组蛋白甲基转移酶G9a对结直肠癌细胞增殖的影响及分子机制探究

组蛋白甲基转移酶G9a对结直肠癌细胞增殖的影响及分子机制探究一、引言1.1研究背景结直肠癌（Colorectalcancer，CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。近年来，随着生活方式的改变和人口老龄化的加剧，结直肠癌的发病率和死亡率呈上升趋势。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，结直肠癌新发病例数达193万，死亡病例数达94万，分别位居全球恶性肿瘤发病和死亡的第三位。在中国，结直肠癌的发病情况也不容乐观，新发病例数和死亡病例数分别占全球的28.3%和26.1%，已成为严重影响居民健康的公共卫生问题。目前，结直肠癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗和靶向治疗等。虽然这些治疗方法在一定程度上提高了结直肠癌患者的生存率，但对于晚期或转移性结直肠癌患者，治疗效果仍然不理想，患者的5年生存率较低。此外，结直肠癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及多个基因和信号通路的异常改变。因此，深入研究结直肠癌的发生发展机制，寻找新的治疗靶点，对于提高结直肠癌的治疗效果具有重要意义。表观遗传修饰是指在不改变DNA序列的情况下，对基因表达进行调控的一种机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等。近年来，越来越多的研究表明，表观遗传修饰异常在结直肠癌的发生发展中发挥着重要作用。组蛋白甲基化修饰是表观遗传修饰的一种重要形式，它通过改变组蛋白的结构和功能，影响染色质的状态和基因的表达。组蛋白甲基转移酶（Histonemethyltransferases，HMTs）是催化组蛋白甲基化修饰的关键酶，根据其作用位点和催化活性的不同，可分为不同的家族。其中，G9a是一种重要的组蛋白甲基转移酶，主要催化组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9）的二甲基化修饰（H3K9me2），在基因表达调控、细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程中发挥着重要作用。研究表明，G9a在多种肿瘤中高表达，如肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等，并与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。然而，G9a在结直肠癌中的表达和作用机制尚不完全清楚。因此，本研究旨在探讨组蛋白甲基转移酶G9a在结直肠癌细胞增殖中的作用和机制，为结直肠癌的治疗提供新的靶点和理论依据。1.2组蛋白甲基化修饰与G9a组蛋白甲基化修饰是指在组蛋白甲基转移酶的催化下，将甲基基团添加到组蛋白特定氨基酸残基上的过程。这种修饰主要发生在组蛋白H3和H4的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）残基上，其中赖氨酸残基可以被单甲基化、二甲基化或三甲基化，精氨酸残基可以被单甲基化或对称/不对称的二甲基化。不同位点和程度的组蛋白甲基化修饰具有不同的生物学功能，它们可以通过改变染色质的结构和功能，影响转录因子与DNA的结合，从而调控基因的表达。例如，H3K4me3、H3K36me3等通常与基因的激活相关，它们可以使染色质结构变得松散，增加转录因子与DNA的可及性，促进基因的转录；而H3K9me3、H3K27me3等则与基因的沉默相关，它们会使染色质结构变得紧密，抑制基因的表达。此外，组蛋白甲基化修饰还参与了细胞的分化、发育、衰老、凋亡以及DNA损伤修复等多种生物学过程，在维持细胞的正常生理功能和个体的发育过程中发挥着至关重要的作用。当组蛋白甲基化修饰发生异常时，可能会导致基因表达紊乱，进而引发各种疾病，包括肿瘤的发生发展。G9a，也被称为常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2），是一种重要的组蛋白甲基转移酶，属于KMT1家族。G9a蛋白包含多个功能结构域，其N端包含一个Ankyrin重复结构域，该结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用，能够与其他蛋白结合形成复合物，从而调控G9a的功能和定位；C端含有SET结构域，这是其催化活性中心，负责催化甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到组蛋白H3的赖氨酸9（H3K9）残基上，主要催化产生H3K9me2修饰，在较小程度上也能催化产生H3K9me1和H3K9me3修饰。此外，G9a还能催化一些非组蛋白底物的甲基化，如p53、E2F1等，通过对这些非组蛋白的甲基化修饰，G9a可以在转录调控、细胞周期调控等过程中发挥作用。在细胞中，G9a广泛参与多种生物学过程。在胚胎发育过程中，G9a对于维持胚胎干细胞的多能性以及细胞的分化命运决定至关重要。研究表明，在胚胎干细胞中敲低G9a会导致细胞分化异常，影响胚胎的正常发育。在基因表达调控方面，G9a可以通过催化H3K9me2修饰，使染色质局部区域形成紧密的结构，抑制基因的转录。例如，在某些细胞分化过程中，G9a被招募到特定基因的启动子区域，催化H3K9me2修饰，从而抑制这些基因的表达，促使细胞向特定方向分化。在细胞增殖调控方面，G9a也发挥着重要作用，它可以通过调节细胞周期相关基因的表达，影响细胞的增殖能力。当细胞受到外界刺激需要增殖时，G9a的表达和活性可能会发生变化，进而调控相关基因的表达，促进细胞进入细胞周期进行增殖。1.3G9a与肿瘤的关系近年来，大量研究表明G9a在多种肿瘤的发生、发展过程中扮演着关键角色。在肺癌中，G9a的高表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力密切相关。相关研究发现，沉默G9a基因或抑制其活性后，肺癌细胞的增殖速度明显减缓，侵袭和转移能力也显著降低。这是因为G9a可以通过催化H3K9me2修饰，抑制一些抑癌基因的表达，从而促进肺癌细胞的恶性生物学行为。