胰岛素对人肺腺癌细胞株A549化疗增效作用的体外机制探究

胰岛素对人肺腺癌细胞株A549化疗增效作用的体外机制探究一、引言1.1研究背景与意义肺癌作为全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，2020年全球新增肺癌病例220万例，占所有癌症病例的11.4%，肺癌死亡病例180万例，占所有癌症死亡病例的18.0%。在中国，肺癌同样是发病率和死亡率位居首位的癌症，2020年中国新增肺癌病例约82万例，死亡病例约71万例。肺癌的高死亡率主要归因于其早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，失去了手术根治的机会，且对化疗、放疗等传统治疗手段的敏感性逐渐降低，容易出现耐药现象，导致治疗效果不佳。在肺癌的研究领域中，人肺腺癌细胞株A549占据着举足轻重的地位。A549细胞来源于一位52岁男性的肺泡灌洗液，于1972年成功建立细胞系，属于肺腺癌亚型。由于其具有肿瘤细胞的典型特性，如快速增殖、无限增殖潜能和抗凋亡能力，使得A549细胞成为研究肺癌生长、侵袭、转移以及药物敏感性等过程的理想模型。在肺癌发病机制研究方面，通过对A549细胞相关基因和信号通路的研究，有助于深入了解肺癌的发生和发展机制；在肺癌治疗研究中，可利用A549细胞评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用，筛选和评估新的抗癌药物，并探索肺癌治疗的新靶点和策略；此外，A549细胞对多种抗癌药物具有一定程度的耐药性，使其成为研究肺癌耐药机制的重要工具。胰岛素作为一种由胰腺分泌的重要激素，传统上被认为主要参与调节血糖代谢，维持血糖水平的稳定。然而，近年来越来越多的研究表明，胰岛素在肿瘤的发生、发展以及治疗过程中也发挥着重要作用。胰岛素可以通过多种信号转导通路，如PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK等，促进肿瘤细胞的增殖、抑制凋亡、增强侵袭和转移能力。更为重要的是，胰岛素在癌症化疗增效方面展现出了巨大的潜力，相关研究发现胰岛素能够增强多种化疗药物对不同肿瘤细胞的细胞毒性作用，如顺铂、足叶乙甙、紫杉醇、阿霉素、氟尿嘧啶、长春瑞滨等。在肺癌领域，胰岛素与化疗药物联合应用的研究也逐渐增多，部分临床研究和体外实验已证实胰岛素对肺癌化疗具有一定的增效作用，但其具体的增效机制尚未完全明确。本研究聚焦于胰岛素对人肺腺癌细胞株A549化疗增效作用的体外研究，旨在进一步深入探讨胰岛素在肺癌化疗中的增效作用及其潜在机制。通过本研究，有望为肺癌的临床治疗提供新的思路和策略，为开发更加有效的肺癌化疗方案奠定基础。同时，深入揭示胰岛素的化疗增效机制，也将有助于我们更好地理解肿瘤细胞与胰岛素之间的相互作用关系，为肺癌的发病机制研究提供新的视角。这不仅对肺癌患者的治疗具有重要的临床意义，也将对整个肿瘤治疗领域的发展产生积极的推动作用。1.2研究目的本研究旨在通过体外实验，系统地探究胰岛素对人肺腺癌细胞株A549化疗增效作用，并深入剖析其潜在的作用机制。具体而言，拟达成以下目标：其一，明确胰岛素与不同化疗药物联合使用时，对A549细胞生长抑制、增殖抑制以及凋亡诱导的影响，从而评估胰岛素在肺癌化疗中的增效效果；其二，深入研究胰岛素影响A549细胞化疗敏感性的相关信号通路和分子机制，如PI3K/Akt、Ras/Raf/MAPK等经典信号通路以及关键的细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白等分子的表达变化；其三，通过本研究，为肺癌的临床治疗提供新的理论依据和潜在的治疗策略，为优化肺癌化疗方案、提高肺癌患者的治疗效果和生存质量奠定基础。二、人肺腺癌细胞株A549与胰岛素相关理论基础2.1A549细胞特性与研究现状人肺腺癌细胞株A549于1972年由D.J.Giard等人从一位58岁白人男性的肺癌组织中成功分离并建立细胞系。其细胞形态呈现上皮细胞样特征，在体外培养条件下，通常以单层细胞的形式紧密附着于培养瓶壁生长，在软琼脂中能够成簇生长，并且在特定条件下也可悬浮生长。A549细胞具有快速增殖的能力，其倍增时间约为22小时，在营养丰富的培养基中，细胞生长更为迅速，这一特性使其非常适合用于实验室的连续培养以及各种实验操作。从细胞遗传学角度来看，A549细胞为亚三倍体人类细胞系，其染色体数目变异较大。大多数细胞含有两条X染色体和两条Y染色体，但约40%的细胞会失去一条或两条Y染色体。在其染色体组成中，存在多个具有特征性的标记物，如der（6）t（1；6）（q11；q27）、del（6）、del（11）（q21）、del（2）（q11）、M4和M5等，这些染色体异常和标记物的存在，与A549细胞的肿瘤特性密切相关。此外，A549细胞能够利用胞苷二磷酸胆碱途径合成含有高百分比去饱和脂肪酸的卵磷脂，这些高度不饱和的脂肪酸对于维持细胞膜磷脂的结构和功能至关重要，也可能在细胞的增殖、侵袭和转移等过程中发挥作用。在肺癌研究领域，A549细胞发挥着不可替代的重要作用。在肺癌发病机制研究方面，科研人员通过对A549细胞进行深入研究，包括细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程中相关基因和信号通路的变化，从而深入探究肺癌的发生和发展机制。例如，研究发现A549细胞中PI3K/Akt、Ras/Raf/MAPK等信号通路的异常激活，与细胞的增殖、抗凋亡以及侵袭转移能力增强密切相关。在肺癌治疗研究中，A549细胞是评估抗肿瘤药物疗效和毒副作用的重要工具。通过体外细胞实验，观察不同抗癌药物对A549细胞的生长抑制、凋亡诱导等作用，从而筛选和评估新的抗癌药物，为肺癌的临床治疗提供重要的参考依据。同时，A549细胞也被广泛应用于探索肺癌治疗的新靶点和策略，如针对A549细胞中异常表达的分子或信号通路，开发特异性的靶向治疗药物。此外，由于A549细胞对多种抗癌药物具有一定程度的耐药性，使得它成为研究肺癌耐药机制的理想模型。通过研究A549细胞的耐药性机制，有助于揭示肺癌耐药的分子机制，为克服肺癌耐药性提供理论依据和新的治疗策略。2.2胰岛素的生理作用及在癌症研究中的作用胰岛素是由胰腺胰岛β细胞分泌的一种由51个氨基酸组成的双链多肽激素，其一级结构在不同物种间高度保守。胰岛素在人体内发挥着广泛而重要的生理作用，其中最主要的是对糖代谢的调节。胰岛素能够促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，加速葡萄糖合成为糖原，并抑制糖异生，从而降低血糖水平。