IBDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立

引言传染性法氏囊病传染性法氏囊病（IBD）主要发生在3-6周龄雏鸡，是由IBDV引起的免疫抑制性疾病。该病具有高发病率和较短病程的特性，法氏囊炎症、淋巴细胞坏死和免疫抑制是其主要的病理特征REF_Ref32165\n\h[1]。法氏囊功能受损会导致雏鸡免疫力明显下降，易引起继发或并发疾病，可能导致疫苗免疫效果不佳，病死率显著增加。尽管通过广泛采取疫苗及生物安全防控，IBD仍严重影响全球养禽业的健康发展。IBD临床表现传染性法氏囊病潜伏期为2-3天，根据感染程度，IBDV可表现为不同类型，感染超强毒株vvIBDV可引起急性型、感染中等毒力毒株vIBDV会导致亚急性型、低毒力毒株易造成慢性感染，弱毒株或疫苗株无临床表现。感染初期的病鸡表现为精神不振、食欲下降、怕冷、腹泻并排出白色或水样粪便污染泄殖腔周围，有些鸡伴有震颤及跛行的症状。法氏囊的病理变化是IBDV感染的主要特征，尿酸盐沉积引起的花斑肾、腿部和胸部的肌肉出血也是其典型病变REF_Ref14941\n\h[1]。IBDV的防控措施以雏鸡接种疫苗为主。当今，IBD主要为亚临床感染，具有一定的隐蔽性，以免疫抑制为主，易造成疫苗接种效果差，进而使得养殖人员无法在早期发现并控制疫情，为鸡场带来损失。IBD流行病学由于IBDV的抗原结构和基因特征存在差异，可分为血清Ⅰ型和血清Ⅱ型。该病毒在全球各地广泛流行。血清Ⅰ型的易感染动物为鸡，可导致雏鸡法氏囊严重病变，未成熟的B淋巴细胞坏死和免疫抑制，成年鸡无明显影响REF_Ref15098\n\h[2]。容易感染血清Ⅱ型的动物为火鸡、鸭及野生鸟类，不感染鸡。血清Ⅰ型和血清Ⅱ型之间并无交叉免疫保护。病毒主要通过病鸡排出的粪便污染饲料、饮水和养殖设备，造成间接接触传播，健康鸡与带毒鸡直接接触也可引起病毒传播。IBDV典型毒株于1957年首次在美国爆发并命名为甘布罗病，大约30年后，欧洲突然出现非常致命的IBDV病毒，首次报道超强毒株（vvIBDV），随后在亚洲、非洲和美洲迅速传播REF_Ref15287\n\h[3]。vvIBDV突破传统疫苗的保护，使全球范围内疫苗免疫失败，比起经典毒株（cIBDV）毒力更强，死亡率极高。随后科学家利用RT-PCR技术发现vvIBDV的VP2基因与cIBDV在抗原决定簇上存在关键突变，并研发了超强毒株疫苗提高免疫。二十一世纪初，美国、中国、日本相继报道新型变异毒株（vIBDV），其具有更强的免疫逃逸能力，使疫苗免疫效果下降REF_Ref21172\n\h[4]。在中国，IBD首次于1979年在北京和广东被发现，并迅速在国内家禽中传播，vvIBDV在上世纪九十年代初流行，严重危害中国养禽业的发展。近年来，新型变异株的流行，导致出现亚临床症状，给中国家禽业的发展带来了更多新的挑战。传染性法氏囊病病毒IBDV病原学传染性法氏囊病病毒（IBDV）属于双RNA病毒科（Birnaviridae），禽双RNA病毒属（Avibirnavirus），无囊膜的二十面体对称衣壳包裹着IBDV双链RNAREF_Ref21172\n\h[4]。该病毒具有较强的环境适应能力，耐受高温，对乙醚等某些消毒剂具有较强的抵抗力。IBDV基因组包括A节段和B节段，A节段主要编码VP2、VP3、VP4和VP5，在病毒的结构形成、复制调控及免疫逃逸中起重要的作用。B节段主要编码VP1，负责病毒RNA的复制和转录REF_Ref19833\n\h[5]。IBDV编码蛋白VP1蛋白以游离形式存在于病毒颗粒中，是RNA依赖性RNA聚合酶，也是病毒RNA复制的关键酶，直接影响病毒的增殖、毒力及复制效率。VP2蛋白作为IBDV最主要的结构和抗原蛋白，约占总蛋白的二分之一。它可刺激机体产生中和抗体，同时影响病毒的抗原性和免疫保护效果REF_Ref23160\n\h[6]。它主要负责抗原变异、适应组织能力和病毒毒力。因此VP2的变异可直接影响IBDV的免疫逃逸和疫苗免疫效果。