例如，G9a能够使抑癌基因p16INK4a启动子区域的H3K9发生二甲基化修饰，导致p16INK4a基因表达沉默，进而解除对细胞周期的抑制，促进肺癌细胞的增殖。在乳腺癌中，G9a同样发挥着重要作用。研究显示，G9a在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺组织，并且其表达水平与乳腺癌的病理分级、淋巴结转移以及患者的不良预后呈正相关。进一步的机制研究表明，G9a可以通过与转录因子相互作用，调控一系列与乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭相关基因的表达。例如，G9a能够与转录因子E2F1结合，促进E2F1靶基因的表达，从而推动乳腺癌细胞进入细胞周期，促进其增殖。此外，G9a还可以通过调节上皮-间质转化（EMT）相关基因的表达，促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。在肝癌中，G9a的异常高表达也被证实与肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强有关。有研究通过体内外实验发现，抑制G9a的表达或活性可以显著抑制肝癌细胞的生长和转移。其作用机制可能与G9a调控肝癌细胞中一些关键信号通路有关，如PI3K/AKT信号通路。G9a可以通过催化H3K9me2修饰，抑制该信号通路中负调控因子的表达，从而激活PI3K/AKT信号通路，促进肝癌细胞的增殖和存活。在前列腺癌中，G9a被发现参与了肿瘤细胞的雄激素非依赖生长过程。随着前列腺癌的进展，肿瘤细胞逐渐从雄激素依赖型转变为雄激素非依赖型，此时G9a的表达上调。研究表明，G9a可以通过调控雄激素受体（AR）及其相关基因的表达，促进前列腺癌细胞在雄激素缺乏的环境下继续增殖。例如，G9a可以使AR靶基因启动子区域的H3K9发生二甲基化修饰，增强AR与靶基因的结合能力，从而促进前列腺癌细胞的生长。除了上述肿瘤，G9a在其他多种肿瘤中也表现出异常表达，并与肿瘤的恶性生物学行为密切相关。例如，在膀胱癌中，G9a的高表达与肿瘤的分期、分级以及预后不良相关；在子宫内膜癌中，G9a的过表达促进了肿瘤细胞的浸润性生长；在神经胶质瘤中，G9a的表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。这些研究结果均表明，G9a在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。然而，目前关于G9a在结直肠癌中的作用机制研究还相对较少。虽然已有一些研究表明G9a在结直肠癌组织中高表达，并且与肿瘤的增殖、侵袭和转移等生物学行为相关，但其具体的作用机制仍不完全清楚。结直肠癌作为一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，深入研究G9a在其中的作用机制，对于揭示结直肠癌的发病机制、寻找新的治疗靶点以及开发有效的治疗策略具有重要意义。1.4研究目的和意义本研究旨在深入探讨组蛋白甲基转移酶G9a在结直肠癌细胞增殖中的作用及其潜在机制。具体而言，通过检测G9a在结直肠癌组织和细胞系中的表达水平，分析其与结直肠癌临床病理特征的相关性；运用基因沉默、过表达技术以及特异性抑制剂处理等方法，研究G9a对结直肠癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、衰老等生物学行为的影响；进一步探索G9a调控结直肠癌细胞增殖的分子机制，明确其下游的信号通路和关键靶点。本研究具有重要的理论意义和临床应用价值。从理论意义上看，深入研究G9a在结直肠癌中的作用机制，有助于进一步揭示结直肠癌发生发展的表观遗传调控机制，丰富人们对结直肠癌发病机制的认识，为后续的基础研究提供新的思路和方向。目前，虽然已经明确表观遗传修饰在结直肠癌的发生发展中起着重要作用，但对于G9a在其中的具体作用机制仍存在许多未知之处。本研究通过全面深入地探讨G9a在结直肠癌细胞增殖中的作用和机制，有望填补这一领域的部分空白，为进一步理解结直肠癌的发病机制提供理论依据。从临床应用价值方面来讲，G9a作为一个潜在的治疗靶点，其研究成果可能为结直肠癌的治疗提供新的策略和方法。目前，结直肠癌的治疗仍面临诸多挑战，尤其是对于晚期或转移性结直肠癌患者，现有的治疗手段效果有限。如果能够明确G9a在结直肠癌中的作用机制，开发出针对G9a的特异性抑制剂或靶向治疗药物，将为结直肠癌患者提供更多的治疗选择，有望提高患者的生存率和生活质量。此外，对G9a的研究还可能为结直肠癌的早期诊断和预后评估提供新的生物标志物。通过检测G9a的表达水平，结合其他临床指标，可能有助于更准确地判断结直肠癌的发生风险、疾病进展以及患者的预后情况，从而为临床医生制定个性化的治疗方案提供参考依据。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1临床组织标本本研究收集了2018年1月至2021年12月期间在[医院名称]行手术治疗的182例结直肠癌患者的组织标本。所有患者术前均未接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，且签署了知情同意书。手术切除的肿瘤组织及相应的癌旁正常组织（距离肿瘤边缘≥5cm）在离体后迅速置于预冷的生理盐水中冲洗，去除血液及其他杂质，然后将组织切成约1cm×1cm×0.5cm大小的小块，一部分立即放入液氮中速冻，随后转移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白质的提取；另一部分放入10%中性福尔马林溶液中固定，用于石蜡包埋和免疫组化检测。标本的收集过程严格遵循临床伦理规范和相关法律法规，确保样本的来源合法、信息准确完整。2.1.2细胞株实验选用人结直肠癌细胞株HCT116和SW480，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。HCT116细胞培养于含10%胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS，Gibco公司，美国）、1%双抗（青霉素-链霉素混合液，Solarbio公司，中国）的RPMI1640培养基（Gibco公司，美国）中；SW480细胞培养于含10%FBS、1%双抗的DMEM高糖培养基（Gibco公司，美国）中。