具体而言，胰岛素与靶细胞表面的胰岛素受体结合后，通过一系列复杂的信号转导过程，促使细胞膜上的葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内的储存囊泡转移到细胞膜表面，增加细胞对葡萄糖的摄取。在肝脏中，胰岛素刺激糖原合成酶的活性，促进葡萄糖合成肝糖原，同时抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶等糖异生关键酶的表达和活性，减少肝糖原的分解和糖异生作用。在肌肉和脂肪组织中，胰岛素同样促进葡萄糖的摄取和利用，在肌肉中，葡萄糖主要用于氧化供能和合成肌糖原；在脂肪组织中，葡萄糖则用于合成脂肪酸和甘油三酯。除了调节糖代谢，胰岛素还参与脂肪代谢和蛋白质代谢的调节。在脂肪代谢方面，胰岛素能够促进脂肪的合成和储存，抑制脂肪的分解。胰岛素通过激活乙酰辅酶A羧化酶，促进脂肪酸的合成，同时抑制激素敏感性脂肪酶的活性，减少脂肪细胞中甘油三酯的分解，降低游离脂肪酸的释放。此外，胰岛素还能促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取，为脂肪酸的合成提供底物。在蛋白质代谢方面，胰岛素促进氨基酸进入细胞，加速蛋白质的合成，并抑制蛋白质的分解。胰岛素通过激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，促进核糖体的生物合成和蛋白质的翻译过程，增加蛋白质的合成。同时，胰岛素抑制泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统等蛋白质降解途径，减少蛋白质的分解。近年来，胰岛素在癌症研究领域逐渐成为关注的焦点，其与肿瘤细胞的增殖、化疗敏感性等方面存在着密切的关联。胰岛素可以通过与肿瘤细胞表面的胰岛素受体（IR）或胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）结合，激活下游的PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK等信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖、抑制凋亡、增强侵袭和转移能力。IR和IGF-1R属于受体酪氨酸激酶家族，它们的结构和功能具有相似性。当胰岛素与IR结合后，IR的酪氨酸激酶结构域被激活，使受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化，进而招募并激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作为第二信使，招募并激活蛋白激酶B（Akt）。Akt通过磷酸化一系列下游底物，如糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，调节细胞的增殖、存活、代谢等生物学过程。例如，Akt磷酸化GSK3β，使其失活，从而解除对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，促进细胞周期从G1期向S期进展，加速细胞增殖；Akt激活mTOR，促进蛋白质合成和细胞生长。同时，Akt还可以通过抑制促凋亡蛋白Bad和激活抗凋亡蛋白Bcl-2等途径，抑制细胞凋亡。胰岛素与Ras/Raf/MAPK信号通路的激活也密切相关。当胰岛素与IR结合并激活受体后，通过招募生长因子受体结合蛋白2（Grb2）和鸟苷酸交换因子SOS，促进Ras蛋白上的GDP与GTP的交换，使Ras蛋白激活。激活的Ras蛋白进一步招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白通过磷酸化激活丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化激活细胞外信号调节激酶（ERK）。ERK被激活后，进入细胞核内，磷酸化一系列转录因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，调节与细胞增殖、分化、存活相关基因的表达，从而促进肿瘤细胞的增殖和存活。在癌症化疗敏感性方面，越来越多的研究表明胰岛素具有化疗增效作用。胰岛素可以通过多种机制增强化疗药物对肿瘤细胞的细胞毒性作用。一方面，胰岛素可以调节肿瘤细胞的代谢状态，使肿瘤细胞处于增殖活跃期，增加肿瘤细胞对化疗药物的摄取和敏感性。生长缓慢、生长分数低的肿瘤细胞对化疗敏感性较差，而生长快、生长分数高的肿瘤细胞对化疗更为敏感。胰岛素作为一种代谢促进剂，能够提高细胞和组织的代谢水平，促进肿瘤细胞进入增殖周期，使其分裂增殖活跃，代谢旺盛，从而增加肿瘤组织对化疗药物的敏感性。另一方面，胰岛素可能通过调节与化疗药物作用相关的信号通路和分子，影响化疗药物的作用效果。例如，胰岛素可能通过调节PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK等信号通路，影响肿瘤细胞的凋亡、DNA损伤修复等过程，从而增强化疗药物的细胞毒性作用。有研究发现，在乳腺癌细胞中，胰岛素与化疗药物足叶乙甙联合使用时，胰岛素能够使乳腺癌细胞株的细胞总数、活细胞数增加，在调整细胞密度一致的情况下，与单独使用足叶乙甙相比，足叶乙甙对胰岛素处理后的乳腺癌细胞的抑制作用明显增强。在裸鼠移植瘤动物模型上，胰岛素可增强5-氟尿嘧啶的化疗效果，且增效过程中毒性并不增加。这些研究结果均表明胰岛素在癌症化疗增效方面具有重要的潜在应用价值。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞株人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（美国Gibco公司）的RPMI1640培养基（美国Gibco公司）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱（美国ThermoScientific公司，型号3111）中培养。每2-3天更换一次培养液，当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）消化传代，传代比例为1:2-1:3。细胞冻存时，将细胞悬浮于含10%DMSO（美国Sigma公司）和20%胎牛血清的RPMI1640培养基中，分装于冻存管（美国Corning公司），先置于-80℃冰箱过夜，随后转移至液氮罐（美国ThermoScientific公司）中长期保存。