寻菌达人挑战从土壤中分离计数与鉴定尿素分解菌课件高二下学期生物人教版选择性必修3

寻菌达人挑战从土壤中分离、计数与鉴定尿素分解菌微生物实验探索项目式学习我们的任务驱动问题任务目标1分离尿素分解菌2估算活菌数量3鉴定目标菌种从学校菜地的土壤中，分离出能够分解尿素的细菌，并估算出每克土壤中大约有多少这样的"宝藏细菌"，同时证明你分离到的确实是尿素分解菌。如何完成挑战？尿素分解菌有什么特性？任务目标1分离尿素分解菌2估算活菌数量3鉴定目标菌种尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，尿素施入土壤中，需要土壤中的尿素分解菌将尿素分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物利用。细菌的生活需要哪些什么条件？微生物需要的营养水生命之源碳源如：葡萄糖氮源合成蛋白质无机盐调节代谢第一步：分离尿素分解菌——设计"专属饭菜"请阅读课本P9-101.培养基的概念人们按照微生物对＿＿＿＿的不同需求，配制出供其＿＿＿＿的营养基质。营养物质生长繁殖主要营养物质！其他条件pH、＿＿＿＿＿＿、O2的需求特殊营养物质生长因子、氨基酸、维生素、碱基等培养基pH调至酸性培养基pH调至中性或弱碱性第一步：分离尿素分解菌——设计"专属饭菜"2.培养基的用途用以培养、＿＿＿、＿＿＿、保存微生物或积累其代谢物。分离鉴定思考：下表是某培养基的配方，分析回答：材料NaCl蛋白胨牛肉膏水用量5g10g5g定容至1000mL

（1）该培养基中提供碳源和氮源的物质是什么？这个培养基可否把尿素分解菌分离出来，为什么？

提示：该培养基中牛肉膏和蛋白胨提供碳源和氮源。

培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质必需的。碳源、氮源、磷酸盐和维生素等碳源、氮源、和维生素等

（2）请同学们看自己的任务单，思考活动1的问题？第一步：分离尿素分解菌——设计"专属饭菜"成分含量（/L）提供的主要营养KH₂PO₄1.4g

Na₂HPO₄2.1g

MgSO₄·7H₂O0.2g

葡萄糖10.0g

尿素1.0g

琼脂15.0g

1.为什么用尿素作为唯一氮源？

2.如果没有琼脂，培养基会是什么状态？大多数细菌不能合成脲酶，无法利用尿素，因此无法生长；而尿素分解菌能合成脲酶，正常生长繁殖。因此可达到筛选尿素分解菌的目的。琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。如何让细菌"固定"下来？液体培养基细菌游动，混在一起固体培养基加入琼脂，像果冻一样凝固细菌原地繁殖形成菌落优势：

用于大量繁殖微生物

让一个菌发展成为单菌落

为什么有了选择培养基还要无菌操作？研究发现：环境中普遍存在微生物。其中部分可在选择培养基上微弱生长，干扰观察；少数能分泌抑菌物质，抑制尿素分解菌；还有些是条件致病菌，可能危害实验者健康。思考：1.在分离尿素分解菌的操作过程中，我们应该采取什么措施来避免这些微生物进入培养基或接触人体？采取这些措施可以达到哪些具体目的？2.阅读课本P10-11,无菌技术主要包括那两个方面？完成任务单中的活动2。无菌技术（1）防止培养物（所培养的微生物群体）被污染。（2）防止＿＿＿＿＿＿＿＿。感染实验操作者消毒和灭菌活动2消毒vs灭菌对比消毒灭菌定义杀死物体表面或内部的

微生物杀死物体内外

的微生物程度常用方法适用对象部分所有不彻底，不能杀死芽孢和孢子彻底，包括芽孢和孢子化学药物消毒、巴氏消毒紫外线消毒、煮沸消毒高压蒸汽灭菌灼烧灭菌、干热灭菌实验者双手、操作台面培养基、接种环煮沸消毒法巴氏消毒法化学药物消毒法紫外线消毒常用的消毒和灭菌方法项