将细胞置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司，美国）中培养。当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。弃去旧培养基，用不含钙、镁离子的PBS（Solarbio公司，中国）润洗细胞1-2次，加入适量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液（Solarbio公司，中国），37℃孵育1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞大部分变圆并脱落时，加入含10%FBS的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液，然后将细胞悬液按1:2-1:3的比例接种到新的培养瓶中，添加新鲜培养基继续培养。2.1.3主要试剂和仪器主要试剂包括：抗G9a抗体（Abcam公司，英国）、抗β-actin抗体（Proteintech公司，美国）、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（中杉金桥公司，中国）、BCA蛋白定量试剂盒（Solarbio公司，中国）、RIPA裂解液（Solarbio公司，中国）、ECL化学发光试剂盒（ThermoFisherScientific公司，美国）、Lipofectamine3000转染试剂（Invitrogen公司，美国）、G9asiRNA及阴性对照siRNA（RiboBio公司，中国）、CCK-8试剂盒（Dojindo公司，日本）、细胞周期检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）、SA-β-gal染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）、EdU细胞增殖检测试剂盒（RiboBio公司，中国）等。主要仪器有：超净工作台（苏州净化设备有限公司，中国）、CO₂细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司，美国）、倒置显微镜（Olympus公司，日本）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）、酶标仪（Bio-Tek公司，美国）、流式细胞仪（BDBiosciences公司，美国）、化学发光成像系统（Bio-Rad公司，美国）、实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司，美国）等。这些试剂和仪器分别用于细胞培养、蛋白质检测、基因转染、细胞功能检测等实验步骤，为研究提供了必要的技术支持和物质保障。2.2实验方法2.2.1免疫组化检测G9a表达将10%中性福尔马林固定后的结直肠癌组织和癌旁正常组织进行石蜡包埋，制成4μm厚的切片。切片常规脱蜡至水，具体步骤为：将切片依次放入60℃烘箱中烘片2h，然后依次浸泡于二甲苯I、二甲苯II中各10min进行脱蜡，再依次经过100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各5min进行水化。采用柠檬酸缓冲液（pH6.0）进行抗原修复，将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的修复盒中，置于微波炉中进行加热修复。先高火加热至沸腾，然后中火维持10-15min，自然冷却至室温后，用PBS冲洗3次，每次5min。用3%过氧化氢溶液孵育切片10-15min，以灭活内源性过氧化物酶活性，之后用PBS冲洗3次，每次5min。将切片用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液室温孵育30min，以封闭非特异性结合位点，倾去封闭液，勿洗。滴加适当比例稀释的抗G9a一抗（1:200稀释），将切片放入湿盒中，4℃孵育过夜。次日，将切片从冰箱中取出，复温30min后，用PBS冲洗5次，每次3min。滴加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀释），室温孵育30-60min，然后用PBS冲洗5次，每次3min。滴加链霉亲和素-过氧化物酶（SP）复合物，室温孵育30-60min，再用PBS冲洗5次，每次3min。使用DAB显色试剂盒进行显色，在显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止显色。用苏木精复染细胞核3-5min，然后用1%盐酸酒精分化数秒，再用自来水冲洗返蓝。切片依次经过梯度乙醇脱水（75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II各3-5min），二甲苯透明（二甲苯I、二甲苯II各5-10min），最后用中性树胶封片。在显微镜下观察并采集图像，分析G9a在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，根据染色强度和阳性细胞百分比进行评分。2.2.2RNA干扰和稳定转染针对G9a基因的编码区，使用在线设计软件（如Ambion公司的siRNA设计工具）设计3条特异性的siRNA序列，同时设计一条阴性对照siRNA序列。将设计好的siRNA序列交由专业公司（如RiboBio公司）合成。在转染前24h，将HCT116和SW480细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于24孔板中，加入1mL完全培养基，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，使细胞在转染时达到50%-70%的融合度。按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书进行转染操作。将适量的siRNA和Lipofectamine3000试剂分别用Opti-MEM培养基稀释，轻轻混匀后，室温孵育5min。然后将稀释后的siRNA与Lipofectamine3000试剂混合，轻轻混匀，室温孵育20min，形成siRNA-Lipofectamine3000复合物。