宏基因组二代测序技术在毛霉病诊断中的研究进展

宏基因组二代测序技术在毛霉病诊断中的研究进展【摘要】毛霉病发病率逐年上升，病情进展迅速，病死率高，早期诊治对改善毛霉病患者预后极为关键。毛霉病确诊依靠病理组织检查及微生物培养，但灵敏性低，耗时长，极易误诊、漏诊。近年来宏基因组二代测序技术在毛霉病早期诊断中发挥重要作用，但其尚不能作为确诊证据。现对宏基因组二代测序技术在毛霉病诊断中的价值作一综述。【关键词】毛霉菌病；诊断；宏基因组二代测序毛霉病（ｍｕｃｏｒｍｙｃｏｓｉｓ）是由毛霉目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）真菌引起的侵袭性真菌病，常发生在免疫功能低下的患者中，如血糖控制不佳的糖尿病、血液系统恶性肿瘤、造血干细胞移植、实体器官移植、糖皮质激素治疗、新型冠状病毒感染、创伤／烧伤等［１-２］。毛霉病进展迅速，致死率高，早期诊断和治疗是改善预后的关键。近年随着分子生物学进步，宏基因组二代测序技术（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｍＮＧＳ）在包括毛霉病的感染性疾病的病原学诊断中展现出显著优势［３-４］。虽然ｍＮＧＳ检测毛霉的阳性率高于常规检测方法［５］，但由于毛霉目真菌在自然界广泛存在，ｍＮＧＳ检出的毛霉目真菌还需要结合临床解读，并注意排除污染的可能。本研究将对ｍＮＧＳ在毛霉病诊断中的应用进行综述，为毛霉病的临床诊疗提供参考。一、毛霉病特点及诊断现状目前毛霉病发病率日益升高，年发病率估计为每百万人中有１．７人［６-７］，是继念珠菌病、曲霉病、隐球菌病后一种较为常见的侵袭性真菌病［８］。毛霉病根据感染部位不同分为肺毛霉病、鼻眶脑毛霉病、皮肤毛霉病、肾毛霉病、胃肠毛霉病，以及播散性毛霉病等临床类型。毛霉病病死率因临床类型、患者基础疾病、治疗时机等因素存在较大差异。其中播散型毛霉病病死率最高，可达８０％［９］。有研究表明，接受治疗的毛霉病患者病死率为２５．７％，未接受治疗的患者病死率高达１００％［１０］。目前，临床上诊断毛霉病需综合宿主因素、临床表现、微生物学证据及组织病理学检查。只具备宿主因素和临床表现为拟诊毛霉病，同时具备宿主因素、临床表现和微生物学证据为临床诊断毛霉病，对于来自无菌部位取材的组织或其他标本，采用病原学或组织病理学诊断方法发现毛霉目真菌可以确诊毛霉病。传统微生物学检测方法包括显微镜直接镜检、真菌培养及鉴定。毛霉在显微镜下呈宽大、无隔或少隔、直角分枝、不规则的菌丝，过碘酸希夫染色或六胺银染色为阳性。镜检发现毛霉菌丝能够帮助作出疑似诊断，但其镜下结构与曲霉相似，需要依靠病理科医师的丰富经验进行识别，且无法对毛霉种属进行鉴定。真菌培养存在培养时间长，灵敏度低，标本易被污染等局限性。分子生物学技术如ＰＣＲ的灵敏度高，可在全血、血清、血浆、肺泡灌洗液、尿液等多种标本中检测毛霉目ＤＮＡ，但这种高灵敏度也增加了环境真菌的污染风险，且目前国内尚无取得国家药品监督管理局许可证的试剂盒。为鉴定组织中的致病毛霉，有研究开发了荧光原位杂交方法用于在石蜡包埋组织中快速识别毛霉，以及实时荧光定量ＰＣＲ法鉴定毛霉种属［１１-１２］，目前尚处于临床科研阶段。ｍＮＧＳ可以从血清、组织和分泌物样本中检测到病原体［１３］，且能够在属和种水平上对病原菌进行鉴定［１］，在毛霉病病原诊断中逐渐凸显出优势。《全球毛霉病诊断和治疗指南》（２０１９年）建议对于疑难重症病例，当常规诊断方法无法明确诊断时，可考虑采用分子生物学方法（包括ｍＮＧＳ技术）以辅助诊断［１］；《中国毛霉病临床诊疗专家共识（２０２２）》则建议将ｍＮＧＳ用于毛霉病诊断［１４］。二、ｍＮＧＳ在毛霉病诊断中的应用现状１．ｍＮＧＳ能缩短诊断时间及提高灵敏度：传统微生物检测方法培养毛霉通常需要２～５ｄ（若完成菌种鉴定及药物敏感试验，需５～７ｄ），而组织病理学结果回报一般需要２～７ｄ，甚至更长。ｍＮＧＳ从样本收集到实验室报告检出，通常可在２４～４８ｈ内完成。一项来自中国西部地区纳入ＩＣＵ毛霉病患者的多中心研究表明，与传统病原微生物检测方法相比，ｍＮＧＳ可缩短诊断时间，并缩短患者的住院时间［５］。Ｗａｎｇ等［１５］分别应用培养、病理检查、ｍＮＧＳ诊断毛霉病，结果显示ｍＮＧＳ的检出时间更快；且与早期诊断相比，延迟诊断（即患者入院后＞７ｄ或症状发作后＞３０ｄ）的患者预后不佳，因此，早期诊断毛霉病对于患者预后非常重要。另有研究纳入２０例确诊肺毛霉病病例，其中１０例患者接受了ｍＮＧＳ检查，阳性率高达９０％（９／１０），表明ｍＮＧＳ在肺毛霉病诊断中的高灵敏度优势［１６］。２．