表达。经由FACS通过CD3-CD14-CD19-细胞的纯度及活菌数确定经修饰的自然杀伤细胞的增殖速率。细胞增殖的其他测定法为本领域公知的，例如选殖株形成测定法(clonogenic[0099]CD3-CD14-CD19-单核细胞与组合物的接触时间的示例性非限制性范围为自约1分一及第二组合物还包含造血细胞培养基(如AIM-V或X-vivo)及/或血清蛋白(例如人类血小[0103]将CD3-CD14-CD19-单核细胞在含有30ng/mL人类重组IL-15(hIL-15)、3ng/mL人类以及可选的4％(w/w)人类血小板裂解液(humanplateletlyX-vivo20培养基中培养15天。通过使用锥虫蓝(trypanblue)染料排除计数每组的细胞养基培养的细胞产生与以X-vivo20培养的细[0106]将CD3-CD14-CD19-(TN1)或CD25-CD14-CD19-(TN2)单核细胞在含有30ng/mLhIL-APC-AlexaFlour700、CD3-APC-AlexaFlour750、CD14-APC-Ale[0111]如图2B及2C所示，表型分析显示了TN1及TN2初始细胞生成的培养细胞的相似表[0112]因此，尽管从TN1初始细胞生成的培养细胞表达的自然杀伤细胞及树突细胞表型与从TN2初始细胞生成的CD3-CD14-CD19-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+HLA-DR+CD86+CD83-类似，但TN1初始细胞(CD3-CD14-CD19-)产生的高纯度培养细胞比使用TN2初始细胞(CD25-[0114]WO2015/100495公开了IFN-γ对具有自然杀伤细胞及树突细胞功能的经修饰的自[0115]在存在30ng/mLhIL-15、3ng/mLhIL-12以及有或没有45ng/mLhIFN-γ的情况下培养1×106个/mL的CD3-CD14-CD19-单核细胞9天。以单株抗体CD45-ECD、CD3-APC-Alexa件(BeckmanCoulter公司)进析显示具有或不具有IFN-γ的培养细胞的相似模式(图3B及3不含IFN-γ含IFN-γCD19-APC-AlexaFlour750(BeckmanCoulter公司)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、件(OncoImmunin公司)评估经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性。以人类慢性骨髓性白血病lymphocytereaction，MLR)评估该培养的细胞的抗原呈递活性。富集反应细胞(CD25-天确实增强了经修饰的自然杀伤细胞的细胞毒性及抗原Flour700、CD3-APC-AlexaFlour750、CD14-APC-AlexaFlour750、CD19-APC-AlexaFlour750(BeckmanCoulter公司)、CD86-Alexa488、CD83-PE-Cy5、CD25-PerCP/Cyanine5.5CD11c-APC以及HLA-ABC-PacificBlue(Biolegend公司)染色。通过Navios流是，表型分析显示加入IL-18上调了第3天的CD25、HLA-DR以及CD86的表达(图5B)。但是，[0129]类似地，还进行功能测定以评估以不同剂量的IL-18处理的培养细胞的细胞毒性露于IL-18足够的时间对于经修饰的自然杀伤细[0133]类似地，还进行功能测定以评估以不同时期的IL-18处理的培养细胞的细胞毒性[0135]最重要的是，暴露于IL-186天的培养细胞的抗原呈递活性在第12天达到最高程司，以色列)混合。将40mL稀释的外周血等分试样放入50mL离心管中，并装入10mL预热的[0138]为了除去CD14+细胞、CD19+细胞，以及CD3+细胞，根据制造商的说明书，使用生物素-抗CD3抗体反应，并以磁力分离器分离，然后通过洗涤从未结合的细胞中纯化出CD3+细胞。[0142](b)在步骤(a)中收获并离心一半的初始细胞，然后于第6天以包含AIM-V培养基、[0145](a)于第0天使1×106个/mLCD14-CD19-CD3-自然杀伤细胞与包含AIM-V培养基、[0151](a)于第0天使1×106个/mLCD14-CD19-CD3-自然杀伤细胞与包含AIM-V培养基、CD19-CD14-CD56hiCD16dimNKG2D+CD11c+CD86+HLA-DR+CD83-的自然杀伤细胞以及[0163]通过PanToxilux套件(OncoImmunin公司)评估实施例8的经修饰的自然杀伤细胞TFL4染色50分钟。将TFL-4标记的目标细胞以及经修饰的自然杀伤细胞与凋亡蛋白酶基质比为0.77而凋亡蛋白酶阳性目标细胞(经修饰结果显示经修饰的自然杀伤细胞对白血病目标细胞K562具[0166]通过混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)评估实施胞增殖套件(Invitrogen公司)染色。CSFE标记的CD25-PBMC以及经修饰的自然杀伤细胞于经修饰的自然杀伤细胞对CD25-PBMCs反应细胞具有[0169]无需进一步阐述，相信本发明所属技术领域中的一般技术人员可以基于以上描