《棉花品种纯度鉴定 SSR分子标记法》

1棉花品种纯度鉴定SSR分子标记法本文件界定了棉花(GossypiumsppL.)品种纯度SSR分子标记方法的术语和定义、缩略语,规定了本文件适用于棉花品种纯度鉴定,不适用于转基因品种转化体纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子检验规程第1部分:总则GB/T3543.2农作物种子检验规程第2部分:扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1品种纯度varietalpurity品种在特征特性方面典型一致的程度,用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.2引物primer一条互补结合在模板DNA链上的短单链,能提供3,_OH末端作为DNA合成的起始点,延伸合成模板DNA的互补链。3.3组合引物panel能够组合在一起电泳、标记不同颜色或相同颜色荧光而扩增片段大小不同的一组引物。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates)PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate)SSR:简单序列重复(simplesequencerepeat)Taq酶:耐热DNA聚合酶(Taq_DNApolymerase)5原理棉花的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的SSR的重复次数差异。这种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳,通过检测其扩增产物片段大小而加2以区分。采用经筛选能准确识别品种异常个体指纹的适宜引物,对一定数量送验样品的正常个体数目或百分率进行测算,从而对样品整体的典型一致程度作出评价。6检测方案样品状况、引物、检测平台不同,其检测结果准确度可能有所不同。应依据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的样品数量、引物、检测平台,制订相应的检测方案。在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对检测样品按DNA提取、PCR扩增、电泳、数据分析的程序进行检测。按规定要求填报检测结果,检验报告应注明影响检测结果的关键信息。品种纯度鉴定,必要时应先对该品种进行真实性鉴定。6.2.1送验样品为种子,质量应不低于500g。6.2.2从送验样品中随机分取规定数量的试样,试样的分取符合GB/T3543.2的规定。试样不少于100粒种子,检测样品可以是种子、胚芽、幼苗或叶片。6.3.1异常个体的类型不同,所选引物和数目也有所不同。6.3.2常规种纯度检测可采用10个SSR引物同时检测所有个体,也可以通过混合样品(70个个体以上)试验,筛选混合样品中出现杂合的SSR位点进行检测;杂交种纯度检测需要通过混合样品(70个个体以上)试验,筛选混合样品中出现杂合的SSR位点进行检测。当样品在个别位点存在遗传不稳定状况的,可将该位点剔除;检测样品存在严重遗传不稳定状况的,可终止纯度检测。6.4检测平台6.4.1扩增产物可采用变性PAGE垂直板电泳、毛细管电泳,在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用非变性PAGE垂直板电泳。6.4.2对于检测样品量较大的,可将组织研磨仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、毛细管电泳仪进行组合,提高检测的综合效率。6.4.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检测平台的要求允许对本文件的规定作适当调整。6.5检测条件应在有利于检测有效实施的控制条件下进行,包括但不限于下列条件:a)种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能;b)所有仪器与使用的技术相适应,并已经过定期维护、验证和校准;c)使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材;d)使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品。7试剂和溶液配制7.1.2PCR扩增引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×缓冲液、ddH2O和Mg2+或者Mix反应混合液。