用于口服胰岛素递送的牛奶来源纳米囊泡

文献解读|ScienceAdvances用于口服胰岛素递送的牛奶来源纳米囊泡背景介绍糖尿病作为一种慢性代谢疾病，目前估计影响着全球超过8亿成年人。患有1型糖尿病(T1D)或晚期2型糖尿病的患者需要常规外源性胰岛素来控制血糖。目前，胰岛素在临床和商业上通过皮下注射使用，这是一种侵入性的给药方法，长期来看会导致患者依从性差；同时，皮下注射胰岛素绕过了初始肝脏作用，导致外周高胰岛素血症，这可能引起各种副作用。口服给药因其无痛和方便而最容易被患者接受，然而口服胰岛素给药的主要挑战是：.如何在保护胰岛素活性的同时，使其能够高效穿越胃肠道.完成肠道跨上皮运输.及时在作用部位积累而不被过度肝脏清除目前已有多种纳米颗粒被开发用于口服胰岛素给药，提高口服生物利用度的成熟技术有肠溶包衣、酶抑制剂或渗透增强剂，但这些方法增加了制剂的复杂性或带来了破坏先天免疫的风险。近年来，外泌体在许多研究中被用作天然药物递送系统。特别是，牛奶来源的外泌体(Miexos)作为新兴的口服纳米载体已获得广泛欢迎。研究核心内容研究团队提出一种基于位点特异性牛奶来源的纳米囊泡(MiNVs)的口服胰岛素递送方法。MiNVs来源于牛奶，不仅能够容易获得，而且还能够在胃肠道的恶劣环境中存活并保护包封的胰岛素。MiNVs设计具有位点特异性适应性：.通过表面的IgG与肠上皮细胞上的FcRn相互作用.促进转胞吞作用.同时逃避溶酶体降解.到达肝脏后，对肝窦微环境中升高的生物硫醇水平作出响应.触发位点特异性的胰岛素释放从而克服肠道和肝脏递送屏障。MiNVs的制备与表征制备方法MiNVs的制备包括三个主要步骤：Miexos的提取—通过超速离心从牛奶中提取，去除污染蛋白并富集IgGLipos的制备—通过薄膜水化和超声法制备，并负载胰岛素两者的脂质重排—通过额外的超声处理步骤使Miexos和Lipos发生脂质重排，形成MiNVs表征结果.水动力学尺寸：显著大于Miexos.ζ电位：介于Miexos和Lipos之间.FRET分析：成功融合了Miexos和Lipos的特性，表现出强烈的荧光共振能量转移(FRET)现象.蛋白质印迹和纳米流式细胞术：进一步证实了MiNVs表面IgG的表达.稳定性测试：在模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)中表现出优异的稳定性，保留了高IgG表达和胰岛素活性MiNVs的体外跨上皮运输作者通过在人结肠腺癌(Caco-2)细胞中研究了游离胰岛素、Lipos和MiNVs的跨上皮运输机制，揭示了IgG-FcRn相互作用机制。细胞实验关键发现.与游离胰岛素和Lipos相比，MiNVs组的细胞发出更强的红色荧光强度，说明MiNVs被Caco-2细胞更有效地内化.经MiNVs处理的细胞的荧光信号主要集中在再循环内体中，在晚期内体和溶酶体中的共定位极少.MiNVs表面的IgG有助于避免进入晚期内体，并通过FcRn的分选作用逃避溶酶体途径Transwell模型与转胞吞效率作者使用Caco-2细胞单层Transwell模型评估双向胞吐作用：.在模拟生理pH梯度时，MiNVs显示出向基底外侧的最高胞吐效率.通过FRET和TEM验证了下室中MiNVs的完整性MiNVs在1小时和4小时显示出的转胞吞效率分别是游离胰岛素和Lipos的4.2倍和2.2倍体内分布研究肠道分布：MiNVs组的荧光强度在给药6小时达到峰值，显著高于游离胰岛素和Lipos组，并且这种效应持续长达12小时肠道穿透：MiNVs组肠道切片的免疫荧光图像和离体通透性实验表明，MiNVs通过FcRn介导的跨上皮运输穿越胃肠道屏障肝脏分布：肝脏切片的荧光图像进一步证明，MiNVs比其他两种化合物更有效地通过门静脉将胰岛素输送到肝脏这些结果为MiNVs的持续血糖控制能力奠定了基础。MiNVs在T1D小鼠中的血糖控制建立了STZ诱导的T1D小鼠模型，发现口服负载胰岛素的MiNVs可以持久地调节血糖，显示出优越的降糖效果。IgG-FcRn相互作用验证IgG竞争性抑制实验：在口服负载胰岛素的MiNVs前30分钟，用不同剂量的牛IgG灌胃T1D小鼠：发现负载胰岛素的MiNVs的降糖效果随着IgG剂量的增加而逐渐减弱FcRn敲除验证：在FcRn敲除(FcRn-KO)T1D小鼠中：.负载胰岛素的MiNVs的降糖效果显著降低.FcRn-KO小鼠的小肠和肝脏荧光成像显示，Cy5.5-胰岛素负载的MiNVs在肠道中的穿透减少，导致肝脏积累减少综上所述，MiNVs在T1D小鼠中通过与IgG-FcRn相互作用控制血糖生物相容性验证：在健康小鼠中验证了Lipos和MiNVs的生物相容性，MiNVs组的促炎细胞因子水平没有显著变化。MiNVs治疗T1D大鼠的药效学和生物利用度降糖效果：在T1D大鼠中验证了口服负载胰岛素的MiNVs产生了持续超过8小时的降糖效果，进一步证实了MiNVs优越的血糖控制能力。药代动力学：口服负载胰岛素的MiNVs的大鼠血清胰岛素浓度逐渐升高，在3小时达到峰值，随后缓慢下降。口服生物利用度为20.4%OGTT实验：在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中：.口服负载胰岛素的MiNVs的大鼠的血糖水平与健康大鼠相比差异很小.AUC分析表明：口服负载胰岛素的MiNVs治疗提供了优越的血糖控制，与健康大鼠相似，在OGTT期间显著优于其他治疗组口服负载胰岛素的MiNVs能有效实现长期血糖控制MiNVs在T1D迷你猪中的疗效评估建立了更具临床相关性的T1D迷你猪模型，以进一步验证MiNVs的治疗效果。疗效结果.口服负载胰岛素的MiNVs在头2至4小时内将血糖水平降至正常范围(低于200mg/dl).这种效果持续长达8小时安全性验证在迷你猪中验证了MiNVs的生物安全性：.连续14天给三只健康迷你猪灌胃MiNVs.全程中血液参数几乎没有变化.体重也未见显著变化.主要器官和胃肠道关键部位通过染色后也未观察到组织学变化证实了MiNVs良好的生物安全性结论与展望严酷的胃肠道环境、肠上皮屏障的低通透性以及肝脏对外来颗粒的清除仍然是口服胰岛素递送的关键挑战。研究成果总结本研究开发了能够有效克服这些屏障以实现口服胰岛素递送的位点特异性适应性MiNVs：.在T1D大鼠和迷你猪模型中实现了长期血糖控制.在迷你