ｍＮＧＳ检测样本选择：根据现有专家共识与临床实践，ｍＮＧＳ检测的样本选择应优先考虑感染病灶部位样本，呼吸系统感染首选支气管肺泡灌洗液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ，ＢＡＬＦ），其次为诱导痰、咳痰或吸痰，若无法获取呼吸道样本，可考虑病灶组织或外周血；中枢神经系统感染首选脑脊液，其次为脑组织或脑引流液，重症感染时可增加血液样本；泌尿系统感染首选尿培养，若尿培养阴性且疑为特殊病原体，可送检清洁中段尿；局灶性感染（如脓肿、骨髓炎、眼内炎等）首选感染病灶部位的脓液、组织或穿刺液送检；血流感染若无法获取病灶样本，可采集外周血送检，但需注意血液样本灵敏度较低，应结合临床综合判断。有研究报道１例发热、头痛的患者，其外耳道分泌物、鼻、外周血及脑脊液多种临床标本病原培养均为阴性，但脑脊液ｍＮＧＳ提示检出横梗霉４个序列数，结合临床表现，诊断为毛霉病［１７］。毛霉病患者常合并严重基础疾病，感染病灶标本可能获取困难，血培养一般无法培养出毛霉目真菌，但毛霉具有侵袭血管特性，外周血中可能具有循环毛霉ＤＮＡ。索涛等［１８］通过ｍＮＧＳ在１例肾移植术后患者的外周血中检出米根霉（序列数为５）及伞状横梗霉（序列数为４），结合患者症状体征、辅助检查，临床诊断为肺部及鼻眶脑毛霉感染，予抗毛霉治疗及鼻窦病灶手术清除，鼻部病理检查见毛霉菌丝，经过治疗后临床症状好转，复查胸部、鼻窦及颅脑ＣＴ结果显示病灶显著减少。Ｗａｎｇ等［４］报道外周血ｍＮＧＳ诊断侵袭性毛霉病的阳性预测值为７２．６％，其中２０例患者虽然在外周血ｍＮＧＳ中检出毛霉菌属核酸，但缺乏毛霉菌属感染的危险因素或临床特征，也缺乏其他病理证据，故考虑为假阳性；与感染组结果相比，假阳性患者检出的毛霉序列数较低。一项全国多中心的前瞻性研究评估了血浆ｍＮＧＳ在急性白血病粒细胞缺乏伴发热患者中的诊断性能，结果显示ｍＮＧＳ的临床相关感染性病原体阳性检出率明显高于传统血培养（５０．９％比２１．３％），血浆ｍＮＧＳ可以检测到感染病灶所释放的曲霉属、毛霉目等病原体的ＤＮＡ片段［１９］。因此，外周血ｍＮＧＳ在诊断侵袭性毛霉病中可能具有较好的临床应用价值，特别是在粒细胞缺乏症、影像学检查提示有毛霉病表现，以及ｍＮＧＳ检出序列数较高的患者中。需要注意的是，如果血液样本中检出真菌序列，不一定代表病原体已经入血，只是说明其游离核酸已经入血，还需要明确是否有其他部位的真菌感染。３．ｍＮＧＳ在鉴定毛霉种属中的作用：不同种属的毛霉对抗真菌药物的敏感性存在差异，如根霉属、横梗霉属和根毛霉属对两性霉素Ｂ有较好的体外活性；泊沙康唑和艾沙康唑在不同种属间活性差异较为明显；卷曲毛霉对新型三唑类药物的最低抑菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）较高；小克银汉霉属对新型三唑类药物的ＭＩＣ也较高，部分菌株对两性霉素Ｂ也呈现出较高的ＭＩＣ值［２０-２２］。另外，不同毛霉种属可能导致不同的临床类型［２］，如根霉属主要导致鼻眶脑、肺及皮肤毛霉病，小克银汉霉属主要导致肺及播散性毛霉病［２３-２４］。ｍＮＧＳ可直接鉴定致病毛霉到种水平，不仅可以帮助临床医师结合病原学鉴定结果进行个体化决策，而且可积累更多致病毛霉菌种与疾病临床类型之间关系的数据，并有助于发现少见毛霉引起的不同临床类型毛霉病。例如，应用ｍＮＧＳ发现少见毛霉小孢根霉和总状毛霉混合感染导致的播散性毛霉病和小孢根霉导致的肺毛霉病，血ｍＮＧＳ协助诊断急性髓系白血病患者累及肝脏的播散性毛霉病［２５-２７］。因此，ｍＮＧＳ可提供诊断线索、协助发现罕见毛霉种属，临床医师在结合其他临床证据后能够早期诊断、早期治疗。随着ｍＮＧＳ在临床毛霉病诊断中应用的增多，将会有更多的数据积累。三、毛霉病诊断中ｍＮＧＳ报告的解读ｍＮＧＳ报告的正确解读是ｍＮＧＳ应用于临床诊断非常重要的一环。临床经常会遇到ｍＮＧＳ报告发现毛霉目真菌仅有几个或十几个序列数，可能由于真菌通常基因组较大，并且存在较厚的细胞壁，核酸提取效率低，即使前期进行了破壁处理，其检出的特异序列数仍较少；另外，患者抗真菌治疗后真菌数量减少，但仍有一些游离核酸的存在，此时采集样本进行测序可能得到的是病原微生物死亡后降解的核酸，故测出的真菌序列数也较少。由于ｍＮＧＳ检测质量有所差异，报告解读缺乏规范，不同标本的ｍＮＧＳ报告解读也不尽相同，目前我国已发表多个专家共识，但仍缺乏统一性，如《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》中指出真菌即使在检测报告中序列数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证［２８］。《中国毛霉病临床诊疗专家共识（２０２２）》中指出，对于ｍＮＧＳ检出的低序列毛霉目真菌（一般＜１０条），尤其是在非无菌部位，不能排除试剂污染或环境来源污染，应予以重视［１４］。２０２２年《呼吸系统感染中宏基因组测序技术临床应用与结果解读专家共识》中提出ｍＮＧＳ检出真菌（种水平）的特异性序列数是任何其他真菌的５倍以上，判断为阳性［２９］。