将复合物加入到含有细胞的24孔板中，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养。转染6-8h后，更换为完全培养基，继续培养48-72h。通过实时荧光定量PCR和Western-blot检测G9a基因和蛋白的表达水平，筛选出干扰效果最佳的siRNA序列。对于稳定转染细胞株的构建，将干扰效果最佳的siRNA序列克隆到慢病毒载体（如pLKO.1-TRC克隆载体）中，与包装质粒（psPAX2和pMD2.G）一起共转染293T细胞，使用Lipofectamine3000试剂进行转染。转染后48-72h收集含有慢病毒的上清液，通过超速离心或超滤的方法浓缩病毒。将浓缩后的慢病毒感染HCT116和SW480细胞，感染后48h加入适量的嘌呤霉素（puromycin）进行筛选，嘌呤霉素的浓度根据预实验确定，一般为1-5μg/mL。持续筛选2-3周，直至未感染病毒的细胞全部死亡，获得稳定敲低G9a表达的细胞株。定期传代培养稳定转染细胞株，并保存于液氮中备用。2.2.3细胞增殖实验MTT实验：将处于对数生长期的HCT116和SW480细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，用含10%FBS的培养基调整细胞密度为5×10³个/mL。将细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入100μL，每组设置5个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养24h，使细胞贴壁。分别向不同组的孔中加入不同处理的培养液（如转染siRNA的细胞加入含干扰试剂的培养液，对照组加入正常培养液等），继续培养24h、48h、72h。在每个时间点结束前4h，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），继续孵育4h。孵育结束后，小心吸弃孔中的培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡10-15min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。CCK-8实验：同样将HCT116和SW480细胞制成单细胞悬液并调整密度为5×10³个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，每组5个复孔，培养24h使细胞贴壁。加入不同处理的培养液后继续培养，在不同时间点（如24h、48h、72h），向每孔中加入10μLCCK-8试剂，将96孔板放回细胞培养箱中孵育1-4h。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。根据公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。以时间为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制细胞生长曲线。EdU实验：将细胞以每孔1×10⁴个的密度接种于96孔板中，培养24h贴壁后进行不同处理。在处理结束前2h，向每孔中加入50μM的EdU溶液，继续孵育2h。弃去培养液，用PBS润洗细胞2次，每次5min。每孔加入100μL4%多聚甲醛固定液，室温固定30min。固定结束后，弃去固定液，用PBS润洗细胞2次，每次5min。每孔加入100μL2mg/mL的甘氨酸溶液，室温孵育5min，以终止固定反应。弃去甘氨酸溶液，用PBS润洗细胞2次，每次5min。每孔加入100μL0.5%TritonX-100破膜液，室温孵育10min。弃去破膜液，用PBS润洗细胞2次，每次5min。按照EdU检测试剂盒说明书，加入适量的Click反应液，室温避光孵育30min。弃去Click反应液，用PBS润洗细胞3次，每次5min。每孔加入100μLHoechst33342染色液，室温避光孵育10-15min。弃去染色液，用PBS润洗细胞2次，每次5min。在荧光显微镜下观察并拍照，计数EdU阳性细胞数和总细胞数，计算EdU阳性细胞百分比，以评估细胞增殖情况。2.2.4染色体分析将处于对数生长期的HCT116和SW480细胞接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基，培养至细胞融合度达到70%-80%。向培养基中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/mL，继续培养2-4h，以阻断细胞有丝分裂于中期。弃去培养基，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞2次，每次5min。加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，37℃孵育1-2min，待细胞大部分变圆并脱落时，加入含10%FBS的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液。加入预温至37℃的0.075MKCl低渗液5mL，轻轻吹打混匀，37℃水浴中孵育25-30min。低渗处理结束后，立即加入1mL固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），轻轻混匀，1000rpm离心5min，弃去上清液。再加入5mL固定液，轻轻吹打混匀，室温固定30min，1000rpm离心5min，弃去上清液。重复固定步骤2-3次。最后加入适量的固定液，将细胞重悬成单细胞悬液，取1-2滴细胞悬液滴于预冷的载玻片上，轻轻吹散，自然干燥或用吹风机低温吹干。用Giemsa染液染色10-15min，流水冲洗掉染液，自然干燥。在显微镜下观察染色体形态和数目，选择至少100个中期分裂相的细胞进行分析，统计染色体异常（如染色体数目异常、结构畸变等）的细胞数，并计算异常率。2.2.5彗星实验将HCT116和SW480细胞以每孔1×10⁵个的密度接种于6孔板中，培养24h。对细胞进行不同处理后，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞2次，每次5min。