T∕CVMA 386-2026 猫消化道相关四种病原体实时荧光RAA检测方法

Real-timeRAAdetectionmethodforfourfe中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。众创生物科技有限公司、山东远大富邦生物工程有1猫消化道相关四种病原体实时荧光RAA检测方法本文件适用于猫冠状病毒、猫细小病毒、幽门螺旋杆菌、胎儿三毛滴虫四种病原体的定性GB/T6682分析实验室用水规格和GB/T27401实验室质量控制规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbrDNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacFAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）MMLV：莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒（moloneymurineleukemiaretrovirus）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer）RNA：核糖核酸（ribonucleicaRAA：重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aidamplificaRT-RAA：反转录重组酶介导链替换扩增（reversetranscription-recombinase-aidamplificatioTris：三（羟甲）基氨基甲烷（tri-methylolaminometh25.1.3CTAB提取缓冲液按附录A.2配5.1.7TE缓冲液按附录A.45.1.8PBS缓冲液按附录A.5.1.9启动剂按附录A.6配制。3样品的采集、保存与运输按照NY/T5粪便和肛拭子样品采集分别按照NY/T541中相关7.3.1粪便样品的处理。粪便样品加入适量PBS缓冲液充分振荡混匀。1000r/min低速离心5min去用于核酸检测的样品应尽快送检，24h内检测的样本可置于4℃保存，8.1.1在样本制备区进行，核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核8.1.7开盖，室温挥发干液体，加入50μL49结果判断与表述9.1质量控制间20min，则重复一次。如再次检测结果仍然是T值（时间20min，则判定被检样品阳性，表述为“检出阳性核酸”。如无报告T值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性，表述5A.3核酸抽提液（pH8.0）A.4TE缓冲液（pH8.0）A.5PBS缓冲液（pH7.4）A.6启动剂A.7猫冠状病毒阳性对照制备合成猫冠状病毒装甲RNA假病毒（MS2噬菌体假病毒将装甲RNA假病毒载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达系统后诱导表达纯化获得装甲RNA病毒颗粒，并对提取后装甲RNA病毒颗粒进行逆转录并进行荧光RT-PCR检测。检测阳性的，即为猫冠状病毒阳性对照母液。将阳性对照母液10倍梯度A.8猫细小病毒、幽门螺旋杆菌、胎儿三毛滴虫阳性对照制备至DH5α感受态细胞，构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/µL））），6胎儿三毛滴虫的阳性对照母液。将阳性对照母液10倍梯度稀释之后，选取104copies/µL稀释度作7猫冠状病毒荧光RT-RAA引物探针序列引物/探针序列（5'→3'）SFcov-RCTGCTACAAAGAGAGTGACAAATTGAAACTTATGTAAAATGGCCTTGG[FAM-d引物/探针序列（5'→3'）CTAAATTCTTTGCCTCAATCTCCTGCTGCAATAGGTGTTTTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAGAC[FA引物/探针序列（5'→3'）CTTGGTGTAGGGGTAAAATCCCGTTAGCTGCATTACTGGAGACAAGAGGAATACTCATTGCGAAGGCGACC[引物/探针序列（5'→3'）ATGGGTTACTGTAACATATATGCGTGTTC8引物/探针序列（5'→3'）TGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGA[FAM9C.1猫冠状病毒阳性对照参考序列（GenBanC.2猫细小病毒阳性对照参考序列（GenBankAccessionNo.PP663071.2）CTAAATTCTTTGCCTCAATCTGAAGGAGCTACTAACTTTGGTGATATAGGAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAGACTATATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAAGCATCTACACAAGGGCCATTC.3幽门螺旋杆菌阳性对照参考序列（GenBCTTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCAAGAGGAATACTCATTGCGAAGCTGGAACATTACTGACGCTGATTGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGAGTCCACGCCCTAAACGATGGATGCTAGTTGTTGGAGGGCTTAGTCTCTCCAGTAATGCAGCTAACGC.4胎儿三毛滴虫阳性对照参考序列（GenBCTTAGGCAATGGATGTCTTGGCTTCTTACACGATGAAGAACGTTGCATGGCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGATCTTTGAATGCACATTGCGCGCCGTTCTAGAACACGCATATATGTTACA体积(μL）RT-RAA荧光反应单元（25μL反应体系冻干粉）-正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)D.2猫细小病毒、幽门螺旋杆菌、胎儿三毛滴虫荧光RAA猫细小病毒、幽门螺旋杆