第10章 电镜技术和超薄切片

病理检验技术

电镜技术和超薄切片高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节概述01第二节超薄切片技术和透射电镜02第三节扫描电镜技术03第四节电镜冷冻制片技术04第五节免疫电镜技术05第六节

电镜细胞化学技术06学习目标知识目标能力目标素质目标掌握超薄切片技术、超薄切片染色技术和制作扫描电子显微镜标本。熟悉电子显微镜冷冻抽样技术、免疫电子显微镜技术和电子显微镜细胞化学技术。了解电子显微镜种类、基本构造和成像原理，以及扫描电子显微镜的工作原理。学会制作超薄切片、独立完成扫描电子显微镜技术、电子显微镜冷冻制样技术和免疫电子显微镜技术。培养学生的团队协作和沟通能力，能够在团队中发挥积极作用并与其他成员有效协作。增强学生的创新意识和独立思考能力，能够提出新的研究思路和方法，为未来的科学研究做出贡献。第一节

概述

一、电镜的种类透射电镜：用来观察细胞内部和断裂面复型膜的平面超微结构。扫描电镜：用来观察细胞表面和断裂面的立体结构。专用电镜：用于满足特殊需要，如超高压电镜、扫描探针电镜、分析电镜、数码电镜等。二、电镜的基本组成电子光学系统：是电镜的核心组成部分，包括电子照明系统、成像系统和观察记录系统。电子照明系统产生和聚焦电子束，成像系统将电子束信息转化为可观察的图像，观察记录系统记录图像。真空系统：由机械真空泵、扩散泵和真空网门组成，与镜筒相连接，排除空气，保持真空状态，避免电子散射。电源系统：包括高压电源、透射电源、发生器、稳流器和调节控制单元，确保电源系统稳定运行。三、电镜的成像原理电镜成像原理类似光镜。电子枪发射电子，经过透镜聚焦后照射样品，与样品原子碰撞散射。散射电子能力不同，透过的电子形成明暗不同的黑白影像。电子影像通过荧光屏转变为可见图像或拍照记录。扫描电镜通过检测器收集样品表面散射电子转变为图像。第二节

超薄切片技术和透射电镜超薄切片技术基本程序：取材

→

前固定

→

漂洗

→

后固定

→

漂洗

→

脱水

→

浸透

→

包埋

→

修块

→

半薄切片

→

光镜定位

→

超薄切片

→

染色

→

电镜观察（一）组织样本超薄切片的制备（二）血液样本超薄切片的制备（三）骨髓样本超薄切片的制备（一）组织样本超薄切片的制备取材前固定漂洗后固定脱水浸透聚合切片捞片和染色在4℃下，准确取样，大小1x1x1mm左右。在0～4℃下，将待检组织块固定于2%～4%戊二醛磷酸钠缓冲液(pH值7.2～7.3）中，浸泡30～90分钟。在4℃下，将经过戊二醛固定的组织块用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗1小时或过夜，其间换液3次。在0～4℃下，将组织块置于四氧化锇磷酸缓冲固定液中浸泡60～120分钟。细织块依次经30%或50%、70%、90%丙酮液各10分钟，最后进入纯丙酮（更换3次，共10分钟），总计40分钟。组织块依次浸入：①纯丙酮：树脂包埋剂（1:1)，室温下1小时。②纯丙酮：树脂包埋剂（1:2），室温下2小时。③纯树脂包埋剂，室温下3小时以上或过夜。将充分浸透的组织块置入装满包埋剂的胶囊中，在37℃烤箱内聚合1小时，然后在60℃烤箱内聚合24小时。用超薄切片机先做半薄切片（1u）或薄切片（3um左右），进行光镜检查定位后再做超薄切片。用镊子夹取一个铜网，将满意的切片捞在铜网的中央，然后用2%醋酸铀和6%柠檬酸铅各染色30分钟。（二）血液样本超薄切片的制备1．取经过1%肝素或5%EDTA抗凝的静脉血2～4mL。2．每分钟1000～1500r离心10分钟。3．尽量吸除离心后的上清液，沿管壁缓慢加入2%～4%戊二醛1～2mL，进行固定。固定2～4小时，使浅黄色层凝结成块。4．取浅黄色层凝块，切成1mm3细条，然后置入缓冲液漂洗。5．按组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、脱水和包埋（注意：应将检材细条平放包埋)。（三）骨髓样本超薄切片的制备1．取经过1%肝素或5%EDTA抗凝的骨髓穿刺物0.5～1mL。2．每分钟1000～1500r离心后取髓粒。3．2%～4%戊二醛磷酸钠缓冲固定液固定2～4小时。

