土壤微生物量碳的测定方法-征求意见版

T/NAIA0001—2020

ICS13.080.30

B10

团体标准

T/NAIA0001—2020

土壤微生物量碳的测定

2020-XX-XX发布2020-XX-XX实施

宁夏化学分析测试协会发布

T/NAIA0001—2020

土壤微生物量碳的测定

1范围

本标准规定了土壤微生物量碳的测定方法

本标准适用于各类土壤微生物量碳的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适

用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存

3原理

新鲜土样经氯仿熏蒸24h后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量碳，用

硫酸钾溶液提取微生物量碳，测定提取液中有机碳含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤有机碳

的差值及转换系数，计算土壤微生物量碳。

4试剂和溶液

除非另有说明外，本方法均使用符合国家标准的分析纯试剂，分析用水为GB/T6682

规定的三级水。

4.1氯仿（CHCl3）。

4.1.1去乙醇氯仿制备

市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前须将乙醇去除。方法是量取适量的氯仿

和二级水按1:2的比例置入分液漏斗中，充分震摇1min并静置分层后，慢慢放出底层氯仿

于干燥的烧杯中，重复洗涤3次，得到无乙醇氯仿，向其中加入无水氯化钙，以除去氯仿中

的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在4℃、黑暗条件下保存。

注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

4.2氢氧化钠（NaOH）。

4.3硫酸钾（K2SO4）。

4.4重铬酸钾（K2Cr2O7）。

4.5浓硫酸（H2SO4）。

4.6硫酸亚铁（FeSO4）。

4.7邻菲啰啉指示剂（C12H8N2）。

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4.8氢氧化钠溶液（1mol/L）

称取40g（精确至0.01g）氢氧化钠，用水溶解，定容至1000mL。

4.9硫酸钾浸提剂（0.5mol/L）

称取174.26g（精确至0.01g）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L塑料桶中，加水

2L，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min）至完全溶解。

4.10重铬酸钾标准溶液（0.2500mol/L）

称取12.26g（精确至0.0001g）重铬酸钾（优级纯）溶于600mL〜800mL水中，加水

定容至1000mL。

4.11硫酸亚铁标准溶液（0.05mol/L）

称取14g（精确至0.0001g）硫酸亚铁溶于600mL〜800mL水中，加浓硫酸5mL搅拌

均匀，静止片刻后定容至1000mL。此溶液易被空气氧化而致浓度下降，每次使用时应标定

其准确浓度。

4.12邻菲啰啉指示剂

称取邻菲啰啉1.49g（精确至0.0001g）溶于含有0.7g（精确至0.0001g）硫酸亚铁

或1g（精确至0.0001g）硫酸亚铁铵的100mL水溶液中。注：此指示剂易变质，应密闭保

存于棕色瓶中。

5仪器设备

5.1电子天平：感量0.0001g和0.01g。。

5.2真空泵。

5.3油浴锅（可控温180℃±5℃）。

5.4恒温培养箱（25℃±1℃）。

5.5摇床（25℃，150r/min，300r/min）。

6分析步骤

6.1土壤前处理

新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体(如

根、茎和叶)及土壤动物(如蚯蚓等)，过2mm孔径筛并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当

风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量的40%（以手感湿润

疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用水调节含水量至田间持水量的40%。将土壌

置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7-15d。桶内有适量水以保证相对湿度为100%，

并在桶内放一小烧杯1mol/LNaOH溶液以吸收土壌呼吸产生的CO2。这些过程是为了消除土

壤水分限制对微生物的影响以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，

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应置于4℃下保存，且分析前需在上述条件下至少再培养24h。

6.2熏蒸

称取经前处理相当干50g（精确至0.01g）烘干基的新鲜土壤3份，置于100mL烧杯

中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2~3个，烧

杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗

瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯1mol/LNaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器

底部还应加入少量水以保持湿度，用真空泵抽真空，在-0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾

3-5min。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下熏蒸24h。打开干燥器阀门时，由于

空气进入应该能听见有明显嘶嘶的声音，否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。

取出土壤和氯仿（氯仿倒回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器

中，反复抽真空（-0.07Ma）直到土壌无氯仿味为止，否则，残留在土壤中的氯仿将影响分

析结果。一般需要反复抽真空5-6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器，以

加快去氯仿速度和效果。

在熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿进行熏蒸外，

其他操作与熏蒸土壤一样，作为对照土壤。

6.3浸提

将熏蒸后的土壤无损转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol/L硫酸钾浸

提剂（4.9），使土水比为1:2（土壤为质量单位g，浸提液为体积单位mL），振荡（25℃，

300r/min）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于100mL塑料瓶中。另称取等量的3份对

照土壤于200mL聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL0.5mol/L硫酸钾浸提剂（4.9）同上

浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白，过滤后的浸提液应立即分析，或在-18℃下保存。

6.4测定

取10mL土壤浸提液于硬质试管中（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加5.00mL

0.2500mol/L重铬酸钾标准溶液（4.10），5.00mL浓硫酸（4.5），摇匀，并在每个试管口

插入玻璃漏斗。将试管逐个插入铁丝笼中。再将铁丝笼沉入加热至175℃〜185℃的油浴

锅内，使管中的液面低于油面，待试管中的溶液沸腾时开始计时，溶液剧烈沸腾时，可能因

溢出而造成损失，其间可轻轻提起铁丝笼在油浴锅中晃动几次，以使溶液温度均匀，并维持

在175℃〜185℃，5min后，将铁丝笼从油浴锅内提出，冷却片刻，擦去试管外的油液。

把试管内的消煮液无损地转入250mL三角瓶中，用水冲洗试管及小漏斗，洗液并入三角瓶

中，使三角瓶内溶液的总体积控制在50mL〜60mL。加3滴邻菲啰琳指示剂（4.12），用硫

酸亚铁标准溶液（4.11）滴定剩余的重铬酸钾，溶液的变色过程是橙黄-蓝绿-棕红，即为终

点。记录硫酸亚铁滴定量。

7结果计算

样品中有机碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（1）计算：

c(VV)0.0031.10100

C01000(1)

mfV1

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式中：

C样品中有机碳的含量，单位为克每千克（g/kg）；

V0空白试验所消耗硫酸亚铁标准溶液体积，单位为毫升（mL）；

V试样试验所消耗硫酸亚铁标准溶液体积，单位为毫升（mL）；

C硫酸亚铁标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（moL/L）；

0.0031/4碳原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmol）；

1.10氧化校正系数；

m称取试样的质量，单位为克（g）；

f土壤水分系数；

V1用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL）。

土壤微生物量碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（2）计算：

BcEck(2)

式中：

Bc土壤中微生物量碳的含量，单位为克每千克（g/kg）；

Ec熏蒸土壤浸提测定的有机碳－不熏蒸土壤浸提测定的有机碳，单位为克每千克

（g/kg）；

K转换系数，取值0.45。

结果保留三位有效数字。

8精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

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前言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》规定编写。

本标准由宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）提出。

本标准由宁夏化学分析测试协会归口。

本标准起草单位：宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）、宁夏大学、宁夏农林科学院荒漠

所、宁夏化学分析测试协会。

本标准主要起草人：王京、白玲、马晓瑞、刘鸿翔、杨仪、俞鸿千、张小飞、刘娜娜、。

本标准于2020年XX月XX日首次发布。

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土壤微生物量碳的测定

1范围

本标准规定了土壤微生物量碳的测定方法

本标准适用于各类土壤微生物量碳的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适

用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存

3原理

新鲜土样经氯仿熏蒸24h后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量碳，用

硫酸钾溶液提取微生物量碳，测定提取液中有机碳含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤有机碳

的差值及转换系数，计算土壤微生物量碳。

4试剂和溶液

除非另有说明外，本方法均使用符合国家标准的分析纯试剂，分析用水为GB/T6682

规定的三级水。

4.1氯仿（CHCl3）。

4.1.1去乙醇氯仿制备

市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前须将乙醇去除。方法是量取适量的氯仿

和二级水按1:2的比例置入分液漏斗中，充分震摇1min并静置分层后，慢慢放出底层氯仿

于干燥的烧杯中，重复洗涤3次，得到无乙醇氯仿，向其中加入无水氯化钙，以除去氯仿中

的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在4℃、黑暗条件下保存。

注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

4.2氢氧化钠（NaOH）。

4.3硫酸钾（K2SO4）。

4.4重铬酸钾（K2Cr2O7）。

4.5浓硫酸（H2SO4）。

4.6硫酸亚铁（FeSO4）。

4.7邻菲啰啉指示剂（C12H8N2）。

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4.8氢氧化钠溶液（1mol/L）

称取40g（精确至0.01g）氢氧化钠，用水溶解，定容至1000mL。

4.9硫酸钾浸提剂（0.5mol/L）

称取174.26g（精确至0.01g）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L塑料桶中，加水

2L，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min）至完全溶解。

4.10重铬酸钾标准溶液（0.2500mol/L）

称取12.26g（精确至0.0001g）重铬酸钾（优级纯）溶于600mL〜800mL水中，加水

定容至1000mL。

4.11硫酸亚铁标准溶液（0.05mol/L）

称取14g（精确至0.0001g）硫酸亚铁溶于600mL〜800mL水中，加浓硫酸5mL搅拌

均匀，静止片刻后定容至1000mL。此溶液