肺炎克雷伯菌耐药性机制

肺炎克雷伯菌耐药性机制摘要：由于抗菌药物滥用及院内感染等因素的日趋严重，特别是碳青霉烯类耐药菌(CRKP)，肺炎克雷伯菌作让菌株耐药性增强，AmpC酶超量表达、外排泵系统（以AcrAB-TolC为例）激活、荚膜多糖结构发生变异与生物膜形成会进一步削弱抗生素的治疗效果。在调控机制上看，双组分系统（像PhoPQ）借助调控基因表达的机制对耐药性产生影响；群体感应系统影响生物膜的形成以及耐药表型复杂地干预了耐药性演化的机制，其通过将耐药性质粒或辅助质粒作为靶向维持。当前研究虽说揭示了多机制共同作用引发了耐药谱的复杂性，然而仍需进一步探索非酶介导机制、耐药网络动态和环境传播途径等其他关键影响方面，未来应把多组学技术整合，用以挖掘新靶点、研发新型抗菌药物及防控策略，依靠这个应MechanismofdrugresistanceinKlebsiellaAbstract:Duetotheincreasinglyseriousaspectsofantibioticmisuseandhospital-acquircarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(CRKP),therisingdrugresistanceofthispathogenposesasignificantperiltoglobalpublichealth.ThisarticlesystematicallypresentsthekeymechanismsofCRKPresistaimpelledbytheproductionanddiffusionofcarbapenemases(suchascoredriversofK.Intermsofpneumoniaeresistance,genesfrequentlyspreadacrossspeciesviamobileeplasmidsandtransposons.ClonaldiffusionandhorizontalgenetransferresultinginCRKPresistance.Whenouter-membraneporinproteinsOPK35/OMPK36lackorpermeabilityand,throughothermechanisms,synergisticallyheightensthedrugfstrains.Theexcessiveexprestructuralvariationsofcapsulepolysaccharides,andbiofilmformationfurtherimpairtheefficacyofantibiotics.Inthedomainofregulatorymechanisms,thetwo-componentsystem(suchasPhoPQ)impactsresistanceviatheregofgeneexpression;quorumsensingsystemsinfluencethecoordinatedmechanismsofbiofilmformationandresistancephenotypes;theCRISPR-CASsystemintricatargetingresistanceorauxiliaryplasmidmolecules.Althoughexistingresearchhasrevealedthatmultiplemechanismsacttogethertocreatecomplexresistanceprofiles,additionalexplorationofnon-enzymatic-mediadynamicresistancenetworks,andenvironmentawelooktothefuture,multi-omicstechnologiesmustbeintantimicrobialdrugsanmulti-omicstechnologieshavtogetherpreventionandcontrolstrategiestodealwithglobalchallenKeywords:Drug-fast,Klebsiellapne肺炎克雷伯菌作为一种重要的条件性致病菌种，普遍存在于自然界跟人类的肠道当中，缘于抗菌药物不合理运用以及医院内交叉感染等缘由，造成肺炎克雷伯菌对药物产生耐药性这一问题近年愈发严峻，已成为全球公共卫生领域的一个棘手挑战，尤其是耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌(CRKP)出现继而扩散，让临床治疗的药物选择面临极大约束，由此造成患者住院时间拖长，治疗成本上扬，甚至造成死亡率攀升等现象，对患者的身体状况构成了严重威胁。