VP2蛋白有三个关键的结构域，即基底、外壳和突起，基底和外壳结构域较为保守，确保病毒粒子的稳定性，而突起的结构域包含VP2的主要抗原决定簇，并由VP2的高变区形成，该区域变异可提高病毒毒力，突破疫苗保护REF_Ref23160\n\h[6]。VP3蛋白是一种具有群特异性的免疫原性蛋白，在病毒内起到支架作用，有助于维持基因组的结构稳定，促进病毒的复制和子代病毒的产生。VP4蛋白属于丝氨酸蛋白酶，具有自我切割和蛋白处理的功能，可裂解多聚蛋白。该蛋白在病毒装配过程中发挥重要作用，有助于病毒粒子的成熟。VP5是一种IBDV的非结构Ⅱ类膜蛋白，具有较高碱性和半保守性，含有大量的CysREF_Ref15287\n\h[3]。该蛋白在细胞膜内累积，可引起法氏囊损伤，在病毒颗粒释放和传播中发挥关键作用。IBDV实验室诊断常规检测方法病毒分离技术该技术通过鸡胚接种法或细胞培养法分离IBDV。试验采取发生病变的法氏囊组织，使之接种于鸡胚尿囊腔或鸡胚成纤维细胞中增殖，收集感染的鸡胚或细胞进行血清学检测。该方法可分离完整毒株，但需要使用昂贵的SPF鸡胚，成本较高、试验周期长、实验室要求高。琼脂扩散试验（AGP）AGP是一种广泛使用的血清学检测方法，适用于病毒抗原或抗体的检测。无菌条件下采血，分离血清后加样于已打好梅花孔的琼脂凝胶板上，观察周围沉淀环的形成情况。此技术操作简单、成本较低、特异性高，适用于临床现场的快速检测，但其灵敏度较差易出现假阴性结果，并且试验时间长，通常需要结合ELISA、RT-PCR等技术使用。酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA常用于病毒的临床检测，利用抗原-抗体特异性结合，通过酶标二抗催化底物显色反应，实现定性或定量检测。该方法具有高灵敏度、高特异性和检测迅速的优势，适合进行大规模的筛查和检测，但实验仪器价格昂贵、成本较高、操作要求严格。荧光定量RT-PCR方法检测IBDV荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）是快速检测目的基因表达水平的首选方法，它结合了逆转录（RT）和实时荧光定量PCR（qPCR），耗时短、灵敏度和特异性极强，主要运用于病毒的早期诊断和病毒载量的检测等方面。与传统RT-PCR技术不同的是，它通过荧光信号实时检测和定量分析IBDV的病毒载量和极低拷贝数的RNA病毒，检测效率显著升高，结果准确可靠，是IBDV最精确的检测技术REF_Ref25897\n\h[7]。当今，由于IBDV疫苗的预防接种和新型变异株的流行，IBD的典型症状和病理变化逐渐减少，病鸡主要以亚临床感染为主，临床上通常为隐性经过或无明显的外观表现，突破疫苗防护，威胁着我国养禽业的健康，目前荧光定量RT-PCR已成为检测IBDV的首选方法。IBD防控措施目前，IBD的有效防控措施以预防为主，控制传染源，切断传播途径，保护易感动物。严格管理鸡舍饲养制度，定期消毒，控制传播媒介可有效预防IBDV的传播。其中疫苗免疫是预防IBD最主要的方法，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、活载体疫苗，通常在雏鸡14-20日龄接种，并结合ELISA进行抗体监测，提高鸡群健康水平。试验材料和方法试验材料试验动物和毒株病毒毒株：实验室保存毒株vvIBDV-3，-80℃超低温冰箱储存。试验动物：10-21日龄的SPF雏鸡，无菌环境饲养。本研究的目的与意义由于目前IBD主要为亚临床症状，以免疫抑制为主，易造成疫苗接种效果差，无法及时发现并控制感染鸡群，造成鸡场严重损失。本研究通过建立荧光定量PCR方法，在VP5和VP2基因重叠区域设计引物，构建pMD18-T-VP2质粒，建立标准曲线，测定传染性法氏囊病病毒载量，分析样本中的拷贝数，建立更高效的分子生物学检测方法，提高IBDV的早期诊断能力，加强疫情的早期控制，减少损失，为诊断疾病、评估病毒载量以及监测疫情奠定基础，促进养禽业的健康发展。主要仪器试验中所用的仪器、型号及厂家如REF_Ref26235\h表1所示。