《中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识》指出真菌核酸提取难度较大，检出的特异性序列数可能少，阳性报告就应该考虑其致病可能［３０］。在临床实践中，不同临床标本ｍＮＧＳ的报告基线目前并无相关研究及可靠诊断标准。ｍＮＧＳ的高灵敏度提高了临床对病原菌的检测效率，但存在污染、人源背景高、非特异性扩增等导致假阳性结果的问题［３１-３３］。因此，需结合患者临床表现、传统实验室检查及病理组织学检查等结果综合评估ｍＮＧＳ在毛霉病中的诊断价值及不同临床标本毛霉序列数报告基线。目前，已有研究表明通过加入内参可以区分污染菌和致病菌［３４］。优化样本处理和数据解读方法及改进的生物信息学方法能有效减少假阳性率，从而提高ｍＮＧＳ的诊断准确性［３５-３７］。还需进一步开展相关研究，提升ｍＮＧＳ在毛霉病中的诊断价值。四、ｍＮＧＳ在毛霉病诊断中的挑战尽管许多研究和病例报告表明ｍＮＧＳ在毛霉病诊断方面具有较高应用价值，但ｍＮＧＳ在临床中的常规应用仍面临较多挑战。第一，ｍＮＧＳ检测费用高，远超许多其他临床检测，从而限制其在临床广泛应用，特别是在资源缺乏的地区。第二，ｍＮＧＳ的灵敏性高度依赖于背景（主要来自人类宿主或微生物组），且在高背景中下降。在人类样本中，病原体读序仅占所有ｍＮＧＳ结果的一小部分，而超过９５％的测序结果是人源核酸，因此，如何去除人源核酸以富集病原体是ｍＮＧＳ在毛霉病诊断中的重要方向。第三，毛霉核酸提取效率较低是影响ｍＮＧＳ诊断效能的关键因素，如何高效地提取核酸也是其面临的重要挑战。第四，致病毛霉目真菌种属多，且真菌分类仍在持续研究中，新的种属不断被发现，但不同公司ｍＮＧＳ的基因组数据库来源和更新速度存在差异，测序深度和测序覆盖度也存在差异，可能存在假阴性。五、小结与展望在毛霉病诊断方面，ｍＮＧＳ具有快速、阳性率较高等优势，并有助于识别少见毛霉种属，且血液ｍＮＧＳ在毛霉病诊断中也具有一定优势。然而，考虑到ｍＮＧＳ目前缺乏统一检测平台及判读标准，存在假阴性、假阳性，临床医师需将ｍＮＧＳ与传统微生物检测方法相结合，根据患者具体情况综合判读，以明确真正致病菌，尤其是在序列数较低的非无菌部位标本中更需仔细甄别致病菌或污染菌。目前有关ｍＮＧＳ诊断毛霉病的研究数据有限，还有许多问题需要解决，需要更多前瞻性研究探讨ｍＮＧＳ在毛霉病诊断中的应用价值。随着技术成熟，ｍＮＧＳ的检测流程将更加标准化，成本逐渐降低，有望成为毛霉病诊断的常规手段。未来可能通过建立公共数据库和共享平台，结合人工智能实现检测结果的高效解读和临床推广。参考文献[1]CornelyOA,Alastruey-IzquierdoA,ArenzD,etal.Globalguidelineforthediagnosisandmanagementofmucormycosis:aninitiativeoftheEuropeanConfederationofMedicalMycologyincooperationwiththeMycosesStudyGroupEducationandResearchConsortium[J].LancetInfectDis,2019,19(12)：e405-e421.10.1016/S1473-3099(19)30312-3.[2]JeongW,KeighleyC,WolfeR,etal.Theepidemiologyandclinicalmanifestationsofmucormycosis:asystematicreviewandmeta-analysisofcasereports[J].ClinMicrobiolInfect,2019,25(1)：26-34.DOI:10.1016/j.cmi.2018.07.011.[3]安鹤林.宏基因组二代测序在中枢神经系统毛霉菌病的早期诊断中的应用价值[D].石家庄：河北医科大学，2024.[4]WangW,YaoY,LiX,etal.Clinicalimpactofmetagenomicnext-generationsequencingofperipheralbloodforthediagnosisofinvasivemucormycosis:asingle-centerretrospectivestudy[J].MicrobiolSpectr,2024,12(1):e03553-23.DOI:10.1128/spectrum.03553-23.[5]YangF,ZhangY,QiB,etal.ClinicalmanifestationsandprognosisofpatientswithmucormycosisinintensivecareunitsinWesternChina:amulti-centerretrospectivestudy[J].Mycoses,2025,68(3)：e70042.DOI:10.1111/myc.70042.