深入探究肺炎克雷伯菌的耐药机理，对制定恰当的抗菌药物使用策略、防止耐药菌传播以及开发新型抗菌药物意义重大，此次研究目的是系统地归纳、剖析近年来肺炎克雷伯菌耐药性变化的原因及机理，用于后续研究时参考及比对，作为CRKP最主要耐药机制，就是碳青霉烯酶的产生与传播，我们首先得用心研究碳青霉烯酶主要类型在结构和功能方面的区别，碳青霉烯酶基因产生的条件及其传播机制，以及产碳青霉烯酶细菌的克隆传播途径和水平基因的转移形式；其次是围绕OPK35和OPKD36的结构及其产生耐药性的相关机制，以及外膜孔蛋白基因的突变和表达调控对耐药性起到的影响，探讨外膜孔蛋白改变引发的耐药机理。我们依旧会对其他耐药机制进行梳理，包括AmpC酶超量产生及对其调控、外排泵系统发挥的功效、荚膜多糖结构的变异状况以及生物膜形成和耐药性的关联，我们依旧从调控机制方面，探究双组分调控系统、群体感应系统和CRISPR-Cas系统在肺炎克雷伯菌耐药性形成中起到的作用，本综述针对这些耐药机理做综合分析，目的为揭示肺炎克雷伯菌耐药变化产生的复杂性，为未来研制抗菌药物构建理论根基，且有助于及时拟定耐药菌防治策略。作为肺炎克雷伯菌获得性耐药的主要形成途径，碳青霉烯酶产生及传播的流程复杂多样，不同类型碳青霉烯酶在结构与功能上存在显著差异，在菌株水解碳青霉烯抗生素的效果及底物谱方面存在直接影响，常见的碳青霉烯酶主要有KPC、NDM、OXA-48样、VIM以及IMP等，其中KPC是凭借酰化机制水解抗生素的丝氨酸碳青霉烯酶，其活性位点拥有关键的丝氨酸残基。而NDM、VIM、IMP这些金属β-内酰胺酶依赖锌离子来作为辅助因子，起到水解效果，OXA-48样酶展现出一定的特殊性，按照Leiros等人的研究表明，OXA-10家族的β-内酰胺酶（例如OXA-655）对厄他培南与美罗培南的水解能力更明显。带有含氧亚氨基取代基的β-内酰胺类抗生素，譬如头孢他啶，它的水解活性反倒呈现出下降趋势[1]，经过结构分析得出，OXA-655发生V117L突变，增强了第117位与ω环上第155位亮氨酸之间的范德华力，阻碍了第155位的运动，进而影响了OXA-655结合庞大氧亚氨基的能力，最终造成水解活性被影响[1]。可以发现，结构上的细微差别引起了这些酶之间功能的差异，这些碳青霉烯酶基因并非以孤立形式存在，它们一般跟移动遗传元件紧密地结合在一起，从而得以在不同细菌间迁移，这些“帮手”有像质粒、转座子和整合子这类，它们在传播耐药性基因方面均扮演关键角色。质粒作为细菌彼此传递遗传物质的“U盘”，可以携带包含碳青霉烯酶基因等各类基因，各类型的碳青霉烯酶基因，老是跟具体的质粒联系到一块，blaKPC基因往往位于InvertedRepeat-lackingTransposons(IRL)-type转座子之上，如Tn4401；而Tn4401频繁现身于IncP、IncF、IncX等类型的质粒之上。这些现象证明blaKPC基因可借助这些质粒在不同肺炎克雷伯菌菌株，甚至不同细菌物种间实现传播，转座子好比一种“跳蚤”，它既能在细菌染色体和质粒二者间跳跃，还可以辅助碳青霉烯酶基因朝新位置转移，Tokuda和Shintani宣称，抗菌药物耐药基因的传播，大多归因于经移动遗传元件进行水平基因转移[2]。整合子会捕获且整合一般是编码抗菌药的基因盒，多个耐药基因可以整合到同一个整合子里面，凑成一个“耐药基因聚合包”，然后经由质粒或转座子开展传播，哈耶克Diedet等人的研究表明，碳青霉烯酶基因的传播和这些移动遗传元件关联甚大，尤其是处于水体环境时，这些元件对不同细菌相互间耐药基因的产生有很大促进效果[3]，而碳青霉烯酶基因正是借助这类可移动的遗传元件，才能在细菌群体中广泛传播。碳青霉烯酶主要借助克隆传播和水平基因转移这两条途径造成产菌的传播[4]，克隆传播就是耐药菌株以自身复制的方式实现扩散，若有一个携带耐药基因的菌株适应能力不错，好比在医院环境之中更容易存活，也许会引起疫情的爆发，西班牙一家医院曾碰到由ST15型肺炎克雷伯菌引起的产生KPC型碳青霉烯酶的细菌爆发事件，因而导致短时间内若干人被感染。水平基因转移就是不同细菌之间耐药基因产生转移，主要借助像质粒、转座子和整合子这类可移动的遗传元件达成，来自日本的研究表明，多种细菌（如大肠杆菌、产酸克雷伯菌等）都携带了一种大约50kb大小的IncN型质粒，其上面装载着blaIMP-6型碳青霉烯酶基因，这说明耐药基因已在不同物种之间传播[5]。