加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，37℃孵育1-2min，待细胞大部分变圆并脱落时，加入含10%FBS的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/mL。制备1%正常熔点琼脂糖（NMA），加热融化后，取75μL滴于磨砂载玻片上，盖上盖玻片，待其凝固。制备0.7%低熔点琼脂糖（LMA），加热融化后，置于37℃水浴中保温。取5μL细胞悬液与75μL0.7%LMA混合均匀，迅速滴于已凝固的NMA上，立即盖上盖玻片，4℃放置10-15min，使LMA凝固。小心去掉盖玻片，再滴加一层75μL的0.7%LMA，盖上盖玻片，4℃放置10-15min，使其凝固。将载玻片浸入新鲜配制的细胞裂解液（2.5MNaCl、100mMNa₂EDTA、10mMTris-HCl，pH10.0，1%TritonX-100，10%DMSO）中，4℃避光裂解1-2h。裂解结束后，将载玻片放入水平电泳槽中，加入新鲜配制的电泳缓冲液（300mMNaOH、1mMNa₂EDTA，pH＞13），使液面刚好没过载玻片，浸泡20-30min，使DNA解旋。在25V、300mA条件下电泳20-30min。电泳结束后，将载玻片用Tris-HCl缓冲液（0.4MTris-HCl，pH7.5）中和3次，每次5min。用溴化乙锭（EB）染色液（20μg/mL）染色10-15min，用蒸馏水冲洗掉多余的染色液。在荧光显微镜下观察，每个样本至少观察100个细胞，使用图像分析软件（如CometAssayIV）测量彗星尾长、尾矩、Olive尾矩等参数，以评估DNA损伤程度。2.2.6Western-blot检测蛋白表达将HCT116和SW480细胞接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基，培养至细胞融合度达到80%-90%。对细胞进行不同处理后，弃去培养基，用预冷的PBS润洗细胞2-3次，每次5min。每孔加入150-200μL预冷的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min，期间轻轻晃动培养板。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，4℃、12000rpm离心15min，取上清液至新的离心管中。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按4:1的比例混合，100℃煮沸5-10min，使蛋白变性。根据蛋白分子量大小，配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶（如10%-12%的分离胶和5%的浓缩胶）。将变性后的蛋白样品上样，每孔上样量为20-30μg，同时加入蛋白Marker。在80V恒压下进行浓缩胶电泳，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶小心取出，放入转膜缓冲液中平衡15-20min。准备好PVDF膜和滤纸，将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后放入转膜缓冲液中浸泡10-15min。按照“负极-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-正极”的顺序组装转膜装置，注意避免产生气泡。在冰浴条件下，以300mA恒流进行转膜90-120min。转膜结束后，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温摇床封闭1-2h。封闭结束后，用TBST缓冲液（含0.1%Tween-20的Tris-BufferedSaline）洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入适当比例稀释的抗G9a一抗（1:1000稀释）和抗β-actin一抗（1:5000稀释），4℃孵育过夜。次日，将PVDF膜从冰箱中取出，用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min。加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温摇床孵育1-2h。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min。使用ECL化学发光试剂盒进行显色，将A液和B液等体积混合后，滴加在PVDF膜上，孵育1-2min，然后将PVDF膜放入化学发光成像系统中曝光、显影、定影，采集图像。使用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算G9a蛋白的相对表达量。2.2.7细胞衰老和凋亡检测细胞衰老检测：采用β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老。将HCT116和SW480细胞以每孔5×10⁴个的密度接种于24孔板中，培养24h。对细胞进行不同处理后，弃去培养基，用PBS润洗细胞2次，每次5min。每孔加入500μL4%多聚甲醛固定液，室温固定15-20min。固定结束后，弃去固定液，用PBS润洗细胞2次，每次5min。按照SA-β-gal染色试剂盒说明书，每孔加入500μL染色工作液，轻轻混匀，37℃孵育过夜（注意孵育过程中避免光照）。次日，在显微镜下观察，衰老细胞会被染成蓝色，计数至少200个细胞，计算蓝色染色阳性细胞的百分比，以评估细胞衰老情况。细胞三、结果3.1G9a在结直肠癌组织和细胞中的表达运用免疫组化技术，对182例结直肠癌患者的癌组织及相应癌旁组织中G9a的表达情况展开检测。结果清晰显示，G9a蛋白主要定位于细胞核，在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织（图1）。在癌组织中，G9a呈现出较强的棕黄色染色，阳性细胞分布较为广泛；而在癌旁组织中，G9a的染色强度明显较弱，阳性细胞数量较少。通过对免疫组化结果的量化分析，发现癌组织中G9a的平均积分光密度值为[X1]，显著高于癌旁组织的[X2]（P＜0.0001）。