表SEQ表\*ARABIC1主要仪器仪器名称设备型号厂家超净工作台BSC-1300苏州净化设备有限公司生物安全柜1200LC-A2HEAL-FORCE电子数显天平FA1104上海良平仪器仪表有限公司移液枪ResearchplusEppendorf高压蒸汽灭菌锅LDZM-60KCS上海申安医疗器械厂-80℃超低温冰箱Forma902赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司恒温培养箱DNP-9082中国厦门医疗电子仪器厂恒温摇床ZD-85常州金坛良友仪器涡旋振荡器MVS-1北京金北德工贸有限公司小型高速冷冻离心机5418REppendorf台式低速离心机TD25湖南赫西仪器装备有限公司核酸提取仪TGuideS32天根生化科技（北京）有限公司全自动凝胶成像仪UVP21UVP分光光度计UV-2600Shimadzu电泳仪165050BIO-RAD电泳槽17.32B.197-04北京六一生物科技有限公司PCR仪T100BIO-RAD实时荧光定量PCR仪QS-5ABI主要试剂及试剂盒RNAprepPure提取试剂盒、QuantcDNA合成试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒；2×SYBRGreenqPCRMasterMix、β-巯基乙醇、无水乙醇、ddH2O、PBS磷酸缓冲液、1%琼脂糖凝胶、电泳缓冲液、LB固体培养基、含氨苄青霉素的LB液体培养基、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞。试验方法引物的设计从GenBank中获取已公布的IBDVVP2和VP5的重叠基因序列，并用PrimerPremier5.0软件设计VP2和VP5的重叠区域基因的特异性引物，设计的引物见REF_Ref11565\h表2，SYBRGreenI为染料进行荧光定量PCR扩增反应。表SEQ表\*ARABIC2引物信息引物引物序列（5’-3’）长度q-VP2-FGATGCTCCTGACGGCCCAGAACCT114bpq-VP2-RCCGTTTAGCGCATAACGCCACC试验动物攻毒处理10日龄SPF雏鸡，按REF_Ref11979\h表3进行试验分组，vvIBDV-3的毒力效价为105EID50/0.2mL。表SEQ表\*ARABIC3试验分组组别处理数量A组接种毒株vvIBDV-36B组接种PBS缓冲液3PBS缓冲液梯度稀释vvIBDV-3毒株，A组肌肉注射0.2mL稀释的病毒液，同时B组肌肉注射0.2mL的PBS缓冲液REF_Ref1806\n\h[8]，同一环境和条件下饲养观察7d，对试验动物称重并处死，剖解脏器（法氏囊、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺脏），标记并称重，观察各脏器病理变化和重量变化。RNA病毒核酸的提取使用TIANGENRNAprepPure动物组织总RNA提取试剂盒提取各脏器的RNA。样本处理每个新鲜REF_Ref31441\r\h组织样本取20mg（新鲜样本由REF_Ref12695\n\h2.2.2处理的法氏囊、肝脏、肾脏、脾脏）于无污染的离心管中，加入300μL裂解液，将组织研磨充分后，分别加入590μL无RNA酶水和10μl蛋白酶K，混匀后置于56℃的环境中20min。RNA的提取高速离心机设置为12000rpm进行以下试验。将混匀后的样本离心5min，收集上层澄清液体转入新的离心管中。向上清液中缓慢加入等体积50%的无水乙醇，将混合溶液移至吸附柱离心，RNA吸附于柱膜上，弃去含蛋白等杂质的废液。向吸附柱中加入350μL去蛋白液，离心以去除残留蛋白，继续加入80μLDNaseⅠ工作液，室温静置15min以去除基因组DNA。加入500μL预混无水乙醇的漂洗液清洗两次，弃除残留杂质，待吸附柱晾干后，膜中央滴入无RNA酶水以洗脱RNA，标记收集的RNA溶液并于-70℃保存。RNA纯度和浓度的检测1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳后UV下观察rRNA条带，28SrRNA条带清晰且18SrRNA条带完整，同时28S/18S条带比值约为2：1，则RNA完整。