沈等学者研究发觉，OXA-232基因一般位于无法进行接合转移的位置，但可在肠杆菌科细菌里借助外膜囊泡介导基因穿梭[6]，转移到COLKP3型质粒上，更值得关切的是，由于某种质粒说不定同时携带多种耐药性基因，耐药性扩散的风险会进一步升高，孟加拉国的一项研究结果显示，发现了一种同时携带粘菌素耐药基因（MCR-1.1）和碳青霉烯酶基因（如BlaNDM-5）的新型IncHI2杂合质粒[7]。应对细菌不停进化的耐药机制，研究人员正积极进行新型碳青霉烯酶的探索工作，早期研究主要是围绕KPC、NDM、OXA-48等常见酶开展，但这几年也开始着重关注多种碳青霉烯酶共存的问题[8]，2019-2021年期间，郑州大学附属肿瘤医院研究团队，从一位63岁白血病患者的腹腔脓液样本中分离得到一种肺炎克雷伯菌，该细菌同时携有KPC-2和NDM-5。测序结果说明，这个菌株归为ST11-KL47型，对美罗培南、头孢等药物起到的效果有一定的影响，对吡-阿维巴坦和四环素等好几种抗生素均表现出抗药特性[8]，值得警醒的是，该菌株携带了BlaNDM-5以及BlakPC-2两种不同的质粒，且这两种质粒均为新型的重组质粒，在其形成进程里，IS26元件发挥了不可或缺的作用[8]。另有研究尝试借助分析细菌产生的挥发性有机物（VOCs）间接判断其抗药性，3-甲基-1-丁醇说不定是碳青霉烯酶CRKP的生物标记[9]，这有待进一步核实，但也给到了快速筛选耐药菌的一条新思路。把检测碳青霉烯酶产生的CARBANP试验升级为CARBA5试验，可对碳青霉烯酶的种类加以区分[9]，临床微生物实验室也在不断改进检测途径，ElysiaBurke等人的研究证明，患者运用CARBA[5]试验以后，接受有效治疗的时间跟出院时间，较使用CARBA5试验后的时间都缩短了[10]，发现及鉴定新型碳青霉烯酶，需要不断探索新的技术和手段，才能更顺利地应对细菌耐药性挑战。肺炎克雷伯菌外膜孔蛋白对细菌抗药性产生起到关键作用，尤其是奥普克35和奥普克36这两种关键的外膜孔蛋白，这些蛋白好比细菌细胞膜上的“小通路”，让小分子物质（包含抗生素）穿过，作为OMPF家族群体里的一员，OMPK36造就了由三个亚基组成的通道，允诺分子量在600DA以下的物质得以穿过[1]。当这些“小门”出现了变动，若出现数量减少或结构变动时，会造成抗生素进入细菌的难度加大，于是引发耐药性生成，若OMPK36因基因突变引发缩小，就会妨碍像碳青霉烯类抗生素这类大分子药物进入，部分抗碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)菌株中，OMPK36基因产生了插入突变，这会造成蛋白功能的丧失，这样一来明显降低了细菌对抗生素的敏感度[1]，缺失、突变OmPK35也会造成细菌对抗生素的敏感度降低。OmpK35和OmpK36对应的基因突变，同样也是影响抗生素进入细菌、引起耐药的重要因素[11]，这些突变有插入、缺失以及点突变，它们直接引起蛋白结构的改变，或影响蛋白表达的含量，临床分离的耐药肺炎克雷伯菌的菌株里面，OmpK35与OmpK36的mRNA表达量出现降低，外膜孔蛋白的渗透性跟OmpK35（p-value=0.029）和OmpK36（p-value=0.016）的MIC值呈正相关[11]，缺少外膜孔蛋白对细菌对抗生素的敏感性有直接影响。除了蛋白结构的直接变动，外膜孔蛋白表达调控同样不可或缺，OmpK35和OmpK36mRNA表达量的高低会显著影响孔蛋白的渗透性，进而使抗生素的穿透能力下降[11]，肺炎克雷伯菌产生耐药性的一个重要机制乃是外膜孔蛋白基因的突变和表达水平的调控方式。外膜孔蛋白恰似细菌外壳上的“门”，抗生素需借助这些“门”进入细菌里面，若“门”的数量降低或者结构起了改变，那么进入到细菌里面的抗生素数量会下降，细菌就更易形成 抗药性，好比在抗碳青霉烯类药物阴沟肠杆菌(ECC)中，OMPC/OMPF的表达数量显著降低，这让细菌对抗生素敏感性有所降低[12]。在鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）之中，对碳青霉烯类药物的敏感程度也许和CARO基因表达有关[13]，除了蛋白的数量这方面外，外膜孔蛋白的修饰同样会影响与耐药性相关的蛋白的性能，细菌可借助糖基化来修饰孔蛋白，阻拦药物的进入，结果引发抗药，像沙门氏菌可以凭借SseK1蛋白给OMPR调控蛋白加上糖基[14]。OMPR经历糖基化后，和OMPF启动区域的亲和力变低，引起OMPF基因表达减少达[14]，OMPF作为一种主要的外膜孔蛋白，表达变少会让细菌对外界物质的通透能力变差，细菌的抗药水平也会上升，若沙门氏菌的SseK1突变株缺失，会表现出更强的胆盐耐受能力和生物膜形成能力[14],暗示OMPR的糖化或许跟其他细菌的生理过程有联系，以后的研究有待对耐药性更精细的中外膜孔蛋白的作用机制开展进一步探究。