按组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、脱水和包埋。二、超薄切片染色技术（二）柠檬酸铅染色柠檬酸铅是一种染色剂，可与醋酸铀一起使用。该染色方法可以提高切片反差，使图像更清晰。常用的柠檬酸铅染色液配置方法如下：硝酸铅1.33g，枸橼酸钠1.76g，双蒸水30mL。

将溶液倒入容量瓶中，摇动30分钟后加入8mL浓度为1mol/L的NaOH溶液，加双蒸水至50mL，过滤后使用。染色时间为2～5分钟。为防止污染切片，染色过程中应避免与空气接触，可以在染色的培养皿中添加NaOH吸收CO2。（一）醋酸铀染色组织块染色：组织块经固定、脱水至70%乙醇或丙酮后，放入饱和醋酸铀溶液中染色2小时或置于4℃冰箱过夜。超薄切片染色：在清洁的培养皿中放入石蜡片，滴加染液至蜡片上。将载网贴合在切片上，放置在染液上静置10～30分钟。染色完成后，使用双蒸水彻底冲洗干净。第三节

扫描电镜技术一、扫描电镜的工作原理扫描电镜使用电子束在样品表面扫描，收集产生的次级电子，形成电信号送到显像管。电子束不穿过样品，仅在表面激发次级电子。次级电子被闪烁晶体接收，放大并用于调制显像管的电子束强度，改变荧光屏亮度。显像管的偏转线圈与样品表面的电子束同步扫描，显示样品表面形貌图像。最终在荧光屏上看到的是物体表面的立体构象。二、扫描电镜的标本制作取材样品大小一般为(3～5)mmx(1～1.5)mm清洗采用缓冲液、有机溶剂或酶消化等方法清除或清洗附着在样本表面的黏液、血液、组织液和灰尘等。固定使用戊二醛、锇酸等固定剂固定样本，固定时间为1小时脱水采用梯度乙醇或丙酮逐级脱水，从低浓度至高浓度。置换样品脱水至100%乙醇或丙酮后，再用纯丙酮进行置换，时间为15～20分钟，以促使醋酸异戊酯渗透到样本中醋酸异戊酯处理将样本浸泡在醋酸异戊酯中15～30分钟，以促使液态CO2渗透到样本中。观察将样本装入扫描电镜的样本室中进行观察喷涂将样本放置于离子溅射镀膜仪的样本台上进行金属镀膜，以使样品表面导电，有利于形成清晰的图像。排气打开排气阀门，每分钟排气1.0-1.5L，排气时间45-60分钟。步骤6-11在临界点干燥仪中进行，通过以上干燥处理，使样本保持干燥。气化将温度旋钮调至35-40℃，随着温度升高，CO2由液态变为气态，界面消失。当气压接近1.0132×10Pa，持续5分钟后，即可排气。置换在20℃下，使样本中的醋酸异戊酯与CO2充分置换。注入干冰依次打开CO2钢瓶排气阀和仪器进气阀，在0～10℃下，逐渐向样本室注入液态CO2，注入量为样本室容积的80%；关闭进气阀，停止注入。装样将样本从醋酸异戊酯中取出，并放入样本笼中，然后将样本笼放入临界干燥仪的样本室内，在0℃下预冷10～15分钟，以确保液态CO2浸入样本室第四节

电镜冷冻制片技术扫描电镜技术一、快速冷冻固定技术

使用物理方法对生物样品进行瞬间冷冻固定的技术，冷冻速率可达106℃/s。二、冷冻超薄切片技术

通过快速冷冻固定取代化学固定，省去了繁琐的脱水、浸透和包埋步骤，能够在低温下获得清晰的切片图像。三、冷冻蚀刻技术

透射电镜样品制备的一种方法，经过多年的研发与完善，在全球范围内广泛应用，为研究生物膜结构提供了重要支持。三、冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术基本原理：冷冻蚀刻技术通过液氮冷冻样品，使其断裂并展现细胞器；升高温度使冰升华，暴露细胞器的膜结构；喷镀碳-铂在断裂样品表面形成复型膜，展现细胞切面的立体结构；通过透射电镜观察复型膜，可深入了解细胞内部和膜内部的结构。冷冻蚀刻技术制备方法：取材