目主要方法应用范围消毒

巴氏消毒法63～65℃消毒＿＿＿min或或80～90℃处理＿＿＿＿s＿＿＿、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体煮沸消毒法100℃煮沸＿＿＿min家庭餐具等生活用品紫外线消毒紫外线照射＿＿＿min化学药物消毒用体积分数为70%～75%的＿＿＿、＿＿＿、苯酚或煤酚皂溶液等处理

皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、水消毒接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。项

目主要方法应用范围灭菌灼烧灭菌

直接在酒精灯火焰的＿＿＿＿＿层灼烧干热灭菌干热灭菌箱中，160～170℃的热空气中维持2～3h。高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）100kPa、121℃的条件下，维持15～30min充分燃烧接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具、试管口或瓶口等培养基等耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等接种工具灼烧灭菌法涂布器接种环接种针其他金属工具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧接种过程试管口瓶口通过酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧迅速彻底灭菌充分燃烧层（外焰）原理：使微生物燃烧。干热灭菌法干热灭菌箱灭菌物品放入密闭容器160~170℃2~3h耐高温和需要保持干燥的物品玻璃器皿金属用具涂布器原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。接种环1)配制培养基2)灭菌3)倒平板选择培养基的制备成分含量（/L）KH₂PO₄1.4gNa₂HPO₄2.1gMgSO₄·7H₂O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g水定容至1000mL1)配制培养基2)灭菌3)倒平板培养基：培养皿：用高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌在干热灭菌箱内干热灭菌思考：如何分别对培养基和培养皿进行灭菌呢？1.避免因水蒸气凝结而浸湿棉塞。2.

避免再次污染牛皮纸思考：为什么要用牛皮纸进行包裹呢？160-170℃灭菌2h100kPa、121℃，15-30min选择培养基的制备1)配制培养基2)灭菌3)倒平板待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。1.拔出锥形瓶的棉塞2.将瓶口迅速通过火焰3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置选择培养基的制备1.培养基灭菌后，为什么需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板?＞50℃，烫手将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落产生以确定是否被污染。3.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？因为平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,既可防止培养基表面的水分过快挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基＜50℃，若不及时操作，琼脂就会凝固4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。如何利用平板分离出单个菌落？1蘸取菌液用接种环蘸取少量菌液2在平板上划线在固体培养基表面划线阅读书本P12-13思考：1.我们分离菌的原理是什么？这个方法叫什么？原理：将混合菌液稀释分散，得到单菌落平板划线法步骤2.蘸取菌液前，接种环需要灭菌吗？如何实现？请完成任务单中的活动3展示学生成果，并进行点评如何利用平板分离出单个菌落？划线示意图12345灼烧灼烧灼烧灼烧灼烧灼烧这样进行画线是否可行？可行连续划线法211）留意接种环灭菌的注意事项。2）划线的注意事项。平板划线法①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝

。②在

冷却接种环，并拔出装有土壤溶解液的试管的棉塞③将试管口通过火焰④将已

的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液⑤将试管口通过火焰，并塞上

。⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要

。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的

开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。火焰旁烧红冷却棉塞划破培养基末端纯培养物培养物纯培养在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体获得纯培养物的过程由单一个体繁殖所获得的微生物群体配制培养基灭菌接种分离培养小结第一课时收获选择培养基设计我们设计了尿素为唯一氮源的选择培养基固体培养基作用我们理解了固体培养基加琼脂的作用消毒与灭菌我们学会了消毒与灭菌的区别平板划线法我们模拟了平板划线分离单菌落下节课预告我们将学习如何计数活菌，掌握稀释涂布平板法！划线法不能计数，怎么办？划线法的局限菌液浓度不均匀无法确定原始浓度难以统计活菌数量解决方案要计算每克土壤中有多少活菌需要用到稀释涂布平板法问题发现平板划线法虽然可以分离单菌落，但无法准确计数！稀释涂布平板法原理阅读书本P17要对土壤进行___________，然后再将菌液_______到制备好的_____________上。充分稀释涂布选择培养基两个基本操作：____________和___________。梯度稀释涂布平板