[6]AbdollahiA,ShokohiT,AmirrajabN,etal.Clinicalfeatures,diagnosis,andoutcomesofrhino-orbito-cerebralmucormycosis:aretrospectiveanalysis[J].CurrMedMycol,2016,2(4)：15-23.DOI:10.18869/acadpub.cmm.2.4.15.[7]GiannellaM,LanternierF,DellièreS,etal.Invasivefungaldiseaseintheimmunocompromisedhost:changingepidemiology,newantifungaltherapies,andmanagementchallenges[J].ClinMicrobiolInfect,2025,31(1)：29-36.DOI:10.1016/j.cmi.2024.08.006.[8]FangW,WuJ,ChengM,etal.Diagnosisofinvasivefungalinfections:challengesandrecentdevelopments[J].JBiomedSci,2023,30(1)：42.DOI:10.1186/s12929-023-00926-2.[9]DangJ,GoelP,ChoiKJ,etal.Mucormycosisfollowingburninjuries:asystematicreview[J].Burns,2023,49(1)：15-25.DOI:10.1016/j.burns.2022.05.012.[10]DenningDW.Globalincidenceandmortalityofseverefungaldisease[J].LancetInfectDis,2024,24(7)：e428-e438.DOI:10.1016/S1473-3099(23)00692-8.[11]LiuX,SongY,LiR.TheuseofcombinedPCR,fluorescenceinsituhybridisationandimmunohistochemicalstainingtodiagnosemucormycosisfromformalin-fixedparaffin-embeddedtissues[J].Mycoses,2021,64(12)：1460-1470.DOI:10.1111/myc.13382.[12]徐春晖，周欣悦，伊慧明，等.病原mNGS和毛霉菌PCR检测诊断血液病患者肺毛霉菌病[J].检验医学，2024,39(12)：1145-1149.DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2024.12.003.[13]MitchellSL,SimnerPJ.Next-generationsequencinginclinicalmicrobiology:arewethereyet？[J].ClinLabMed,2019,39(3)：405-418.DOI:10.1016/j.cll.2019.05.003.[14]中国医药教育协会真菌病专业委员会，中国毛霉病专家共识工作组.中国毛霉病临床诊疗专家共识(2022)[J].中华内科杂志，2023，62(6)：597-605.DOI：10.3760/112138-20220729-00557.[15]WangJ,WangY,HanF,etal.Multiplediagnosticmethodsformucormycosis:aretrospectivecaseseries[J].JClinLabAnal,2022,36(8)：e24588.DOI:10.1002/jcla.24588.[16]刘智博，张芳，梁朝阳，等.手术与未手术肺毛霉病患者29例临床特征分析[J].中华结核和呼吸杂志，2024,47(10)：946-954.DOI:10.3760/112147-20240426-00223.[17]LiuY,ZhangJ,HanB,etal.Casereport:diagnosticvalueofmetagenomicsnextgenerationsequencinginintracranialinfectioncausedbymucor[J].FrontMed(Lausanne),2021,8：682758.DOI:10.3389/fmed.2021.682758.[18]索涛，陈先梦，许启霞.肾移植术后新型冠状病毒感染继发播散性毛霉病1例[J].中国感染与化疗杂志，2025,25(1)：89-92.DOI:10.16718/j.1009-7708.2025.01.014.