使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度。取一定量RNA提取物，用无RNA酶水稀释，通过测定的260nm和280nm吸光值计算RNA的浓度和纯度。OD260/OD280读数在1.8-2.0之间，则表示RNA纯度高REF_Ref28075\n\h[9]。cDNA的合成此试验采用TIANGENcDNA第一链合成试剂盒，根据说明操作，以提取的TotalRNA为模板反转录合成cDNA。试验前冰上解冻TotalRNA，根据REF_Ref13279\h表4体系进行配制并涡旋混匀，37℃条件下孵育60min，得到产物cDNA。表SEQ表\*ARABIC4逆转录反应体系反应成分体积10×RTMix2μLSuperpuredNTPs(2.5mMeach)2μLOligo-(dT)15或Random(10M)*2μLQuantReverseTranscriptase1μL模板RNA1μgRNase-Free水补足至20μL质粒的构建目的基因片段的扩增REF_Ref20000\n\h2.2.4合成的cDNA作为模板，用于扩增VP2和VP5基因重叠区域。扩增混合配方和热循环设置分别列于REF_Ref12804\h表5和REF_Ref14301\h表6中。表SEQ表\*ARABIC5PCR反应体系反应成分体积10×PCRBuffer5μLdNTP1μLMgCl21.5μL上游引物（10μmol/L）2μL下游引物（10μmol/L）2μL模板cDNA2μLTapDNA聚合酶0.5μLddH2O补足至50μL表SEQ表\*ARABIC6PCR反应条件步骤温度时间循环数预变性95℃3min1变性95℃15sec35退火55℃30sec35延伸72℃1min35补充延伸72℃5min1PCR扩增产物的回收扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，利用凝胶成像仪检测并记录条带REF_Ref29669\n\h[10]。在紫外灯的照射下，挑取正确的目标DNA片段剪切并称重，根据DNA回收试剂盒说明步骤，得到纯化的DNA片段。目的基因的连接与转化按照pMD18-TVector试剂盒说明，pMD18-T载体与回收PCR产物在16℃条件下连接，反应持续一夜，形成pMD18-T-VP2-VP5重组质粒，其反应体系为：pMD18-T载体1μL，纯化的PCR产物4μL，Solution5μLREF_Ref28160\n\h[11]。解冻DH5α感受态细胞，在超净台内将重组质粒加到感受态细胞中，将混合的菌液冰浴0.5h，放入42℃的水浴锅内90s后快速放于冰上以提高转化效率。将无抗LB培养基加到转化产物中，37℃、200rpm摇床培养60minREF_Ref31210\n\h[12]。将部分菌液涂在LB固体培养基上，使其分布均匀，37℃恒温培养12h。标准阳性质粒的筛选选取单个反应结果为阳性菌群至含氨苄青霉素的LB液体培养基，恒温培养12h，直接取菌落为模板进行PCR扩增，验证是否含有目标片段的重组质粒。反应体系见REF_Ref18742\h表7：表SEQ表\*ARABIC7菌液PCR反应体系反应成分体积10×PCRBuffer5μLdNTP1μLMgCl21.5μL上游引物（10μmol/L）2μL下游引物（10μmol/L）2μL菌液2μLTapDNA聚合酶0.5μLddH2O补足至20μL通过琼脂糖凝胶电泳分离观察产物是否出现条带，筛选出阳性质粒。质粒的提取及拷贝数计算质粒提取使用质粒小提试剂盒，对IBDV病毒pMD18-T-VP2-VP5进行质粒的提取。取5mL菌液于离心管中离心1min并弃去液体，加入150μL溶液P1彻底混匀，重悬沉淀。随后向其加入150μL溶液P2，缓慢翻转使菌体裂解。继续加入150μL溶液P4，立即摇匀，可观察到白色沉淀物的形成。将混合液离心7min，将上层液体转移至干净的离心管内，加入60μL去内毒素溶液混匀呈为透明的黄色。在溶液中加入等体积0.3倍的异丙醇，摇匀后转入至吸附柱内离心。依次加入并离心600μL缓冲液、700μL漂洗液，彻底去除杂质和漂洗液。