《微生物检验技术培训课程》课件-常用真菌检验方法

常用真菌检验方法COMMONMETHODSOFFUNGALEXAMINATION细菌鉴定程序（临床工作流程）流程1标本的采集流程2标本的接种与培养流程3细菌的鉴定流程4药物敏感试验流程5发出报告真菌鉴定程序（临床工作流程）流程1标本的采集流程2直接镜检检测抗原分离培养流程3真菌的鉴定流程4药物敏感试验流程5发出报告常用真菌检验方法浅部：取病变部位皮屑、毛发、指甲等。深部：痰、血液、脑脊液等标本。注意事项：无菌操作及时送检，一般不超过2h，以免标本变质污染。在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间再采集。一、标本的采集采样要求标本取样要求取样量毛发取脆而无光泽、病损处毛发多在366nm灯照射下发荧光皮屑用75%乙醇消毒后刮取-口腔黏膜无菌棉拭子-脓液及渗出物注射器抽取-痰清晨收集血液或体液-抗凝血5~10ml脑脊液-5ml胸腔积液-不少于20ml阴道及宫颈分泌物无菌棉拭子-活组织或尸检标本--二、检验方法（一）直接镜检法❶不染色标本检查：检查有无菌丝和（或）孢子10%KOH微加热，软化标本，低倍或高倍镜检。图14-9紫色毛癣菌病发标本直接压片镜检图14-1红色毛癣菌感染部位皮屑标本直接镜检（KOH处理）二、检验方法❷染色标本检查：革兰氏染色：各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。乳酸酚棉蓝染色。荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。嗜银染色（GMS）：染成黑色。二、检验方法❷染色标本检查：粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。PAS：高碘酸-希夫染色墨汁染色法：观察菌丝，孢子形态、产生方式。HE：苏木精-伊红染色图14-17石膏样小跑子菌纯培养的镜下形态（乳酸酚棉蓝染色）图14-18石膏样小抱子菌在SDA上的菌落特征（7~10d）二、检验方法（二）分离培养法培养基：无选择性培养基选择性培养基鉴别培养基二、检验方法培养方法：平皿培养法：沙氏、血平板、普平。试管培养法（斜面）：保存菌种与传代。小培养法：玻片。平皿培养法：标本先用70%乙醇或2%的石炭酸浸泡2-3分钟杀死杂菌，洗净培养后观察菌落特征。小培养操作操作步骤：用无菌手术刀片在沙保弱上切割4个小琼脂方块，放在一旁；用接种钓在方块的4个边的中央点种；用95%的乙醉浸泡盖玻片用火点燃，烧干酒精，晾凉（小心被烧伤）；盖在琼脂方块上，将平板用一次性塑封袋装好，放置35度培养1-2天；观察：用锻子取下盖玻片放在载玻片上直接观案也可在载玻片上滴加一滴乳酸酚棉兰，再盖盖玻片。二、检验方法（三）真菌的鉴定❶生化反应鉴定同化碳源试验：加糖同化氮源试验：加硝酸钾糖发酵明胶液化试验尿素分解试验二、检验方法（三）真菌的鉴定❷免疫学试验(1-3)-β-D-葡聚糖是一种广泛存在于真菌细胞壁的抗原成分,占其干燥重量的80%～90%，其它微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液均不含有。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化代谢后，（1-3）-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液或其它体液中（1-3）-β-D葡聚糖含量增高。血清（1-3）-β-D葡聚糖含量检测不失为一种实用的真菌感染早期诊断方法。并且，相关研究表明，（1-3）-β-D葡聚糖水平在确诊IFI患者的血清中出现持续升高，而随着药物的使用，对药物敏感者可很快出现（1-3）-β-D葡聚糖水平下降及转阴，而药物治疗无效人群（1-3）-β-D葡聚糖值无明显改变。因此，（1-3）-β-D葡聚糖可以用来判断药物的疗效，以协助临床医师及时进行药物种类及剂量的调整。二、检验方法（三）真菌的鉴定❸其他鉴定试验芽管形成试验。厚膜孢子形成试验。真菌毒素检测：ELISA法检测黄曲霉毒素。新技术：质谱、光谱鉴定、核酸检测、基因测序。三、真菌的药敏试验临床常用抗真菌药物：多烯类：制霉菌素、两性霉素B、甲帕霉素、曲古