[19]FengS,RaoG,WeiX,etal.Clinicalmetagenomicsequencingofplasmamicrobialcell-freeDNAforfebrileneutropeniainpatientswithacuteleukaemia[J].ClinMicrobiolInfect,2024,30(1)：107-113.DOI:10.1016/j.cmi.2023.05.034.[20]BadaliH,Cañete-GibasC,McCarthyD,etal.EpidemiologyandantifungalsusceptibilitiesofmucoraleanfungiinclinicalsamplesfromtheUnitedStates[J].JClinMicrobiol,2021,59(9)：e01230-21.DOI:10.1128/JCM.01230-21.[21]BormanAM,FraserM,PattersonZ,etal.InvitroantifungaldrugresistanceprofilesofclinicallyrelevantmembersoftheMucorales(Mucoromycota)especiallywiththenewertriazoles[J].JFungi(Basel),2021,7(4)：271.DOI:10.3390/jof7040271.[22]EscribanoP,MesquidaA,López-MontesinosS,etal.AmphotericinB,itraconazole,posaconazole,andisavuconazoleMICsagainstclinicalMucoralesisolatesobtainedbyvisualinspectionandspectrophotometricreadingaccordingtotheEUCAST9.4procedure[J].MedMycol,2023,61(5)：myad045[pii].DOI:10.1093/mmy/myad045.[23]MahalaxmiI,JayaramayyaK,VenkatesanD,etal.Mucormycosis:anopportunisticpathogenduringCOVID-19[J].EnvironRes,2021,201：111643.DOI:10.1016/j.envres.2021.111643.[24]ÖzbekL,TopçuU,ManayM,etal.COVID-19-associatedmucormycosis:asystematicreviewandmeta-analysisof958cases[J].ClinMicrobiolInfect,2023,29(6)：722-731.DOI:10.1016/j.cmi.2023.03.008.[25]HaiL,LiP,XiaoZ,etal.RhizopusmicrosporusandMucorracemosuscoinfectionfollowingCOVID-19detectedbymetagenomicsnext-generationsequencing:acaseofdisseminatedmucormycosis[J].Heliyon,2024,10(4)：e25840.DOI:10.1016/j.heliyon.2024.e25840.[26]SunY,LiH,ChenJ,etal.Casereport:metagenomicsnext-generationsequencingcanbeperformedforthediagnosisofdisseminatedmucormycosis[J].FrontMed(Lausanne),2021,8：675030.DOI:10.3389/fmed.2021.675030.[27]ShenM,LiQ,ZengZ,etal.Mucorindicuscauseddisseminatedinfectiondiagnosedbymetagenomicnext-generationsequencinginanacutemyeloidleukemiapatient:acasereport[J].FrontCellInfectMicrobiol,2023,13：1089196.DOI:10.3389/fcimb.2023.1089196.[28]中华医学会检验医学分会临床微生物学组，中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组，中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会.宏基因组高通量测序技术应用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