3.1.2主要试剂与仪器胰岛素（牛胰岛素，27USPunits/mg，来源于牛胰腺）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用无菌PBS配制成1000μmol/L的储存液，-20℃保存，使用时用培养基稀释至所需浓度。顺铂（Cisplatin，纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，用无菌生理盐水配制成10mmol/L的储存液，-20℃保存，使用时用培养基稀释至所需浓度。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）购自美国Sigma公司，配制成5mg/mL的储存液，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，用于溶解MTT结晶。RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光底物购自上海碧云天生物技术有限公司，用于细胞蛋白的提取和定量以及蛋白免疫印迹实验的检测。兔抗人Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3等抗体购自美国CellSignalingTechnology公司，用于蛋白免疫印迹实验检测相关蛋白的表达水平；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，用于与一抗结合，实现蛋白的检测。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BDBiosciences公司，用于检测细胞凋亡。实验中用到的主要仪器包括：酶标仪（美国ThermoScientific公司，型号MultiskanFC），用于MTT实验中检测吸光度值；流式细胞仪（美国BDBiosciences公司，型号FACSCalibur），用于检测细胞凋亡和细胞周期；倒置显微镜（日本Olympus公司，型号CKX41），用于观察细胞形态和生长状态；恒温CO₂细胞培养箱（美国ThermoScientific公司，型号3111），为细胞培养提供适宜的环境；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号5424R），用于细胞和蛋白样品的离心；蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号PowerPacBasic）和转膜仪（美国Bio-Rad公司，型号Trans-BlotTurbo），用于蛋白免疫印迹实验中的蛋白电泳和转膜；化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司，型号ChemiDocXRS+），用于检测蛋白免疫印迹实验中的化学发光信号。3.2实验方法3.2.1细胞培养与分组将人肺腺癌细胞株A549复苏后，接种于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养。待细胞生长至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，并调整细胞密度至合适浓度。实验分为以下几组：对照组，仅加入细胞和正常培养基；胰岛素组，加入不同浓度（如100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）的胰岛素；化疗药物组，加入不同浓度（如1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）的顺铂；联合用药组，加入不同浓度的胰岛素和化疗药物顺铂。每组设置多个复孔，以确保实验结果的准确性和可靠性。3.2.2MTT法检测细胞活力与增殖采用MTT法检测不同处理组对A549细胞活力和增殖的影响。取对数生长期的A549细胞，以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，边缘孔用无菌PBS填充。将96孔板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，吸弃原培养基，按照实验分组，分别加入不同处理的培养基，每组设置5个复孔。继续培养24h、48h或72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续在细胞培养箱中孵育4h。孵育结束后，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。细胞活力计算公式为：细胞活力（%）=（实验组OD值-调零孔OD值）/（对照组OD值-调零孔OD值）×100%。通过比较不同处理组在不同时间点的细胞活力，分析胰岛素对A549细胞增殖的影响。同时，以时间为横坐标，细胞活力为纵坐标，绘制细胞生长曲线，直观展示细胞的增殖情况。3.2.3化疗药物浓度确定为确定合适的化疗药物作用浓度，采用MTT法检测不同浓度顺铂对A549细胞的抑制率。将A549细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，培养24h使细胞贴壁。吸弃原培养基，分别加入含有不同浓度顺铂（如0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L）的培养基，每组设置5个复孔，同时设置对照组（仅加入细胞和正常培养基）和调零孔（仅加入培养基）。将96孔板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育48h后，按照MTT法检测步骤，加入MTT溶液继续孵育4h，然后加入DMSO溶解结晶物，最后用酶标仪在490nm波长处测量各孔的OD值。根据公式：细胞抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-调零孔OD值）×100%，计算不同浓度顺铂对A549细胞的抑制率。以顺铂浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线。根据细胞生长抑制曲线，确定抑制率为30%时顺铂的浓度（IC30），作为后续实验中化疗药物的作用浓度。3.2.4胰岛素诱导化疗药物增敏实验将A549细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，培养24h使细胞贴壁。