2026年基因敲除测试题及答案

2026年基因敲除测试题及答案

一、单项选择题，每题2分1.下列哪一型核酸酶最适合用于哺乳动物细胞CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除？A.Cas12aB.Cas9-HF1C.SpCas9D.Cas13d2.在构建全身性敲除小鼠时，通常首先获得的是：A.F0代嵌合体B.F1代杂合子C.F2代纯合子D.条件性敲除鼠3.利用同源重组进行基因替换时，为提高中靶率，最佳供体DNA类型是：A.单链寡核苷酸B.双链线性化质粒C.超螺旋质粒D.长单链DNA4.若欲在特定脑区实现基因敲除，优先选用的Cre工具鼠应由下列哪种启动子驱动：A.CMVB.CAGC.NestinD.Camk2a-CreERT25.在CRISPR筛选中，为降低“脱靶”假阳性，最合理的对照sgRNA设计策略是：A.随机打乱种子区B.保留PAM仅改5′端C.保留种子区仅改PAM远端D.使用非靶向基因组序列6.下列哪项不是验证基因敲除“无效等位基因”的金标准？A.Westernblot检测蛋白缺失B.Northernblot检测mRNA缩短C.高深度全基因组测序D.实时PCR检测sgRNA位点周围2kb缺失7.利用TALEN进行大基因片段删除时，其效率主要受限于：A.FokI切割域的半衰期B.靶点染色质开放程度C.TALE重复单元数量D.质粒转染效率8.在iPS细胞中进行基因敲除后，若出现核型异常，最可能的原因是：A.Cas9蛋白毒性B.单细胞克隆压力C.sgRNA脱靶D.抗生素筛选浓度过高9.下列哪种报告系统最适合实时追踪活体动物中Cre重组酶活性？A.LacZB.GFP-L10aC.Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomatoD.Luciferase10.当采用双loxP系统敲除关键代谢酶基因时，为避免胚胎致死，最佳策略是：A.全身杂合敲除B.诱导型全身敲除C.组织特异性条件敲除D.RNA干扰替代二、填空题，每题2分11.CRISPR/Cas9介导的移码突变最常发生在PAM上游第________位核苷酸附近。12.在小鼠胚胎干细胞中进行基因打靶时，常用________抗生素筛选标记替代neo抗性基因以实现负筛选。13.利用Cre-loxP系统时，若两个loxP位点同向排列，重组后染色体上留下的序列是________。14.当sgRNA出现1bp错配时，Cas9切割效率下降最明显的区域称为________区。15.在pigs中实现多基因同步敲除，常利用________核酸酶系统以缩短育种周期。16.为验证大鼠条件性敲除的时空特异性，通常将Cre报告基因________插入Rosa26位点。17.利用AAV载体递送CRISPR组分时，为减少免疫原性，常选用________血清型。18.在植物中进行基因敲除，若需避免转基因DNA整合，可采用________介导的Cas9核糖核蛋白递送。19.利用双sgRNA策略删除100kb片段时，为降低染色体碎裂风险，应在两端同时引入________修复模板。20.当敲除抑癌基因后，若细胞出现染色体碎裂样图谱，提示发生了________危机。三、判断题，每题2分21.Cas9蛋白的HNH结构域负责切割非互补DNA链。22.条件性敲除鼠与全身敲除鼠在F1代即可通过PCR直接区分基因型。23.利用ssODN模板进行点突变时，对称型设计比非对称型设计在多数基因座效率更高。24.在CRISPR筛选中，magellan算法主要用于校正sgRNA慢病毒整合偏好。25.将Cas9敲入Rosa26位点可降低其背景表达，从而提高条件性敲除的严谨性。26.利用T7E1酶切检测突变时，不能完全区分纯合敲除与野生型。27.在斑马鱼中，F0代注射CRISPR即可直接获得可遗传的纯合敲除。28.基因敲除后的补偿性上调邻近基因表达属于“遗传缓冲”现象。29.使用DeadCas9融合转录激活子可实现基因敲除后的功能挽救。30.在单细胞克隆中，若出现双等位基因不同移码突变，称为复合杂合敲除。四、简答题，每题5分31.简述CRISPR/Cas9介导的基因敲除中“脱靶”效应的三种主要检测方法及其原理。32.概述利用Cre-loxP系统构建肾脏近端小管特异性敲除小鼠的完整流程，包括打靶载体设计与鉴定要点。33.说明在植物中利用CRISPR实现双等位基因敲除后，如何快速获得无T-DNA纯合突变体的策略。34.比较大片段删除（>50kb）与经典移码敲除在功能研究中的优缺点各两点。五、讨论题，每题5分35.结合实例讨论为何某些基因全身敲除导致胚胎致死，而条件性敲除却可揭示其成年期功能。36.分析在临床治疗中，体内基因敲除面临的主要安全壁垒，并提出两条可行的缓解策略。37.探讨“基因敲除与基因抑制（如RNAi）”在解析必需基因功能时的互补性及局限性。38.评估CRISPR大规模筛选在肿瘤免疫治疗靶点发现中的应用价值，并指出未来需解决的技术瓶颈。答案与解析一、单项选择题1.C2.A3.D4.D5.C6.D7.B8.B9.C10.C二、填空题11.312.tk13.单个loxP位点及中间序列被删除14.种子15.CRISPR/Cas12a或Cas9双切口16.Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomato17.AAV9或AAV-PHP.eB18.PEG或电转19.双链断裂同源修复模板20.复制压力或断裂-融合-桥三、判断题21.×（HNH切互补链）22.×（需F2）23.×（非对称高）24.√25.√26.√27.×（F0为嵌合）28.√29.×（激活子不能敲除）30.√四、简答题31.（1）全基因组测序法：提取敲除细胞基因组，高通量测序后通过Cas-OFFinder等比对，统计潜在脱靶位点突变率。（2）Digenome-seq：体外将Cas9-gRNA与纯化基因组共孵育，测序捕获切割位点，预测脱靶。（3）CIRCLE-seq：将基因组片段环化后测序，检测Cas9切割产生的线性化片段，灵敏度高。三种方法互补，可实验验证。32.设计floxed载体时在目标外显子两侧各放1个loxP，打靶后获得neo抗性F1嵌合鼠，删除neo获得flox鼠；与Camk2a-CreERT2鼠杂交，给予他莫昔芬诱导，PCR验证重组，免疫荧光检测肾小管特异性缺失，Western确认蛋白消失。33.利用CRISPR核糖核蛋白电转，T0代获得双等位突变；自交后提取子叶DNA，用dCAPS标记检测T-DNA插入；无带个体继续繁殖，两代后获得纯合无转基因株，测序验证。34.大片段删除优点：彻底移除调控元件，避免残余蛋白；缺点：可能删除邻近基因，染色体不稳定。移码敲除优点：操作简便，不影响邻近基因；缺点：可能产生残余功能肽段，难以评估非编码元件。五、讨论题35.例：Myc全身敲除胚胎第9.5天致死，因胎盘发育缺陷；用Meox2-Cre在胚胎外组织保留Myc，可获存活幼鼠，再于成年期用Tamoxifen诱导肝删除，揭示Myc调控再生，显示时空特异性对功能解析的必要性。36.主要壁垒：脱靶导致基因组不稳定及免疫过激。策略：①采用高保真Cas9变体并缩短表达时间；②利用脂质纳米颗粒递送RNP，减少DNA整合，同时加入瞬时凋亡抑制剂保护正常组织。37.敲除提供完全失活模