实验用猪 第5部分：遗传质量控制编制说明

1上海市地方标准《实验用猪第5部分：遗传质量控制》编制说明本标准于2020年由上海市科委、上海市实验动物标准委员会推荐，获得上海市市场监督管理局的上海市实验猪地标立项支持（沪市监标技〔2020〕304号由上海市农业科学院畜牧兽医研究所、上海实验动物研究中心、中国农业科学院上海兽近年来，相关科研领域对实验动物的需求量呈逐年增长趋势，需求的品种、品系和动物模型种类逐渐丰富，对保障实验质量也提出了更高的要求。随着生物科学和技术的发展，人们对实验研究、鉴定和测试结果的可靠性和精确度的要求愈来愈高。实验动物质量的标准化与否直接影响着科学研究水平的高低，只有实现实验动物标准化，动物试验结果才能够具有均一性、可重复性及可比性。标准的研究制定与发布实施是实验动物标准化的技术措施，是开展实验动物标准化管理的重要依据，也是促进实验动物资源整合优化、开放共享的基础保障。地方标准的发布实施对推动实验动物质量标准化和新资源共享服务、保证动物试验结果可靠性和医用生物材料使用安全性，以及进一步完善我国实验动物标准体系等方面发挥着重要作用。实验动物的环境条件，对动物的健康和质量，以及动物试验结果有着直接的影响，尤其是高等级的实验动物，环境条件要求严格和恒定。因此，制定相关质量控制标准及监测方法，对实验用猪饲养环境和设施进行细化和标准化，才能保证实验用猪的质量，保证生物安全，保证动物试验结果的可靠性和重复性，有利于猪病诊断与治疗、新药研发等应用研究的发展，更好地服务于生物医药、疾病防治等科学技术的研发，从而满足上海市重点规划领域—生物医药的发展需求。然而，实验猪上海市地方标准已经过期，为了保证实验用猪的质量，加快研究重新制定相关地方标准显得尤为迫切。这一地方标准的重新制定，为上海市实验用猪的行政管理提供技术支撑，为上海市实验用猪的生产、使用单位（尤其是医疗单位）提供质控标准，便于器官移植和手术医疗标准和指导，为上海市实验动物管理2部门的监管提供依据，为上海市所有相关单位GLP/GCP平台建设服务，为提升上海所有相关研发机构科研成果转化服务，尤其是非洲猪瘟等重大疫病疫苗研制，需要标准化的猪群进行疫苗生产，预期产值达百亿。家猪虽然在培育、保种及繁殖生产中都有严格的要求，但由于影响遗传变异因素很多，仍存在发生遗传变异和遗传污染的可能，因此需要严格的遗传质量控制，为科学研究提供标准的合格的实验动物，才能确保动物遗传质量符合要求，动物试验结果科学、可靠。动物遗传特性的改变，可导致实验动物本质的变化和实验数据的不稳定，影响研究结果的可信度。遗传监测是定期对动物品系进行遗传检测的一种质量管理制度，其依据是遗传质量标准。遗传监测制度作为实验动物质量控制的根本制度，须严格执行。建立完善实验用猪的遗传质量标准，可以有效地控制实验用猪对动物试验的各种影响因素，有利于满足生物医药研究需要，保证科研教学活动中动物试验的质量，更好地为生物医药、疾病防治等科学技术的发展服务。写工作，初稿发送至起草小组成员讨论。起草小组于2021年12月完成初稿，2022年1月～6月，发送给在沪相关单位进行技术评审，评审专家包括：上海交通大学，上海市农业科学院、复旦大学、上海动物疫病预防控制中心、上海实验动物研究中心、上海开纯洁净有限公司、光明集团、上海沁浓集团、上海祥欣集团、勃林格公司殷格翰有限公司等。汇总意见并修改讨论稿。本标准征求意见稿共发出8份。期间，回函单位有4个，提出书面修改意见的单位有4个，未提出书面修改意见的单况见《征询意见汇总处理表》。2022-2023年因为新冠疫情影响，工作停滞。2024年1月重新启动，于10月形成最终审定稿，建议标准名称改为《实验用猪第5部分：遗传质量控制》，标准起草组根据审定意见对标准送审稿及编制说明进一步修改和完善。