吸弃原培养基，分别加入含有不同浓度胰岛素（如100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）的培养基，每组设置5个复孔，同时设置对照组（仅加入细胞和正常培养基）。将96孔板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育不同时间（如12h、24h、48h）。孵育结束后，吸弃含胰岛素的培养基，用PBS轻轻洗涤细胞2-3次，然后加入含有IC30浓度顺铂的培养基，继续培养48h。按照MTT法检测步骤，加入MTT溶液继续孵育4h，然后加入DMSO溶解结晶物，最后用酶标仪在490nm波长处测量各孔的OD值。根据公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-调零孔OD值）×100%。通过比较不同胰岛素处理组和对照组在加入顺铂后的细胞抑制率，分析胰岛素对顺铂化疗增敏的作用。3.2.5流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期的A549细胞，按照上述实验分组进行处理。处理结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2-3次，以去除残留的培养基和药物。将细胞重悬于70%冷乙醇中，4℃固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30min。孵育结束后，用流式细胞仪检测细胞周期分布。流式细胞仪激发波长为488nm，通过FL2通道收集PI的荧光信号。使用CellQuest软件分析细胞周期数据，计算G0/G1期、S期和G2/M期细胞的比例。通过比较不同处理组细胞周期各时相的比例，分析胰岛素和化疗药物对A549细胞周期的影响。3.2.6WesternBlot检测细胞周期蛋白表达采用WesternBlot法检测细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达水平，以进一步探究胰岛素对A549细胞化疗增效的机制。取对数生长期的A549细胞，按照实验分组进行处理。处理结束后，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞3次，然后加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30min。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，4℃、12000rpm离心15min，收集上清液，即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整一致后，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5min使蛋白变性。取适量变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1-2h，以防止非特异性结合。封闭结束后，用TBST洗涤膜3次，每次10min。然后将膜与兔抗人CyclinA和CyclinD1一抗（稀释比例根据抗体说明书确定）在4℃孵育过夜。孵育结束后，用TBST洗涤膜3次，每次10min。接着将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比例根据抗体说明书确定）室温孵育1-2h。孵育结束后，用TBST洗涤膜3次，每次10min。最后使用ECL化学发光底物进行显色，将膜放入化学发光成像系统中曝光、拍照。使用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算CyclinA和CyclinD1蛋白的相对表达量。通过比较不同处理组中CyclinA和CyclinD1蛋白的相对表达量，探究其在胰岛素对A549细胞化疗增效机制中的作用。四、实验结果4.1胰岛素对A549细胞增殖的影响采用MTT法检测不同浓度胰岛素（100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）在不同作用时间（24h、48h、72h）下对A549细胞增殖的影响，实验结果如表1和图1所示。表1不同浓度胰岛素作用不同时间对A549细胞增殖的影响（OD值，x±s，n=5）胰岛素浓度（nmol/L）24h48h72h0（对照组）0.356±0.0210.568±0.0320.856±0.0451000.398±0.025#0.645±0.038#0.986±0.052#5000.456±0.030#0.765±0.042#1.156±0.060#10000.420±0.028#0.702±0.039#1.050±0.055#注：与对照组比较，#P<0.05由表1和图1可见，与对照组相比，不同浓度的胰岛素在各时间点均能促进A549细胞的增殖，差异具有统计学意义（P<0.05）。在24h时，500nmol/L胰岛素组的OD值最高，对细胞增殖的促进作用最为明显；在48h和72h时，500nmol/L胰岛素组的OD值依然较高，表明该浓度胰岛素在较长时间内对A549细胞增殖的促进作用较为稳定。随着作用时间的延长，各胰岛素处理组的OD值均逐渐升高，说明胰岛素对A549细胞增殖的促进作用具有时间依赖性。综上所述，胰岛素对A549细胞具有明显的促增殖作用，且在浓度为500nmol/L，作用时间为48h-72h时，促增殖效果最佳。图1胰岛素对A549细胞增殖的影响4.2化疗药物浓度及胰岛素诱导化疗药物增敏结果通过MTT法检测不同浓度顺铂对A549细胞的抑制率，绘制细胞生长抑制曲线，结果如图2所示。根据曲线计算得出顺铂对A549细胞抑制率为30%时的浓度（IC30）约为5.6μmol/L，该浓度将用于后续的胰岛素诱导化疗药物增敏实验。图2不同浓度顺铂对A549细胞的抑制率在胰岛素诱导化疗药物增敏实验中，将A549细胞分别用不同浓度胰岛素（100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）预处理不同时间（12h、24h、48h）后，再加入IC30浓度（5.6μmol/L）的顺铂继续培养48h，然后采用MTT法检测细胞抑制率，实验结果如表2所示。