37.1.3.1荧光毛细管电泳DNA分析仪专用的丙烯酰胺胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液。7.1.3.2变性PAGE垂直板电泳去离子甲酰胺(Formamide)、溴酚蓝(BromophenolBlue)、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺(Bisacryl_amide)、丙烯酰胺(Acrylamide)、硼酸(BoricAcid)、尿素、亲和硅烷(BindingSilane)、疏水硅烷(RepelSi_lane)、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、7.2溶液配制DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A的规定进行配制,所用试剂均为分析纯。试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求,其中银染溶液的配制可以使用符合三级水的要求。8仪器设备8.1DNA提取高速冷冻离心机、水浴锅或金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研磨仪。8.2PCR扩增PCR扩增仪或水浴PCR扩增装置。8.3电泳8.3.1毛细管电泳DNA分析仪。8.3.2变性PAGE垂直板电泳高压电泳仪、垂直板电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机。8.4其他器具9检测程序9.1引物的合成和筛选9.1.1对于棉花常规种纯度检测,鉴定异交个体、混杂个体,采用本文件推荐的所有引物分析被检个体的基因型;对于棉花杂交种纯度检测,主要鉴定自交个体、异交个体、混杂个体,采用混合DNA样品(70个个体以上)筛选3对以上杂合位点的SSR引物,用筛选的SSR引物分析被检个体的基因型。不同类型异常个体的基因型判断可依据以下规则进行确定:a)对于鉴定自交个体,识别特征为母本具有该等位基因而父本缺失;b)对于鉴定异交个体,识别特征为母本具有该等位基因而父本错误;c)对于鉴定混杂个体,识别特征为父本具有该等位基因而母本错误或父母本都不具有。9.1.2本文件推荐了10对品种纯度鉴定引物(见表1),特殊情况下可以选取附录B表B.1的其他引物或其他适宜的引物进行纯度鉴定,依据6.3和9.1.1的要求,确定适宜的引物或引物组合。表1品种纯度鉴定推荐引物编号引物名称染色体(位置)扩增片段范围,bp引物序列(5,—3,)荧光颜色PC03CCRI003A3173~183F:CACGACGACTCTTCCTCATCACR:ATTGCAGCCACGAAATTGTCAC蓝色PC05CCRI005A5268~276F:GTATGTCCAATCGCCACCCTAGR:GATGACGGTGTTAGGCGGTTC红色4编号引物名称染色体(位置)扩增片段范围,bp引物序列(5′—3′)荧光颜色PC06CCRI006A6F:ACCAGGTCGGTAACGATAGGCR:GCCCAAAGTTGAAGCGGAAAAC绿色CCRI012F:CTGCCTCGACCTACAGTTTGACR:AGTTTTAGGCGGTTTGGGTTTG蓝色CCRI013F:ACCATCCTTGCCGAGTAACCTGR:GTTGATGCCTGGGTCTCAATGC黑色CCRI015F:TTTCACTTGTCCGACCTTACCCR:GGATATGTGTTTGAGCGTGCTG蓝色CCRI017D2F:CGCCACATGACCCCACCATCR:CCCACCGAGTATACAGGACACG黑色CCRI021D5F:AATTGAACCAAGGGCATCATGCR:GAACCTGATTGACGGGTAGCAC绿色PC24CCRI024D7F:ACGAGGGAACATGTGATCTCCTR:TCACTCCAAATCACACGTGCCA蓝色CCRI029F:ACACTGATGTGGCATCGACTAGR:GAATCTGGGCAAACTGTTGTCC红色注:标记荧光颜色仅为示例,可依据不同检测目的自行设定.颜色相同的引物应标记同一种荧光,颜色不同的引物应标记不同荧光.10对引物的扩增产物可以组合10重电泳.9.1.3选定引物后在上游或下游引物的5′端标记与毛细管电泳仪发射和吸收波长相匹配的荧光染料,实现多重电泳.9.2DNA提取DNA提取方法应保证提取的DNA数量和质量符合PCR扩增的要求,DNA无降解,溶液的紫外光吸光度OD260与OD280的比值宜介于1.7~2.0.DNA提取可选9.2.2~9.2.4所列的任何一种方法,也可选用其他符合DNA质量和PCR扩增要求的方法.9.2.2CTAB法取试样个体的种子、幼苗或叶片于2mL离心管,充分研磨,每管加入700μL经65℃预热的CTAB提取液,充分混匀,65℃水浴30min.