基因测序上机操作技师考试试卷及答案

基因测序上机操作技师考试试卷及答案一、填空题（每题1分，共10分）1.基因测序上机常用的荧光标记物类型是______。2.Sanger测序中，终止DNA链延伸的物质是______。3.二代测序文库构建中，DNA片段化常用方法是______（任写一种）。4.测序文库浓度定量常用______（任写一种高精度方法）。5.毛细管电泳分离DNA片段的依据是______。6.三代测序（单分子测序）无需______步骤，可直接读取长片段。7.测序仪开机后首先检查______（任写一种）。8.文库接头连接的目的是______。9.测序数据Q20表示碱基错误率低于______。10.上机操作前需佩戴______避免核酸污染。二、单项选择题（每题2分，共20分）1.以下不属于Sanger测序核心试剂的是？A.模板DNAB.ddNTPC.Taq酶D.磁珠2.Illumina平台测序原理是？A.边合成边测序B.焦磷酸测序C.纳米孔测序D.离子半导体测序3.DNA片段化的目的是？A.增加片段长度B.便于接头连接C.提高PCR效率D.去除杂质4.高精度核酸定量仪器是？A.分光光度计B.QubitC.电泳仪D.离心机5.Sanger测序读长一般是？A.100-200bpB.800-1000bpC.10kb以上D.100kb以上6.PacBio测序的主要优势是？A.成本极低B.读长长C.通量极高D.错误率极低7.上样前文库需进行的处理是？A.煮沸变性B.过滤去杂质C.加蛋白酶KD.乙醇沉淀8.测序数据质控指标不包括？A.GC含量B.读长分布C.实验温度D.Q30比例9.末端修复的目的是？A.产生平末端B.去除5’突出端C.磷酸化3’端D.以上都对10.避免污染的措施不包括？A.分区操作B.无酶水C.戴手套D.增加试剂用量三、多项选择题（每题2分，共20分）1.测序上机前需准备的试剂有？A.测序引物B.酶mixC.染料D.对照模板2.Sanger测序步骤包括？A.模板制备B.测序反应C.毛细管电泳D.数据读取3.二代文库构建关键步骤有？A.片段化B.末端修复C.接头连接D.PCR富集4.测序仪日常维护包括？A.更换毛细管B.清洁光学部件C.温度校准D.补充试剂5.属于三代测序的是？A.PacBioSMRTB.IlluminaNovaSeqC.OxfordNanoporeD.IonTorrent6.测序质控指标有？A.Q20/Q30比例B.读长分布C.污染率D.GC含量7.文库浓度定量方法有？A.QubitB.qPCRC.分光光度计D.琼脂糖电泳8.防交叉污染措施有？A.专用移液器B.试剂分装C.操作后消毒D.戴口罩9.影响测序质量的因素有？A.模板纯度B.文库浓度C.试剂过期D.仪器温度波动10.上机核心环节包括？A.模板/文库制备B.上样C.仪器监控D.初步数据导出四、判断题（每题2分，共20分）1.Sanger测序需要PCR扩增模板。（）2.二代测序读长比三代长。（）3.不同物种文库接头可通用。（）4.Qubit定量比分光光度计准确。（）5.Nanopore可直接读取RNA。（）6.测序仪开机后可立即上样。（）7.ddNTP会终止DNA链延伸。（）8.文库浓度过高影响测序质量。（）9.Q30表示碱基错误率<0.1%。（）10.戴手套即可避免核酸污染。（）五、简答题（每题5分，共20分）1.简述Sanger测序的基本原理。答案：Sanger测序基于双脱氧链终止法。以单链DNA为模板，加入引物、Taq酶、荧光标记dNTP和少量ddNTP（无3’-OH）。当ddNTP掺入延伸链时，链终止，产生不同长度的DNA片段。经毛细管电泳分离后，按长度依次通过检测器，根据末端ddNTP的荧光颜色判断碱基类型，最终得到序列。2.二代文库构建中末端修复的目的是什么？答案：DNA片段化后（如超声破碎）会产生粘性末端或损伤末端，易导致非特异性连接。末端修复通过酶（如T4DNA聚合酶）将片段转化为平末端，并在3’端加A碱基，便于与含T尾的接头连接，同时修复损伤，提高连接效率和文库质量。3.上样前文库需做哪些质量检查？答案：①浓度定量：用Qubit或qPCR测定，确保符合测序仪要求（如1-10nM）；②片段长度：琼脂糖电泳或Bioanalyzer检测，确认在目标范围（如300-500bp）；③纯度：分光光度计检测A260/A280（1.8-2.0为宜），排除杂质污染。4.三代测序（PacBio）的主要优势是什么？答案：①长读长（平均10-15kb，最长2Mb），可覆盖复杂区域（重复序列、结构变异）；②无需PCR，避免偏好性，可直接读取天然DNA/RNA；③环形一致性测序（CCS）降低错误率（从~15%至~0.1%），适合denovo测序、甲基化检测。六、讨论题（每题5分，共10分）1.如何避免测序上机操作中的核酸污染？答案：污染会导致结果偏差，需多环节防控：①分区操作：试剂准备、样本处理、测序区严格分开；②试剂耗材：用无酶、无核酸污染的产品，试剂分装避免反复冻融；③个人防护：戴无粉手套、口罩，更换手套避免交叉；④操作规范：专用移液器，吸样不碰管壁，样本开盖立即操作；⑤清洁消毒：用DNA酶清除剂擦拭台面、仪器，定期换过滤芯。2.影响二代测序数据质量的常见因素有哪些？答案：①文库质量：片段化不均、接头污染、浓度过高/过低；②模板纯度：含蛋白、RNA等杂质；③试剂问题：酶失活、dNTP过期；④仪器状态：温度波动、光学部件污染、毛细管堵塞；⑤操作失误：上样量错误、未过滤杂质、PCR过度扩增。需通过质控、仪器维护、规范操作降低影响。答案部分一、填空题1.四种荧光标记dNTP2.ddNTP3.超声破碎（或酶切）4.Qubit（或qPCR）5.长度（分子量）6.PCR扩增7.试剂充足性（或仪器状态）8.使片段与测序芯片结合9.1%10.无粉手套二、单项选择题1.D2.A3.B4.B5.B6.B7.