前固定

清洗

冷冻保护

冷冻固定

断裂

蚀刻

喷镀

腐蚀

捞膜

电镜观察第五节

免疫电镜技术免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法三、免疫电镜技术应注意的问题免疫铁蛋白技术是一项由Singer于1959年首创的技术；最早开展的一种免疫技术；由于其应用的局限性，目前已逐渐被免疫胶体金技术所取代。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法三、免疫电镜技术应注意的问题1.标本用PBS洗涤两次后，用0.5%戊二醛和2%多聚甲醛室温固定30～60分钟。2.PBS漂洗5次，每次20分钟。3.用0.1mol/L甘氨酸漂洗组织5分钟，灭活自由醛基。4.用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液或PBS漂洗组织后，室温下用1%～2%锇酸后固定1小时。5.脱水、包埋。6.超薄切片厚度在50～70nm，捞在镍网上。7.置1%H2O2内10分钟～1小时(视树脂的硬度和切片的厚度而定）。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。8.去离子双蒸水洗3～5次。9.切片用5%正常羊血清孵育15分钟。10.用无钙镁DulbeccoPBS漂洗切片5次。11.孵育于一抗血清滴上，室温1～2小时。12.PBS漂洗5次。13.室温下用适当稀释的胶体金探针孵育30分钟。14.PBS漂洗5次。15.用去离子双蒸水洗净。16.用醋酸铀硝酸铅染色后双蒸水洗净。17.电镜观察。18.对照组可省略一抗或用正常血清、无关抗体代替一抗。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法1.细胞表面抗原标记法（间接法）2.细胞表面抗原标记法（直接法)三、免疫电镜技术应注意的问题（1）细胞用PBS洗2次后，用0.5%戊二醛和2%多聚甲醛室温固定30～60分钟。（2）PBS漂洗3～5次，每次20分钟。（3）用0.1mol/L甘氨酸漂洗组织5分钟，灭活自由醛基。（4）用无钙镁DulbeccoPBS漂洗细胞15分钟，以阻断对一抗的非特异性结合。（5）室温下用适当稀释的第一抗体孵育细胞1～2小时后，用无钙镁DulbeccoPBS漂洗细胞5次，每次5分钟，以洗去未结合的一抗。（6）用适当稀释的胶体金探针在室温下孵育30分钟。（7）用无钙镁DulbeccoPBS漂洗细胞5次，每次5分钟。（8）用2%戊二醛+2%多聚甲醛室温下再次固定细胞1小时。（9）用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，常规脱水、包埋、超薄切片铀铅染色后透射电镜下观察。(10）对照组可省略一抗或用正常血清、无关抗体代替一抗。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法

1.细胞表面抗原标记法（间接法）

2.细胞表面抗原标记法（直接法)三、免疫电镜技术应注意的问题（1）按间接法步骤（1）～（4）操作。（2）用适当稀释的一抗-胶体金复合物在室温下孵育细胞1小时。（3）按间接法步骤（7）～（10）操作。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法1.细胞表面抗原标记法（间接法）2.细胞表面抗原标记法（直接法)三、免疫电镜技术应注意的问题1.处理生物样品时，需同时关注微细结构和抗原活性的保存。固定液可能影响抗原活性，H2O2可能对微细结构造成损伤。在选择固定液和处理方法时需权衡。2.免疫染色实验中，清洗工作必须彻底，建议使用塑料水壶搭配锥形喷水头进行冲洗，喷洗方向与镍网面平行。用滤纸吸干残留水滴时，小心不要触碰到载网本身，可使用剪成三角形的滤纸尖端吸干水分。操作过程中需使用双蒸水，并确保容器专用。第六节

电镜细胞化学技术免疫电镜技术一、基本原理二、基本要求三、基本步骤