其间多次轻缓颠倒混匀.每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(体积比为24∶1)混合液,充分混合后静置10min,12000r/min离心10min至分相.吸取上清液转移至新的离心管中,加入0.8倍体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀至絮状DNA成团析出.吸取DNA,转移至盛有70%乙醇的离心管中洗涤1次,无水乙醇再洗涤1次,自然条件下干燥,加入200μL超纯水或TE缓冲液,充分溶解后备用.取试样个体的种子、幼苗或叶片于2.0mL离心管,充分研磨,每管加入700μL的SDS提取液,混匀.65℃水浴30min,其间多次轻缓颠倒混匀.每管加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合液,上下颠倒混匀至不分层,12000r/min离心10min.吸取上清液,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀至絮状DNA成团析出.吸取DNA,转移至盛有70%乙醇的离心管中洗涤1次,无水乙醇再洗涤1次,自然条件下干燥,加入200μL超纯水或TE缓冲液,充分溶解后4℃备用.9.2.4试剂盒法选用适宜SSR标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用.DNA提取方法,按照提供的使用说明进行操作.9.3PCR扩增5对于毛细管电泳检测平台,随着毛细管电泳仪使用频次的增加,其精确度降低.配制反应体系时需要同时设1个空白对照、1个以上参照样品,阴性空白对照、参照样品应与检测样品的个体DNA同板扩增、同板电泳,保证不同上样板和不同批次读取数据的准确性和一致性.对于变性PAGE垂直板电泳,当检测个体数不能在同一板完成电泳时,不同板之间需要设置试样的1个个体或混样作为对照,保证不同上样板读取数据的一致性.9.3.2反应体系PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表2进行配置,各组分可以依据试验条件不同作相应调整.如果表中10×缓冲液中含有MgCl2,则反应体系中不再加MgCl2溶液,用等体积的无菌水替代;如果使用2×TaqMix反应混合液,应保证各组分终浓度一致.表2PCR扩增反应体系反应组分终浓度原浓度体积,μLddHO——13.010×缓冲液(含25mmol/LMgCl)2.0dNTPs0.2mmol/Leach2.5mmol/Leach1.6Taq酶5U/μL0.2正向引物0.1μmol/L20μmol/L0.1反向引物0.1μmol/L20μmol/L0.1DNA6.0ng/μL~22.5ng/μL40ng/μL~150ng/μL总体积注:反应组分的原浓度、体积为参考值.9.3.3反应程序反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、Taq酶、引物等不同而作适当的调整.通常采用下列反应程序:a)预变性:94℃5min;b)扩增:94℃变性45s,60℃退火45s,72℃延伸45s,共32次循环;c)终延伸:72℃10min.形成的扩增产物于4℃保存.9.4扩增产物分离9.4.1荧光毛细管电泳9.4.1.1按照预先确定的组合引物,分别取等体积同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物,充分混匀.从混合液中吸取1μL,加入DNA分析仪专用96孔板孔中.各孔再分别加入0.15μL分子量内标和8.85μL去离子甲酰胺(可根据不同仪器调整用量),在PCR仪上95℃变性5min,冷却10min以上,瞬时离心10s后备用.9.4.1.2打开DNA分析仪,检查仪器工作状态和试剂状态.9.4.1.3将装有样品的96孔上样板放置于样品架基座上,打开数据收集软件,按照DNA分析仪使用手册进行操作.DNA分析仪将自动运行参数,并保存电泳原始数据文件.9.4.2变性PAGE垂直板电泳沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净,再用去离子水、无水乙醇分别擦洗2遍.玻璃板干燥后,将1mL亲和硅烷工作液,均匀涂在无凹槽的玻璃板上;将1mL疏水硅烷工作液,均匀涂在带凹槽的玻璃板上.操作过程中两块玻璃板分别处理,防止相互污染;玻璃板彻底干燥后,将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧,盖上凹槽玻璃板,夹子固定后,用水平仪检测玻璃胶室是否水平;取60mL6%PAGE胶,加入100μL的TEMED和200μL10%过硫酸铵(过硫酸铵的用量与温度成反比,需根据温度调整用量),迅速混匀,将胶灌入玻璃胶室,灌胶过程应防止气泡的出现.