肺炎克雷伯菌除了碳青霉烯酶外，为了增强其对抗生物素的抵抗力，还开发了其他多种耐药机制。4.1超量产生AmpC酶AMPC酶超量产生是一种关键机制，归属于头孢菌素酶，能对包含头孢类和β-内酰胺类酶抑制剂的多种β-内酰胺酶抑制物复合物实施水解，是AMPC酶超量分泌，AMPC酶的过量表达与肺炎克雷伯菌对头孢西丁等药的耐药性密切相关[15]，AMPC酶表达调控呈现较复杂状态，中子作用的减弱起到核心作用，临床上针对头孢西丁的耐受表现较强。减弱子坐落于结构基因的上游，凭借形成不同二级结构去调节基因转录的RNA序列，减弱子体可产生终止转录的结构模样，若细胞内存在某一种特定代谢产物，抑制AMPC酶生成，要是减弱子出现突变，引起其调控功能丧失，就会引起AmpC酶产生过度表达，进而提高了细菌的耐药水平。就像亚洲细菌库中发现的产ESBL的K1血清型肺炎克雷伯菌ST23菌株，在头孢噻呋、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等中均未检测出已知的ESBL基因，均显示出耐药特质，其中有两株菌株都检测到了质粒介导的AMPCβ-内酰胺酶基因[16]，其中Acr-1就是Acr-2，Acr-3跟Acr-4一致，Ac-3经鉴定为Ccr-1，ACR-3的对应标识是Bc-1。过量产生AMPC酶常与其他耐药性机制协同起作用，外膜孔蛋白缺失或突变，对抗生素进入细菌细胞形成限制，与AMPC酶过度表达一同发挥功效，造成细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性明显变强，从临床分离的菌株中已观察到这种协同作用，说明在进行肺炎克雷伯菌耐药机制研究时，应综合思索多种因素的相互作用。4.2外排泵系统外排泵系统组合，尤其是像ACRAB-TolC这类，在肺炎克雷伯菌产生耐药性的过程而言有着举足轻重的作用，外排泵恰似细菌体内的“排污阀”，把进入细胞内的抗生素排放出去，阻碍其发挥功效，这样就造成了细菌耐药[17]，对多重耐药的阴沟肠杆菌EcDC64进行acrA基因敲除，即让AcrAB-TolC的主要结构部件失去功能，会大幅降低细菌对多种抗生素的耐受能力[18]。研究探知阴沟肠杆菌AcrAB-TolC泵的结构成分不光是与抗生素耐药有联系，也会影响细菌适应环境的能力和对宿主的致病力[17]，当遭受抗生素施加的压力时，细菌会运作泵外系统，若大肠杆菌受到碳青霉烯类抗生素的刺激，会引起AcrA和AcrB的表达水平增高，特别是亚胺培南会大幅提升AcrB的表达[19]。有一种可抑制AcrAB-TolC表达的蛋白叫AcrR，然而在碳青霉烯类抗生素刺激下，AcrR的表达反倒升高，该现象显示这或许是一种复杂的调控机制[19]，Chowdhury等人所做研究表明，在耐多药大肠杆菌当中，ACRR基因第45位精氨酸转变成半胱氨酸也许会造成ACRAB-TOLC外排泵活性增强，进而增强了细菌的抗药本事[20]。4.3细菌荚膜多糖（KPS）的结构变异细菌荚膜多糖(KPS)的结构变异也对肺炎克雷伯菌的抗药性产生了明显的影响。KPS就像是细菌外层的“铠甲”，让它免受宿主免疫系统的攻击[21]。KPS的增厚、成分复杂化或结构调整，都会阻碍抗生素的穿透，增强细菌的耐药性。具体来说，荚膜多糖可以保护细菌免受补体的杀伤作用，特别是O抗原多糖链，荚膜似乎在耐血清杀伤中作用较小[22]。肺炎克雷伯菌有多种KPS类型，不同类型可能有不同的抗药性。研究发现，K62-DPO30多糖降解酶，由噬菌体来源，可特异性降解K62型肺炎克雷伯菌的KKPS，提高其杀伤血清和中性粒细胞的敏感性[21]。这说明可以通过改变KPS结构来影响细菌的耐药性。另外，KPS还可能对细菌的生物膜生成产生影响，从而对抗药性产生影响。4.4生物膜的形成生物膜的形成成为肺炎克雷伯菌对抗抗菌素的又一重要手段，生物膜是由细菌聚集然后黏附到表面而成，处于自身分泌的胞外高分子包裹下而形成的一种构造，这层“保护膜”阻拦抗生素的渗透，致使药物疗效下降[23]，处于生物膜内的细菌代谢减慢，而大量抗生素所针对的是快速生长的细菌，由此在生物膜里面，抗生素的实际效果会大打折扣。ESBL阳性的菌株形成生物膜的概率更高，同时生物膜的形成会让细菌对抗生素的耐受性得到进一步提升[24]，一项对源自伊拉克伤口分离株所做的研究表明，高达80%的肺炎克雷伯菌菌株拥有很强的生物膜形成能力[25]。这些菌株携带着诸如fi