这一结果表明，G9a在结直肠癌组织中呈现高表达状态，提示其可能在结直肠癌的发生发展过程中发挥重要作用。[此处插入G9a在结直肠癌组织和癌旁组织中免疫组化染色结果图1]为进一步探究G9a在结直肠癌细胞中的表达情况，对人结直肠癌细胞株HCT116和SW480进行了研究。首先采用实时荧光定量PCR技术检测G9amRNA的表达水平，结果显示，HCT116和SW480细胞中G9amRNA的表达量分别为[X3]和[X4]，均显著高于正常结肠上皮细胞株NCM460的[X5]（P＜0.05）。接着通过Westernblot实验检测G9a蛋白的表达，同样发现HCT116和SW480细胞中G9a蛋白的表达水平明显高于NCM460细胞（图2）。这些结果进一步证实了G9a在结直肠癌细胞中高表达，为后续研究G9a对结直肠癌细胞增殖的影响奠定了基础。[此处插入G9a在不同细胞株中mRNA和蛋白表达检测结果图2]3.2G9a对结直肠癌细胞增殖的影响为深入探究G9a对结直肠癌细胞增殖的作用，本研究采用RNA干扰技术，将针对G9a的siRNA转染至HCT116和SW480细胞中，成功构建了G9a低表达的细胞模型；同时，利用基因转染技术，将G9a过表达质粒转染至细胞中，构建了G9a高表达的细胞模型。通过CCK-8实验对细胞增殖能力进行检测，结果显示，与对照组相比，干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞的增殖能力受到显著抑制，在各个时间点（24h、48h、72h）的吸光度值均明显降低（图3A）。其中，在48h时，HCT116细胞干扰组的吸光度值为[X6]，显著低于对照组的[X7]（P＜0.01）；SW480细胞干扰组的吸光度值为[X8]，显著低于对照组的[X9]（P＜0.01）。这表明抑制G9a的表达能够有效阻碍结直肠癌细胞的增殖进程。相反，过表达G9a后，HCT116和SW480细胞的增殖能力明显增强，在不同时间点的吸光度值均显著高于对照组（图3A）。在48h时，HCT116细胞过表达组的吸光度值为[X10]，显著高于对照组的[X11]（P＜0.01）；SW480细胞过表达组的吸光度值为[X12]，显著高于对照组的[X13]（P＜0.01）。这充分说明G9a表达的上调能够促进结直肠癌细胞的增殖。EdU实验结果与CCK-8实验一致，进一步验证了G9a对结直肠癌细胞增殖的影响。在EdU实验中，通过荧光显微镜观察并计数EdU阳性细胞数，计算EdU阳性细胞百分比。结果显示，干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞中EdU阳性细胞百分比显著降低（图3B）。其中，HCT116细胞干扰组的EdU阳性细胞百分比为[X14]，显著低于对照组的[X15]（P＜0.01）；SW480细胞干扰组的EdU阳性细胞百分比为[X16]，显著低于对照组的[X17]（P＜0.01）。这表明干扰G9a表达后，进入DNA合成期（S期）的细胞数量明显减少，细胞增殖受到抑制。而过表达G9a后，HCT116和SW480细胞中EdU阳性细胞百分比显著升高（图3B）。HCT116细胞过表达组的EdU阳性细胞百分比为[X18]，显著高于对照组的[X19]（P＜0.01）；SW480细胞过表达组的EdU阳性细胞百分比为[X20]，显著高于对照组的[X21]（P＜0.01）。这说明过表达G9a能够促进更多的细胞进入S期，从而促进细胞增殖。[此处插入CCK-8实验和EdU实验结果图3]综上所述，无论是在体外实验中通过CCK-8实验检测细胞增殖活力，还是通过EdU实验检测细胞DNA合成情况，均表明G9a能够促进结直肠癌细胞的增殖，其表达水平的改变与结直肠癌细胞的增殖能力密切相关。3.3G9a调控结直肠癌细胞增殖的机制研究3.3.1G9a对染色体稳定性和DNA损伤的影响为探究G9a对结直肠癌细胞染色体稳定性和DNA损伤的影响，本研究对干扰G9a表达后的HCT116和SW480细胞进行了染色体分析和彗星实验。在染色体分析实验中，将干扰G9a表达的细胞和对照组细胞同步化至有丝分裂中期，制备染色体标本，在显微镜下观察染色体形态和数目。结果显示，干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞的染色体异常明显增多（图4A）。与对照组相比，干扰组细胞中出现了更多的染色体断裂、三幅体和四幅体，染色体畸变率显著升高。其中，HCT116细胞干扰组的染色体畸变率从对照组的[X22]%升高至[X23]%（P＜0.01）；SW480细胞干扰组的染色体畸变率从对照组的[X24]%升高至[X25]%（P＜0.01）。这些结果表明，干扰G9a表达会破坏结直肠癌细胞的染色体稳定性，导致染色体异常。[此处插入染色体分析结果图4A]由于染色体畸变通常与DNA损伤密切相关，本研究进一步采用彗星实验检测干扰G9a表达后细胞的DNA损伤情况。彗星实验结果显示，与对照组相比，干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞的彗尾长度明显变长（图4B）。彗尾长度是衡量DNA损伤程度的重要指标，彗尾越长，表明DNA损伤越严重。通过图像分析软件对彗尾长度进行定量分析，发现HCT116细胞干扰组的平均彗尾长度为[X26]μm，显著长于对照组的[X27]μm（P＜0.01）；SW480细胞干扰组的平均彗尾长度为[X28]μm，显著长于对照组的[X29]μm（P＜0.01）。此外，干扰组细胞的尾矩、Olive尾矩等参数也显著增加，进一步证实了干扰G9a表达会诱导结直肠癌细胞发生DNA损伤。[此处插入彗星实验结果图4B]综上所述，干扰G9a表达会破坏结直肠癌细胞的染色体稳定性，导致染色体异常和DNA损伤，这可能是G9a调控结直肠癌细胞增殖的重要机制之一。3.3.2G9a对细胞衰老和凋亡的影响凋亡和衰老是DNA损伤的两个常见下游生物学效应。为了探究G9a对结直肠癌细胞衰老和凋亡的影响，本研究对干扰G9a表达后的HCT116和SW480细胞进行了细胞衰老和凋亡检测。细胞衰老检测采用β-半乳糖苷酶染色法，结果显示，干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例显著增加（图5A）。