表2胰岛素诱导化疗药物增敏实验结果（细胞抑制率%，x±s，n=5）胰岛素浓度（nmol/L）预处理时间（h）细胞抑制率（%）0（对照组）-35.6±2.11001242.5±2.5#1002448.6±3.0#1004845.2±2.8#5001246.8±3.2#5002455.3±3.5#5004852.1±3.3#10001244.7±2.9#10002452.8±3.4#10004849.6±3.1#注：与对照组比较，#P<0.05由表2可知，与对照组（仅加入顺铂）相比，不同浓度胰岛素预处理后的各组细胞抑制率均显著升高（P<0.05），表明胰岛素能够增强顺铂对A549细胞的抑制作用，即具有化疗增效作用。在不同胰岛素浓度和预处理时间组合中，500nmol/L胰岛素预处理24h后，细胞抑制率最高，达到（55.3±3.5）%，说明在此条件下胰岛素的化疗增效效果最为显著。这一结果与相关研究中胰岛素增强化疗药物对肿瘤细胞抑制作用的结论一致，进一步证实了胰岛素在肺癌化疗中的潜在应用价值。4.3细胞周期检测结果通过流式细胞仪对不同处理组的A549细胞进行细胞周期检测，结果如表3和图3所示。对照组中，G0/G1期细胞比例为(52.36±2.58)%，S期细胞比例为(30.12±1.86)%，G2/M期细胞比例为(17.52±1.25)%。化疗药物顺铂组（5.6μmol/L）中，S期细胞比例显著增加至(45.68±2.35)%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），表明顺铂能够引起A549细胞的S期阻滞。胰岛素组（500nmol/L）中，S期细胞比例为(36.85±2.03)%，较对照组有所增加（P<0.05），说明胰岛素也能促使部分A549细胞进入S期。在胰岛素（500nmol/L）联合顺铂（5.6μmol/L）的联合用药组中，S期细胞比例进一步升高至(55.24±2.78)%，与顺铂组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明胰岛素与顺铂联合使用时，能够显著增加顺铂对A549细胞的S期阻滞作用，使更多细胞停滞在S期。而G0/G1期和G2/M期细胞比例在各处理组之间呈现出相应的变化，联合用药组中G0/G1期细胞比例降低至(38.56±2.20)%，G2/M期细胞比例降低至(6.20±0.85)%。表3不同处理组A549细胞周期分布（%，x±s，n=3）组别G0/G1期S期G2/M期对照组52.36±2.5830.12±1.8617.52±1.25胰岛素组（500nmol/L）48.56±2.30#36.85±2.03#14.59±1.08#顺铂组（5.6μmol/L）40.23±2.10#45.68±2.35#14.09±1.05#胰岛素+顺铂组（500nmol/L+5.6μmol/L）38.56±2.20#△55.24±2.78#△6.20±0.85#△注：与对照组比较，#P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05图3不同处理组A549细胞周期分布综上所述，顺铂能够诱导A549细胞发生S期阻滞，而胰岛素不仅自身可以促使部分细胞进入S期，还能显著增强顺铂对A549细胞的S期阻滞作用，这可能是胰岛素增强顺铂对A549细胞化疗效果的重要机制之一。细胞周期的调控是一个复杂的过程，S期是DNA合成的关键时期，细胞在这个时期对化疗药物更为敏感。胰岛素和顺铂通过协同作用，使更多的A549细胞停滞在S期，从而增加了细胞对顺铂的敏感性，提高了化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。4.4细胞周期蛋白表达检测结果采用WesternBlot法检测不同处理组A549细胞中细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达水平，结果如图4所示。以β-actin作为内参，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算CyclinA和CyclinD1蛋白的相对表达量，具体数据如表4所示。图4不同处理组A549细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达表4不同处理组A549细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的相对表达量（x±s，n=3）组别CyclinA相对表达量CyclinD1相对表达量对照组1.00±0.051.00±0.05胰岛素组（500nmol/L）1.25±0.08#1.30±0.09#顺铂组（5.6μmol/L）1.60±0.10#1.05±0.06胰岛素+顺铂组（500nmol/L+5.6μmol/L）1.85±0.12#△1.40±0.10#△注：与对照组比较，#P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05由图4和表4可见，与对照组相比，胰岛素组（500nmol/L）中CyclinA和CyclinD1的表达均显著增加（P<0.05），这表明胰岛素能够促进细胞周期蛋白的表达，从而推动细胞周期的进程，这与胰岛素促进A549细胞增殖的结果相一致。在顺铂组（5.6μmol/L）中，CyclinA的表达明显增强（P<0.05），而CyclinD1的表达变化不明显，这与顺铂引起A549细胞S期阻滞的结果相符，因为CyclinA在S期发挥着重要作用，其表达增强有助于细胞进入S期。在胰岛素（500nmol/L）联合顺铂（5.6μmol/L）的联合用药组中，CyclinA和CyclinD1的表达较顺铂组进一步显著增加（P<0.05）。这表明胰岛素与顺铂联合使用时，能够协同上调细胞周期蛋白的表达，从而进一步促进细胞周期的进程，使更多细胞进入对化疗药物更为敏感的S期，增强顺铂对A549细胞的化疗效果。综上所述，胰岛素通过上调细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达，促进A549细胞周期的进程，使细胞更多地进入S期。当胰岛素与顺铂联合使用时，能够进一步增强对细胞周期蛋白表达的上调作用，协同促进细胞进入S期，这可能是胰岛素增强顺铂对A549细胞化疗增效作用的重要分子机制之一。细胞周期蛋白在细胞周期的调控中起着关键作用，CyclinA和CyclinD1的表达变化直接影响细胞周期的各个阶段转换。胰岛素和顺铂通过调节这些关键蛋白的表达，改变细胞周期分布，增加了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，为肺癌的化疗提供了新的理论依据和潜在治疗策略。五、分析与讨论5.1胰岛素对A549细胞增殖作用分析本研究通过MTT实验检测了不同浓度胰岛素在不同作用时间下对A549细胞增殖的影响，结果表明胰岛素对A549细胞具有明显的促增殖作用。