将洗脱液加入膜中心位置，离心收集到质粒溶液。重复该步骤以增加质粒回收率。提取的质粒浓度和纯度可通过琼脂糖凝胶电泳和紫外线分光光度计进行检测。质粒拷贝数的计算拷贝数（copies/μL）=核酸浓度×10-9（ng/μL）×6.02×1023/DNAlength×660IBDV荧光定量RT-PCR标准曲线的建立将10倍梯度稀释（10-1-10-10）提取的标准质粒的每个浓度设计三组平行样本为模板，采用染料法按REF_Ref19131\h表8建立qPT-PCR反应体系，进行荧光定量RT-PCR反应扩增REF_Ref32069\n\h[13]。表SEQ表\*ARABIC8qPT-PCR反应体系反应成分体积2×SYBRGreenqPCRMasterMix5μL上游引物（10μmol/L）0.2μL下游引物（10μmol/L）0.2μL标准质粒/模板cDNA1μLddH2O补足至10μL按REF_Ref20091\h表9设置荧光定量RT-PCR反应条件。表SEQ表\*ARABIC9qPT-PCR反应条件步骤温度时间循环数预变性95℃2min1变性95℃5sec40退火/延伸60℃15sec40根据荧光定量PCR的检测结果和标准质粒稀释后的拷贝数，建立标准曲线。X轴为log10（拷贝数），Y轴为循环阈值（Ct），方程为y=-kx+b。使用SPSS软件，计算该方程的相关系数（R2）。IBDV荧光定量RT-PCR病毒载量的检测将REF_Ref20000\n\h2.2.4各脏器合成的反转录产物为模板，使用染料法荧光定量PCR，根据REF_Ref19131\h表8和REF_Ref20091\h表9构建荧光定量RT-PCR反应体系和条件。试验分组如REF_Ref20437\h表10，每个样本设计3个重复。利用标准曲线方程和Ct值计算各样本病毒载量。表SEQ表\*ARABIC10试验分组组别样本来源样本组攻毒组各脏器cDNA阴性对照组健康组各脏器cDNA空白对照组qRT-PCR反应体系不加模板内参基因（β-actin）对照组攻毒组和健康组cDNA结果与分析PCR扩增产物的鉴定采用针对VP2和VP5重叠区域的特异性引物进行PCR扩增，获得VP2全长1359bp、VP2高变区435bp、载体5400bp的特异性条带（REF_Ref17483\h图1），片段长度符合预期大小。←1359bp←5400bp3000bp5000bp2000bp1500bp1000bp750bp←1359bp←5400bp3000bp5000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bpM123←435bpM：DL2000DNAMarker，1：IBDVVP2，2：pMD18-T载体，3：IBDVVP2高变区IBDV荧光定量RT-PCR标准曲线的建立结果IBDV荧光定量RT-PCR敏感性检测的最低拷贝数为1.87×103copies/μL。超微量紫外线分光光度计测定提取的质粒浓度，其拷贝数为1.87×1011copies/μL，按10倍比例逐级稀释标准质粒的qPT-PCR反应所建立的标准曲线和标准曲线扩增图（REF_Ref22130\h图2和REF_Ref25151\h图3），其标准曲线方程为y=-4.1899x+48.03，相关系数R2为0.999，表示循环阈值与病毒拷贝数呈良好的线性关系。扩增效率为73.25%，略低于理想范围，但具有一定的检测价值。y=-4.1899x+48.03R2=0.999图SEQ图\*ARABIC2实时荧光定量RT-PCR标准曲线38754261y=-4.1899x+48.03R2=0.99938754261图SEQ图\*ARABIC3实时荧光定量RT-PCR标准曲线扩增图标准质粒梯度稀释后的拷贝数1-8：1.87×1010，1.87×109，1.87×108，1.87×107，1.87×106，1.87×105，1.87×104，1.87×103IBDV荧光定量RT-PCR病毒载量的检测结果以试验动物各脏器提取的cDNA为模板进行qRT-PCR检测，结果显示，可检出样本组，且样本组中法氏囊病毒载量最高为2.70×105copies/μL，其他脏器的病毒载量明显低于法氏囊，说明IBDV主要在法氏囊进行复制，随后可通过血液循环传播至其他免疫器官REF_Ref27880\n\h[15]。