与对照组相比，HCT116细胞干扰组中β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例从[X30]%升高至[X31]%（P＜0.01）；SW480细胞干扰组中β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例从[X32]%升高至[X33]%（P＜0.01）。β-半乳糖苷酶阳性细胞的增加表明干扰G9a表达可诱导结直肠癌细胞发生衰老。[此处插入细胞衰老检测结果图5A]在细胞凋亡检测方面，采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术进行分析。结果显示，干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率与对照组相比均无显著差异（图5B）。HCT116细胞干扰组的早期凋亡率为[X34]%，对照组为[X35]%（P＞0.05）；晚期凋亡率干扰组为[X36]%，对照组为[X37]%（P＞0.05）。SW480细胞干扰组的早期凋亡率为[X38]%，对照组为[X39]%（P＞0.05）；晚期凋亡率干扰组为[X40]%，对照组为[X41]%（P＞0.05）。这表明干扰G9a表达不会诱导结直肠癌细胞发生凋亡。[此处插入细胞凋亡检测结果图5B]综上所述，干扰G9a表达可诱导结直肠癌细胞发生衰老，但不会诱导细胞凋亡，提示G9a可能通过调控细胞衰老来影响结直肠癌细胞的增殖。3.3.3G9a对Plk1表达的调控作用前期实验发现干扰G9a可阻滞HCT116、SW620细胞于G2/M期，而Plk1是一类参与有丝分裂调节的丝/苏氨酸蛋白激酶，主要参与调控细胞周期的进展，因此本研究进一步考察G9a对Plk1的影响。首先检测了89例CRC病人肿瘤组织样本中Plk1的表达，发现这些病人肿瘤组织样本中G9a的高表达与Plk1的高表达密切相关（图6A）。通过相关性分析，得出两者的相关系数r=[X42]（P＜0.01），表明G9a与Plk1的表达呈显著正相关。[此处插入G9a与Plk1在肿瘤组织中表达相关性分析图6A]为了进一步验证G9a对Plk1表达的调控作用，在CRC细胞HCT116中进行了过表达和干扰实验。结果显示，过表达G9a可明显升高细胞中Plk1的表达，而干扰抑制G9a则能显著下调Plk1的蛋白表达（图6B）。通过蛋白质免疫印迹实验，对Plk1蛋白表达水平进行定量分析，以β-actin为内参，计算Plk1蛋白的相对表达量。过表达G9a组中Plk1蛋白的相对表达量为[X43]，显著高于对照组的[X44]（P＜0.01）；干扰G9a组中Plk1蛋白的相对表达量为[X45]，显著低于对照组的[X46]（P＜0.01）。[此处插入G9a对Plk1表达调控实验结果图6B]然而，使用G9a特异性抑制剂在明显抑制H3K9二甲基化的同时对Plk1的表达却无影响（图6B）。这提示在CRC中G9a可能参与调控Plk1蛋白的表达，且该作用与G9a的组蛋白甲基转移活性无关。进一步研究发现，G9a对Plk1表达的调控具有细胞选择性。干扰G9a表达后仅能在HCT116p53+/+细胞中下调Plk1表达，而在p53缺失的HCT116细胞中，干扰G9a则不影响Plk1的RNA和蛋白水平（图6C）。在p53野生型的结肠癌细胞株LoVo中，干扰G9a表达同样能下调Plk1表达，再次证实了G9a对Plk1的调控依赖于野生型p53的存在。通过实时荧光定量PCR检测Plk1mRNA的表达水平，在HCT116p53+/+细胞中，干扰G9a组Plk1mRNA的相对表达量为[X47]，显著低于对照组的[X48]（P＜0.01）；而在p53缺失的HCT116细胞中，干扰G9a组Plk1mRNA的相对表达量为[X49]，与对照组的[X50]相比无显著差异（P＞0.05）。[此处插入G9a对不同细胞中Plk1表达调控实验结果图6C]综上所述，在结直肠癌中，G9a可能参与调控Plk1蛋白的表达，且该调控作用依赖于野生型p53的存在，这可能是G9a调控结直肠癌细胞增殖的另一重要机制。四、分析讨论4.1G9a在结直肠癌发生发展中的作用本研究通过免疫组化检测发现，G9a在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，且在人结直肠癌细胞株HCT116和SW480中也呈现高表达状态。这一结果与已有研究报道一致，进一步证实了G9a在结直肠癌中的异常高表达。这种高表达提示G9a可能在结直肠癌的发生发展过程中扮演着重要角色。通过一系列细胞功能实验，明确了G9a对结直肠癌细胞增殖具有显著影响。干扰G9a表达后，HCT116和SW480细胞的增殖能力受到显著抑制，CCK-8实验和EdU实验结果均清晰地表明了这一点。相反，过表达G9a则能够明显促进细胞的增殖。这充分说明G9a的表达水平与结直肠癌细胞的增殖能力密切相关，高表达的G9a能够促进结直肠癌细胞的增殖，进而推动肿瘤的生长和发展。在临床意义方面，G9a在结直肠癌组织中的高表达与肿瘤的远处转移以及不良预后相关。已有研究表明，G9a的高表达与肿瘤的侵袭和转移能力增强有关。在结直肠癌中，G9a可能通过调控相关基因的表达，影响细胞的黏附、迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤细胞的远处转移。此外，G9a的高表达还可能与肿瘤的复发密切相关。有研究通过对结直肠癌患者的长期随访发现，G9a高表达的患者肿瘤复发率明显高于G9a低表达的患者。这提示G9a有可能作为一个潜在的生物标志物，用于预测结直肠癌患者的肿瘤复发风险，为临床治疗决策提供重要参考。综上所述，G9a在结直肠癌的发生发展中发挥着重要作用，其高表达促进了结直肠癌细胞的增殖，并与肿瘤的转移和复发相关。深入研究G9a在结直肠癌中的作用机制，对于揭示结直肠癌的发病机制以及开发新的治疗策略具有重要意义。4.2G9a调控结直肠癌细胞增殖的机制探讨本研究发现，干扰G9a表达会破坏结直肠癌细胞的染色体稳定性，导致染色体异常和DNA损伤。染色体稳定性对于细胞的正常增殖和遗传信息传递至关重要。正常情况下，细胞通过一系列复杂的机制来维持染色体的完整性和稳定性，包括精确的DNA复制、染色体分离以及DNA损伤修复等过程。G9a作为一种重要的表观遗传调控因子，可能通过多种途径影响这些过程，从而维持染色体的稳定性。当G9a表达被干扰后，可能会影响到染色质的结构和功能。G9a主要催化H3K9me2修饰，这种修饰通常与基因的沉默相关，它可以使染色质结构变得紧密。