待胶室灌满后,在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插6入样品梳,在室温下聚合1h以上,轻轻拔出梳子,用清水洗干净备用.取20μL扩增产物,加入5μL的6×加样缓冲液,混匀.95℃变性5min,4℃冷却10min后备用.9.4.4.3.1将清洗后的胶板安装于电泳槽上,在电泳正极槽(下槽)与负极槽(上槽)各加入800mL的1×TBE缓冲液,拔出样品梳,90W恒功率预电泳10min~20min.用移液器吹吸加样槽,清除气泡与杂质,插入样品梳.每一个加样孔加入5μL变性样品(见9.4.2.2),90W恒功率电泳.9.4.4.3.2电泳的适宜时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见表B.1)加以确定.二甲苯青指示带在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动的位置与230bp扩增产物泳动的位置大致相当.100bp~200bp扩增产物的电泳时间约为35min;200bp~300bp扩增产物电泳时间约为40min,300bp~450bp扩增产物电泳时间约为50min.电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻撬开,凝胶附着在无凹槽的玻璃板上.将粘有凝胶的无凹槽玻璃板胶面向上浸入“固定/染色液”中,轻摇染色槽,使“固定/染色液”均匀覆盖胶板,染色5min~10min.将胶板移入清水中漂洗30s~60s.再移入显影液中,轻摇显影槽,使显影液均匀覆盖胶板,待带型清晰,将胶板移入去离子水中漂洗5min,晾干胶板,放在胶片观察灯上观察,记录结果,用数码相机或凝胶成像系统拍照保存.注:固定液/染色液、双蒸水和显影液的用量,可依据胶板数量和大小调整,以没过胶面为准.9.5数据分析与记录无论是毛细管电泳平台还是变性PAGE垂直板电泳平台,在分析数据时先将遗传不稳定的位点剔除,再进行下一步数据分析.9.5.2毛细管电泳当某个体的峰值片段大小在2个以上SSR位点与其他个体存在差异时,为异常个体.9.5.3垂直板电泳当某个体的谱带在2个以上SSR位点与其他个体存在差异时,为异常个体.9.5.4数据记录将所有个体在被检测位点存在差异或完全相同、数据缺失、无法判定等情形准确记录.10结果计算与表示检测结果使用正常个体数目(检测试样总数减去异常个体数目)占检测试样总数的百分率表示.统计与检测样品正常表现不一致的异常个体数,计数个体数目或计算其百分率,检测结果的容许差距应符合GB/T3543.1的要求.11.1按照GB/T3543.1的检验报告要求,以下列方式填报品种纯度的检测结果:通过编号为的引物,采用方法,检测了个个体,检测出异常个体个,品种纯度为％.11.2属于下列情形之一的,应在检验报告中注明:a)送验样品低于6.2.1规定数量的;b)检测样品遗传不稳定位点的引物编号清单;c)检测采用了其他SSR引物的名称及序列.附录A(资料性)A.1DNA提取A.1.10.5mol/LEDTA溶液称取186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中,加固体NaOH调pH至8.0,加水定容至称取60.55gTris碱溶于适量水中,加HCl调pH至8.0,加水定容至500mL,121℃高压灭菌A.1.35mol/LNaCl溶液称取146.1g固体NaCl,加水定容至500mL,121℃高压灭菌20min。A.1.4CTAB提取液Tris_HCl和40mL的0.5mol/LEDTA,加水定容至1000mL,4℃储存。A.1.5SDS提取液量取100mL的1mol/LTris_HCl、25mL的0.5mol/LEDTA、25mL的5mol/LNaCl和2.5g的SDS混合,加水定容至500mL。A.1.65mol/LKAc称取49.67g的KAc,用水溶解,冰乙酸调节pH至5.2,定容至100mL,121℃高压灭菌20min。A.1.71×TE缓冲液量取5mL的1mol/LTris_HCl和1mL的0.5mol/LEDTA,加HCl调pH至8.0,加水定容至500mL,121℃高压灭菌20min。A.2PCR扩增用超纯水分别配制dATP、dGTP、dCTP、dTTP终浓度为100mmol/L的储存液,分别用0.05mol/L的Tris碱调整pH至7.0。各取1.25mL混合,用超纯水45mL定容至终浓度2.5mmol/Leach的工作液。A.2.2SSR引物用1×TE分别配制