特异性检测显示仅有IBDV出现荧光信号，其他病毒和阴性对照没有扩增曲线，该检测方法的特异性良好。讨论本研究建立了一种检测IBDV病毒载量的qRT-PCR体系，针对VP2和VP5基因重叠区域设计特异性引物，成功构建了pMD18-T-VP2-VP5重组质粒，并应用于各样本病毒载量的检测。试验中设计的引物靶向IBDVVP2和VP5基因的重叠区域，避免了非特异性扩增，且扩增条带清晰，表示引物具有较高的特异性。在qPCR扩增过程中，采用SYBRGreen染料，生成了线性关系良好的标准曲线，方程为y=-4.1899x+48.03，相关系数R2≥0.99，扩增效率达73.25%，其略低于90%-110%，但具有一定的检测价值。该方法检测结果表明其具有高灵敏度和可信度。不同脏器的病毒载量存在差异，其中法氏囊拷贝数显著高于其他组织，表明IBDV主要在法氏囊中进行复制，随后病毒通过血液循环传播至其他免疫器官。法氏囊主要分布着B淋巴细胞，病毒攻击该器官后导致免疫系统严重受损。本研究建立的qRT-PCR体系试验周期短、检测准确度较高并可精准识别目标基因，适用于疾病的早期诊断和病毒载量的检测，有助于及早发现IBDV的亚临床症状，为疾病防控和养禽业健康发展提供重要的技术手段。但该体系扩增效率偏低，可能与反应体系及条件有关，如退火温度不合适、逆转录产物浓度低或RNA含有部分杂质等REF_Ref30802\n\h[16]。同时该试验存在样本数量有限、攻毒后选取的时间点单一以及对照组的设置不完善等问题REF_Ref28075\n\h[9]。在后续研究中，可优化PCR反应体系和条件，增加试验动物数量，丰富攻毒后采样时间点，进一步设计该方法的特异性试验，从而精确检测不同脏器中病毒RNA拷贝数，有效控制疾病的流行。结论本研究提出并建立了针对IBDVVP2和VP5基因重叠区域的荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）体系，并验证其具有可靠性和高度灵敏性，可精准测定雏鸡各组织的病毒载量并广泛应用于临床。IBDV主要在雏鸡法氏囊中进行复制，病毒载量远远高于肝脏、肾脏、脾脏等其他脏器，可为该病的诊断和防控提供重要依据。参考文献罗妃娟.鸡传染性法氏囊病的诊治及预防[J].家禽科学,2024,46(11):104-106.TomásG,HernándezM,MarandinoA,etal.DevelopmentofanRT-qPCRassayforthespecificdetectionofadistinctgeneticlineageoftheinfectiousbursaldiseasevirus[J].AvianPathology,2017,46(2):150-156.DeyS,PathakDC,RamamurthyN,etal.Infectiousbursaldiseasevirusinchickens:prevalence,impact,andmanagementstrategies[J].VeterinaryMedicine:ResearchandReports,2019:85-97.李凯琳.不同毒力传染性法氏囊病病毒致病特征及诱导法氏囊转录组变化的研究[D].中国农业科学院,2023.张文英.鸡传染性法氏囊病病毒流行病学分析和VP2抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D].中国农业科学院,2023.MahgoubHA.Anoverviewofinfectiousbursaldisease[J].Archivesofvirology,2012,157:2047-2057.AdamsG.Abeginner’sguidetoRT-PCR,qPCRandRT-qPCR[J].TheBio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