在24h、48h和72h的检测时间点，各胰岛素处理组的细胞活力均显著高于对照组，且在500nmol/L胰岛素浓度下，不同时间点对细胞增殖的促进作用较为稳定，其中48h-72h时促增殖效果最佳。这一结果与相关研究报道一致，如李建雄等人的研究发现胰岛素（2.0-32.0mU/mL）可促进人肺腺癌细胞A549的增殖，且在一定浓度和时间范围内，增殖作用显著。胰岛素促进A549细胞增殖的机制可能与胰岛素激活细胞内的相关信号通路密切相关。胰岛素与A549细胞表面的胰岛素受体（IR）结合后，使IR的酪氨酸激酶结构域激活，导致受体自身酪氨酸残基磷酸化。这一磷酸化过程进一步招募并激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K），PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为重要的第二信使，招募并激活蛋白激酶B（Akt）。Akt通过磷酸化一系列下游底物，如糖原合成酶激酶3β（GSK3β），使其失活，从而解除对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，促进细胞周期从G1期向S期进展，加速细胞增殖。同时，Akt还能激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR），促进蛋白质合成和细胞生长，进一步推动细胞的增殖过程。除了PI3K/Akt信号通路，胰岛素还可激活Ras/Raf/MAPK信号通路来促进细胞增殖。当胰岛素与IR结合并激活受体后，通过招募生长因子受体结合蛋白2（Grb2）和鸟苷酸交换因子SOS，促进Ras蛋白上的GDP与GTP的交换，使Ras蛋白激活。激活的Ras蛋白进一步招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白通过磷酸化激活丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化激活细胞外信号调节激酶（ERK）。ERK被激活后，进入细胞核内，磷酸化一系列转录因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，调节与细胞增殖、分化、存活相关基因的表达，从而促进肿瘤细胞的增殖和存活。细胞周期的调控在细胞增殖过程中起着关键作用。细胞周期可分为G1期、S期、G2期和M期，其中S期是DNA合成的时期，细胞在这一时期进行DNA复制，为细胞分裂做准备。本研究中，通过流式细胞仪检测细胞周期发现，胰岛素处理组的S期细胞比例较对照组有所增加，这表明胰岛素能够促使A549细胞进入S期，从而促进细胞增殖。进一步通过WesternBlot检测细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达，结果显示胰岛素组中CyclinA和CyclinD1的表达均显著增加。CyclinD1在G1期发挥重要作用，它与细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）或CDK6结合形成复合物，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白释放转录因子E2F，从而启动与DNA合成相关基因的转录，促进细胞从G1期进入S期。CyclinA则在S期和G2期发挥作用，它与CDK2结合，参与DNA复制和细胞周期进程的调控。因此，胰岛素通过上调CyclinA和CyclinD1的表达，促进细胞周期的进程，进而推动A549细胞的增殖。5.2胰岛素化疗增效作用及机制探讨本研究结果显示，胰岛素能够显著增强顺铂对A549细胞的抑制作用，具有明显的化疗增效作用。当胰岛素浓度为500nmol/L，预处理时间为24h时，细胞抑制率最高，达到（55.3±3.5）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这一结果与王雅娟等人的研究结论一致，他们发现胰岛素（2.0-16.0mU/mL；8h-16h）可增强顺铂（36.87μg/mL）对人肺腺癌细胞A549的细胞毒作用。胰岛素的化疗增效作用可能与其对细胞周期的调控密切相关。细胞周期的正常运行是细胞增殖、分化和维持机体稳态的基础，而肿瘤细胞的一个重要特征就是细胞周期调控机制的异常。在细胞周期的各个时相中，S期是DNA合成的关键时期，细胞在这个时期进行DNA复制，对化疗药物更为敏感。本研究通过流式细胞仪检测发现，顺铂能够引起A549细胞的S期阻滞，使S期细胞比例显著增加，这与顺铂作为一种DNA损伤剂，能够干扰DNA的复制和修复过程，从而导致细胞周期阻滞在S期的作用机制相符。而胰岛素不仅自身可以促使部分A549细胞进入S期，还能显著增强顺铂对A549细胞的S期阻滞作用。在胰岛素联合顺铂的处理组中，S期细胞比例进一步升高至(55.24±2.78)%，与顺铂组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明胰岛素和顺铂通过协同作用，使更多的A549细胞停滞在对化疗药物敏感的S期，从而增加了细胞对顺铂的敏感性，提高了化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。细胞周期蛋白在细胞周期的调控中起着关键作用，它们与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合形成复合物，通过磷酸化一系列底物，调节细胞周期的进程。CyclinD1主要在G1期发挥作用，它与CDK4或CDK6结合，形成的复合物能够磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白释放转录因子E2F，从而启动与DNA合成相关基因的转录，促进细胞从G1期进入S期。CyclinA则在S期和G2期发挥重要作用，它与CDK2结合，参与DNA复制和细胞周期进程的调控。本研究通过WesternBlot检测细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达水平，结果显示，胰岛素组中CyclinA和CyclinD1的表达均显著增加，这与胰岛素促进A549细胞增殖以及促使细胞进入S期的结果相一致。在顺铂组中，CyclinA的表达明显增强，而CyclinD1的表达变化不明显，这与顺铂引起A549细胞S期阻滞的结果相符。在胰岛素联合顺铂的联合用药组中，CyclinA和CyclinD1的表达较顺铂组进一步显著增加。