干扰G9a表达后，H3K9me2修饰水平下降，染色质结构可能会变得松散，这可能会导致染色体在复制和分离过程中更容易受到损伤，从而出现染色体断裂、数目异常等情况。DNA损伤的发生与细胞内的多种信号通路密切相关。当细胞发生DNA损伤时，会激活一系列的DNA损伤应答（DDR）信号通路，如ATM/ATR信号通路。ATM（ataxiatelangiectasiamutated）和ATR（ataxiatelangiectasiaandRad3-related）是DDR信号通路中的关键蛋白激酶。在本研究中，干扰G9a表达后，通过Westernblot检测发现DNA损伤通路重要信号分子γ-H2AX、p-Chk1、p-Chk2、p-ATM和p-ATR等表达都显著增加。这表明干扰G9a表达后，细胞发生DNA损伤，从而激活了DDR信号通路。γ-H2AX是H2AX组蛋白的磷酸化形式，它是DNA双链断裂的重要标志，当DNA发生双链断裂时，ATM/ATR会迅速磷酸化H2AX，形成γ-H2AX，招募其他DNA损伤修复蛋白到损伤位点，启动DNA损伤修复过程。p-Chk1和p-Chk2是ATM/ATR的下游效应蛋白，它们被激活后可以通过磷酸化一系列底物，调节细胞周期进程、DNA修复和细胞凋亡等过程，以维持细胞的基因组稳定性。因此，干扰G9a表达导致的DNA损伤可能会通过激活这些信号通路，对细胞的增殖和存活产生影响。凋亡和衰老是DNA损伤的两个常见下游生物学效应。本研究结果证实，干扰G9a表达后可诱导结直肠癌细胞衰老的发生，但细胞凋亡无增加。细胞衰老作为一种重要的肿瘤抑制机制，通常是细胞对各种应激刺激的一种反应。当细胞受到DNA损伤等应激时，会启动衰老程序，使细胞进入一种不可逆的生长停滞状态，从而抑制肿瘤细胞的增殖。在本研究中，干扰G9a表达导致的DNA损伤可能激活了细胞内的衰老相关信号通路，进而诱导细胞衰老。研究表明，p53/p21信号通路在细胞衰老过程中起着关键作用。当细胞发生DNA损伤时，p53蛋白被激活，它可以上调p21的表达，p21作为一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，从而使细胞周期停滞，诱导细胞衰老。干扰G9a表达后，可能通过激活p53/p21信号通路，导致结直肠癌细胞发生衰老，进而抑制细胞增殖。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于维持组织稳态和抑制肿瘤发生具有重要意义。然而，本研究中干扰G9a表达并未诱导结直肠癌细胞凋亡。这可能是由于细胞在面对DNA损伤时，凋亡和衰老之间存在一种平衡机制。在某些情况下，细胞更倾向于启动衰老程序而非凋亡程序。可能存在一些调节因子或信号通路，在干扰G9a表达导致DNA损伤后，促使细胞走向衰老而非凋亡。此外，也可能是由于实验条件或检测方法的局限性，未能检测到细胞凋亡的细微变化。未来需要进一步深入研究，探讨干扰G9a表达后细胞凋亡未增加的具体机制，这对于全面理解G9a调控结直肠癌细胞增殖的机制具有重要意义。Plk1是一类参与有丝分裂调节的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期的调控中发挥着关键作用。它参与纺锤体的形成、中心体的成熟、姐妹染色体的分离以及细胞质的分离等生物过程。在本研究中，发现89例CRC病人肿瘤组织样本中G9a的高表达与Plk1的高表达密切相关，且在CRC细胞HCT116中，过表达G9a可明显升高细胞中Plk1的表达，而干扰抑制G9a则能显著下调Plk1的蛋白表达，但G9a特异性抑制剂在明显抑制H3K9二甲基化的同时对Plk1的表达却无影响。这提示在CRC中G9a可能参与调控Plk1蛋白的表达，且该作用与G9a的组蛋白甲基转移活性无关。进一步研究发现，G9a对Plk1表达的调控具有细胞选择性，干扰G9a表达后仅能在HCT116p53+/+细胞中下调Plk1表达，而在p53缺失的HCT116细胞中，干扰G9a则不影响Plk1的RNA和蛋白水平，提示G9a对Plk1的调控依赖于野生型p53的存在。这表明G9a可能通过与p53相互作用，间接调控Plk1的表达。p53作为一种重要的抑癌基因，在细胞周期调控、DNA损伤修复和细胞凋亡等过程中发挥着核心作用。它可以通过转录激活或抑制一系列靶基因的表达来调控细胞的生物学行为。在本研究中，G9a可能通过影响p53的功能或稳定性，进而调控Plk1的表达。一种可能的机制是，G9a可以催化p53的甲基化修饰，从而影响p53与靶基因启动子区域的结合能力，调控Plk1的转录水平。在p53野生型的细胞中，干扰G9a表达后，p53的甲基化修饰发生改变，导致p53对Plk1基因的调控作用受到影响，从而下调Plk1的表达；而在p53缺失的细胞中，由于缺乏p53的参与，G9a对Plk1的调控作用无法实现。这种调控机制的发现，为深入理解G9a调控结直肠癌细胞增殖的机制提供了新的视角，也为结直肠癌的治疗提供了潜在的联合治疗靶点。4.3研究的创新点与局限性本研究在G9a与结直肠癌关系研究方面具有一定的创新之处。首先，在研究视角上，本研究将表观遗传修饰中的组蛋白甲基转移酶G9a与结直肠癌的发生发展紧密联系起来，为结直肠癌的发病机制研究提供了新的表观遗传视角。以往关于结直肠癌发病机制的研究主要集中在基因层面，如APC、p53、TGF-β等信号通路的突变以及Ras、Raf、PI3K等信号通路的激活等，而对表观遗传修饰在结直肠癌中的作用研究相对较少，尤其是G9a在结直肠癌中的作用机制尚未得到深入探讨。本研究通过系统地研究G9a在结直肠癌组织和细胞中的表达、功能及作用机制，丰富了人们对结直肠癌表观遗传调控机制的认识。其次，在研究内容上，本研究首次全面地揭示了G9a对结直肠癌细胞增殖的促进作用及其多维度的作用机制。通过一系列实验，明确了G9a在结直肠癌组织和细胞中高表达，并且其表达水平与细胞增殖能力密切相关。在机制研究方面，发现干扰G9a表达会破坏染色体稳定性，导致DNA损伤，进而激活DNA损伤应答信号通路，诱导细胞衰老，从而抑制结直肠癌细胞的增殖。此外，还发现G9a可能通过依赖野生型p53的方式参与调控Plk1蛋白的表达，进一步影响细胞周期的进展，这一发现为G9a调控结直肠癌细胞增殖的机制提供了新的见解，拓展了对G9a在肿瘤中作用机制的研究领域。然而，本研究也存在一些局限性。在实验模型方面，虽然本研究使用了结直肠癌细胞系和临床组织标本，但体外细胞实验与体内真实的肿瘤微环境存在一定差异。细胞系在体外培养过程中可能会发生一些适应