稀释涂布平板法原理

展示学生作品10倍系列稀释过程1g土壤原始样品10⁻¹+9mL水10⁻²10⁻³10⁻⁴10⁻⁵10⁻⁶+9mL水+9mL水+9mL水+9mL水+9mL水移1mL移1mL移1mL移1mL移1mL稀释倍数100倍10倍1000倍10000倍10000倍100000倍稀释涂布平板法原理计算理论菌落数Q1：涂布0.1mL菌液到平板上，如果菌落数太多（例如超过300），会有什么问题？如果菌落数太少（例如少于30），又有什么问题？菌落数太多会堆积在一起，无法区分单个菌落，计数不准确；菌落数太少则统计误差大，缺乏代表性。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。Q2：确定了稀释倍数后，如何进一步减少计数时的实验误差？同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，求平均值涂布平板稀释涂布平板法原理稀释涂布平板法原理

公式：每克活菌数=(平均菌落数÷涂布体积)×稀释倍数

统计的菌落数等于活菌的实际数目吗？如果不等于，是偏大还是偏小？为什么？不等于，统计的菌落往往比活菌的实际数目少因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落如何证明它就是我们要的菌？选择培养基配方：思考：该培养基上生长得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，比如固氮菌；还有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖。因此还需要进一步的鉴别。鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与之发生(不)反应而达到鉴定的作用。观察结果对比如何证明它就是我们要的菌？已知细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3

，NH3会使培养基的碱性增强，pH升高。酚红作为常用的指示剂，在酸性条件下会由黄变红。。你想到了鉴定分解尿素细菌的方法了吗？在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。无红色晕圈不是尿素分解菌有红色晕圈真正的尿素分解菌如果没有红色晕圈，可能原因是什么？1没有真正的尿素分解菌土壤中可能不存在尿素分解菌，或者数量极少难以分离2培养基pH未调合适培养基初始pH值不合适，影响酚红显色反应3指示剂失效酚红指示剂存放时间过长或保存不当导致失效4培养时间不够细菌还未充分分解尿素产生足够的氨实验失败科学态度分析原因改进方法重新实验寻菌全流程土壤取样配制培养基(加酚红)无菌操作稀释涂布培养计数观察晕圈确定目标菌选择培养基尿素为唯一氮源无菌技术防止杂菌污染系列稀释10⁻¹至10⁻⁶酚红鉴定观察红色晕圈这项技术有什么用？生物肥料固氮菌肥将空气中的氮气转化为植物可吸收的氮素解磷菌肥分解土壤中的难溶性磷，提高磷肥利用率解钾菌肥释放土壤中的钾元素，促进作物生长提高作物产量，减少化肥使用环境保护降解农药利用微生物降解土壤中的残留农药处理污水利用微生物分解污水中的有机物修复土壤治理重金属污染和石油污染土壤保护生态环境，实现可持续发展课后思考如果要分离耐高温的细菌，应该如何设计实验？选择什么样的培养条件？从哪里取样更合适？如何证明分离到的是耐高温菌？提示：想想温泉、堆肥等环境微生物技术广泛应用于农业、环保、医药等领域，是现代生物技术的重要基础高中生物·选择性必修3第15页你是真正的"寻菌达人"！今天我们模拟了从土壤中分离、计数、鉴定尿素分解菌的全过程选择培养基尿素为唯一氮源稀释涂布10倍系列稀释酚红鉴定观察红色晕圈科学探索，从一颗好奇心开始拓展应用p20

2．地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60％能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。(1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。(2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？(3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。拓展应用p20(1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。(2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？(3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。1、土壤取样；2、配制培养基；3、样品稀释，涂布平板（接种）；4、培养和观察

纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。

这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。1．研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。(1）这种培养基是一种选择培养基。（

）(2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（

）(3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。(

)2．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是(

）A．菌落中的细菌数目是固定的B．平板上的一个菌落就是一个细菌C．通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D．平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌√√√D【概念检测】1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。

(1)培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。()

(2)消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。()

(3)微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。()教材P142.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物