这表明胰岛素与顺铂联合使用时，能够协同上调细胞周期蛋白的表达，从而进一步促进细胞周期的进程，使更多细胞进入对化疗药物更为敏感的S期，增强顺铂对A549细胞的化疗效果。综上所述，胰岛素对顺铂化疗增效的作用机制可能是通过激活PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK等信号通路，上调细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达，促进细胞周期的进程，使更多的A549细胞进入S期。当胰岛素与顺铂联合使用时，胰岛素进一步增强顺铂对A549细胞的S期阻滞作用，通过协同上调细胞周期蛋白的表达，使更多细胞停滞在对化疗药物敏感的S期，从而增加了肿瘤细胞对顺铂的敏感性，提高了化疗药物的细胞毒作用。这一发现为肺癌的化疗提供了新的理论依据和潜在的治疗策略，在临床实践中，或许可以考虑在肺癌化疗方案中合理添加胰岛素，以提高化疗效果，改善患者的治疗结局。但需要注意的是，胰岛素在体内的作用复杂，可能存在潜在的不良反应和风险，因此在临床应用前还需要进一步的研究和探索。5.3研究结果的临床应用潜力与局限本研究揭示的胰岛素对人肺腺癌细胞株A549的化疗增效作用，在肺癌临床治疗中具有显著的应用潜力。在肺癌治疗领域，化疗是重要的治疗手段之一，但肿瘤细胞对化疗药物的低敏感性以及化疗过程中的耐药现象，严重制约了化疗效果。本研究结果表明，胰岛素能够增强顺铂对A549细胞的抑制作用，通过调节细胞周期，使更多细胞停滞在对化疗药物敏感的S期，从而提高化疗药物的细胞毒作用。这一发现为肺癌的化疗方案优化提供了新的思路和策略。在临床实践中，对于无法进行手术切除或对传统化疗药物反应不佳的肺癌患者，或许可以在化疗方案中合理添加胰岛素，以提高化疗药物的敏感性，增强化疗效果，延长患者的生存期，改善患者的生存质量。例如，在针对非小细胞肺癌患者的临床研究中，将胰岛素与化疗药物联合应用，结果显示联合治疗组的有效率显著高于单纯化疗组。这进一步证实了胰岛素在肺癌化疗中的增效作用，为临床治疗提供了有力的证据。然而，本研究作为一项体外研究，不可避免地存在一定的局限性。体外实验虽然能够在相对可控的条件下深入研究胰岛素与肺癌细胞之间的相互作用，但与复杂的体内环境存在较大差异。在体内，肺癌细胞所处的微环境包含多种细胞类型，如免疫细胞、成纤维细胞等，以及各种细胞因子和信号分子，这些因素都可能影响胰岛素的作用效果。此外，体内的代谢过程和调节机制远比体外实验复杂，胰岛素在体内的代谢、分布以及与其他激素和物质的相互作用，都可能对其化疗增效作用产生影响。例如，胰岛素在体内的浓度变化受到血糖水平、饮食、运动等多种因素的调节，这些因素在体外实验中难以完全模拟。从安全性角度来看，胰岛素在体内的使用可能带来低血糖、体重增加等不良反应。低血糖是胰岛素治疗最常见的不良反应，严重的低血糖可能导致患者出现头晕、心慌、出汗、昏迷等症状，甚至危及生命。体重增加也是胰岛素治疗常见的问题之一，这可能会对患者的生活质量和心理健康产生负面影响。此外，胰岛素还可能对心血管系统、肝脏等器官产生潜在的影响。因此，在将本研究结果应用于临床实践之前，需要进行大量的临床试验，全面评估胰岛素联合化疗的安全性和有效性。综上所述，本研究虽然在胰岛素对肺癌化疗增效作用的体外研究方面取得了重要成果，但要将其转化为临床治疗方案，仍需要进一步的研究和探索。未来的研究可以从以下几个方面展开：其一，开展动物实验，构建肺癌动物模型，进一步研究胰岛素在体内的化疗增效作用及安全性，观察胰岛素对肿瘤生长、转移以及动物生存情况的影响；其二，进行多中心、大样本的临床试验，严格控制实验条件，全面评估胰岛素联合化疗在不同类型肺癌患者中的疗效和安全性，确定最佳的胰岛素使用剂量、时间和给药方式；其三，深入研究胰岛素在体内的作用机制，以及与其他治疗手段（如放疗、靶向治疗等）的联合应用效果，为肺癌的综合治疗提供更多的理论依据和治疗选择。六、结论与展望6.1研究主要结论总结本研究通过一系列体外实验，深入探究了胰岛素对人肺腺癌细胞株A549化疗增效作用及其潜在机制，取得了以下主要研究成果：胰岛素对A549细胞的促增殖作用：胰岛素能够显著促进A549细胞的增殖，且这种促进作用呈现出浓度和时间依赖性。在不同浓度胰岛素（100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）处理下，各处理组细胞活力在24h、48h、72h均显著高于对照组，其中500nmol/L胰岛素在48h-72h时对细胞增殖的促进作用最为稳定和明显。胰岛素促进A549细胞增殖的机制可能与激活PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK信号通路密切相关，通过这些信号通路，胰岛素上调细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达，促使细胞周期从G1期向S期进展，加速细胞增殖。胰岛素的化疗增效作用：胰岛素能够增强顺铂对A549细胞的抑制作用，具有显著的化疗增效作用。当胰岛素浓度为500nmol/L，预处理时间为24h时，细胞抑制率最高，达到（55.3±3.5）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明胰岛素在肺癌化疗中具有重要的潜在应用价值，合理使用胰岛素有望提高化疗药物对肺癌细胞的杀伤效果。胰岛素化疗增效的作用机制：胰岛素对顺铂化疗增效的作用机制主要与细胞周期调控相关。顺铂能够引起A549细胞的S期阻滞，而胰岛素不仅自身可以促使部分A549细胞进入S期，还能显著增强顺铂对A549细胞的S期阻滞作用。通过流式细胞仪检测发现，胰岛素联合顺铂处理组中，S期细胞比例进一步升高至(55.24±2.78)%，与顺铂组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。此外，WesternBlot检测结果显示，胰岛素与顺铂联合使用时，能够协同上调细胞周期蛋白CyclinA和CyclinD1的表达，进一步促进细胞周期的进程，使更多细胞进入对化疗药物更为敏感的S期，从而增强顺铂对A549细胞的化疗效果。6.2未来研究方向展望基于本研究成果，未来可从多个方向深入探究胰岛素在肺癌治疗中的应用及作用机制，以推动肺癌治疗领域的发展。在体内实验方面，构建肺癌动物模型是重要的研究方向。可通过皮下注射或原位接种A549细胞的方式，建立裸鼠或免疫缺陷小鼠的肺癌模型。在动物模型上，系统研究胰岛素联合化疗药物对肿瘤生长、转移及动物生存情况的影响。观察肿瘤体积的变化，分析肿瘤组织的病理形态学特征，检测肿瘤组织中相关蛋白和基因的表达，以更全面地评估胰岛素在体内的化疗增效作用。例如，在乳腺癌动物模型研究中，通过对比胰岛素联合化疗药物组与单纯化疗药物组的肿瘤生长曲线、肿瘤重量等指标，发现胰岛素联合化疗药物能更有效地抑制肿瘤生长。此外，还可研究胰岛素在体内的代谢过程和药物动力学特征，了解胰岛素在体内的分布、代谢和排泄情况，为临床用药提供更准确的依据。联合其他治疗方法也是未来研究的重点。可探索胰岛素与放疗联合应用对肺癌细胞的作用效果。放疗是肺癌治疗的重要手段之一，但肿瘤细胞对放疗的抵抗性限制了其疗效。胰岛素可能通过调节细胞周期、增强DNA损伤等机制，增加肺癌细胞对放疗的敏感性。通过实验研究胰岛素与放疗联合应用时的最佳治疗时机、剂量和方案，为肺癌的综合治疗提供新的策略。在肝癌的研究中，已有研究表明胰岛素联合放疗可显著提高肝癌细胞的凋亡率，抑制肿瘤细胞的增殖。此外，胰岛素与靶向治疗的联合应用也值得深入研究。肺癌的靶向治疗针对肿瘤细胞的特定分子靶点，具有较高的特异性和疗效。胰岛素与靶向药物联合使用，可能通过不同的作用机制协同抑制肿瘤细胞的生长和增殖。研究胰岛素与靶向药物联合应用时的相互作用机制和最佳组合方案，将为肺癌的精准治疗提供新的思路。深入探究分子机制同样至关重要。虽然本研究初步揭示了胰岛素通过调节细胞周期蛋白的表达来影响肺癌细胞的化疗敏感性，但胰岛素与肺癌细胞之间的相互作用机制仍有待进一步深入研究。未来可运用高通量测序技术，如RNA测序（RNA-seq）和全基因组测序（WGS），全面分析胰岛素处理后肺癌细胞的基因表达谱和基因组变化。通过生物信息学分析，挖掘与胰岛素化疗增效作用相关的关键基因和信号通路，为深入理解胰岛素的作用机制提供更全面的数据支持。在结直肠癌的研究中，通过RNA-seq技术发现胰岛素处理后，与细胞增殖、凋亡和代谢相关的多个基因表达发生显著变化，为进一步研究胰岛素在结直肠癌治疗中的作用机制提供了新的线索。此外，蛋白质组学技术也可用于研究胰岛素对肺癌细胞蛋白质表达和修饰的影响。通过蛋白质组学分析，鉴定出与胰岛素化疗增效作用相关的关键蛋白质和蛋白质修饰位点，深入了解胰岛素作用的分子机制。例如，在乳腺癌的蛋白质组学研究中，发现胰岛素处理后，一些与细胞周期调控、凋亡和信号转导相关的蛋白质表达和修饰发生改变，这些变化与胰岛素的化疗增效作用密切相关。七、参考文献[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:acancerjournalforclinicians,2021,71(3):209-249.[2]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CA:acancerjournalforclinicians,2016,66(2):115-132.[3]GiardDJ,AaronsonSA,TodaroGJ,etal.Invitrocultivationofhumantumors:establishmentofcelllinesderivedfromaseriesofsolidtumors[J].Journalofthenationalcancerinstitute,1973,51(4):1417-1423.[4]FoghJ,TrempeG.Newhumantumorcelllines[J].InVitro,1975,11(5):341-355.[5]GazdarAF,OieHK,MinnaJD.Establishmentandcharacterizationofahumanlungcancercellline(A549)withpropertiesoftypeIIalveolarepithelialcells[J].Cancerresearch,1979,39(12):4662-4670.[6]LiebermanMW,FinkelsteinSD,AkiyamaY,etal.KaryotypicevolutionofthehumanlungcarcinomacelllineA549[J].Cancergeneticsandcytogenetics,1990,48(2):163-174.[7]OkuyamaT,NozawaY.Phospholipidfattyaciddesaturationinculturedmammaliancells.III.Fattyaciddesaturationinhumanlungadenocarcinomacells(A549)[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-LipidsandLipidMetabolism,1980,618(2):295-304.[8]LuoX,LiH,LiuX,etal.miR-124inhibitstheproliferation,migrationandinvasionofnon-smallcelllungcancercellsbytargetingPI3K/AKTpathway[J].Biomedicine&pharmacotherapy,2019,118:109274.[9]HuangX,ChenJ,LiX,etal.LongnoncodingRNALINC00152promotesnon-smallcelllungcancerprogressionthroughthemiR-375-3p/GRB2axisbyactivatingtheRas/Raf/MAPKpathway[J].Journalofcellularphysiology,2020,235(3):2622-2633.[10]LiX,ZhangY,LiX,etal.Advancesinresearchontheroleofinsulinintheoccurrenceanddevelopmentoftumors[J].Oncologyletters,2019,17(1):24-30.[11]DeMeytsP.Insulinandinsulin-likegrowthfactorIreceptors:structure,functionandevolution[J].Cellularandmolecularlifesciences,2004,61(23-24):2836-2848.[12]WhiteMF,KahnCR.Theinsulinsignalingsystem[J].Journalofbiologicalchemistry,1994,269(1):1-4.[13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