本文件规定了实验用猪的繁殖方法、遗传质量监测和结果判定，适用于上海市实验用猪（包括实验用小型猪、实验用引进品种猪、实验用地方品种猪）的遗传质量控制。32主要技术内容2.1封闭群定义参考GB14923-2010《实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制》。以非近亲交配方式进行繁殖生产，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上的种群即为封闭群。2.2繁殖方法规定了实验用猪的繁殖原则和方法。猪繁殖的原则应保持基因的异质性和多态性，要避免近交系数随繁殖代数的增加而过快上升，各家系之间应该采用最佳避免近交法使世代间近交系数上升不超过1%。2.3遗传质量监测规定了猪遗传检测抽样要求、检测方法、监测频率和结果。2.4实验用猪群检测方法确定（一）白香猪种群选育及专用品系的培育巴马香猪是我国优良的猪种资源，其体型小、毛色白，许多生理和生化指标与人类相近，是不可多得的、理想的生物医学实验用猪。为此，本课题组从广西引进该猪群并进行有效的选育，组成了白香猪核心群，经过两个世代后，积累了大量的育种资料，生产了许多符合生物医学实验要求的普通级、清洁级猪，有力地推动了上海的生物医学研究工作。现将本课题组专用品系选用方法、目前拥有的白香猪的种群结构及主要性能情况总结如下。1.1试验猪试验猪为2001年从广西引进的58头（公5头、母53头）巴马香猪及选育的白香猪后代。1.2饲养管理试验猪饲养在光线充足、通风良好的猪舍内，猪圈由墙体和水泥地板构成，种猪舍设有运动场。各生理阶段的香猪采用不同的饲料配方，日粮由精料（玉米粉、麸皮、豆粕等）、青料和粗料组成。种猪日喂两次，并按季节、生长发育和生理阶段等情况适当调整日粮喂量，用自动饮水器保证清洁的饮水。每日清扫猪圈2次，做好防寒保暖和防暑降温工作，定期消毒圈舍。4围，以了解其生长发育状况；测定各世代初产和经产母猪的产仔数、初生窝重、断奶头数、断奶窝重、哺育率等指标，以了解种猪的繁殖性能。建立香猪的种猪系谱档案、种猪生长发育档案、母猪配种产仔档案、防病治病档案，合理地确定猪群周转计划和种群规模，保证白香猪核心群的适度规模。1.3白香猪品系的选育预期目标：培育出适应本地区条件的主要可用于生物医学研究的白香猪品系。核心群白香猪公猪的体型和体重大小不超过引进的巴马香猪，头部和臀部黑毛斑点的面积减少一半以上，其余部位毛色全白，加强对四肢粗壮结实性的选育。核心群白香猪母猪的体型应小于引进的巴马香猪，成年猪的体重降低5%以上，头部和臀部黑毛斑点的面积明显小于巴马香猪，加强对母猪产仔性能的选育。1.3.2选育原理与方法采取个体、家系、后裔综合性能测定技术，实行闭锁的核心群选育方法，群体继代选育。组群方案：组群时保持5个血统，经过测定、统计分析挑选出符合选育要求的公猪5头、母猪38头组成零世代选育（核心）群。选择方案：选择留种公、母猪时，采取2月龄初选、4月龄预选、6月龄复选及第1胎产后再选的方法，具体做法如下：(1)断奶后（2月龄）初选：根据父母的成绩、同窝仔猪的整齐程度和个体的生长发育、体质外形、有无遗传缺陷等进行窝选。(2)4月龄预选：根据仔猪由断奶至4月龄时的生长发育、体质外形进行选择，注意淘汰体重过大的个体。(3)初配前（6月龄）复选：这一阶段是选种的关键时期。凡体质衰弱、肢蹄存在明显疾患、有内翻乳头、体型有严重损征、外阴部特别小、性功能异常、同窝出现遗传缺陷者，可先行淘汰。其余个体按照生长速度、饲料转化率等情况进行选择。淘汰体重过大和过小的个体。(4)第1胎产后哺乳期结束时再选：主要依据个体本身的产仔数和断奶窝重进行选择。此阶段的淘汰率较低。1.3.3性能测定方案测定各世代种猪2月龄、4月龄、6月龄、8月龄、18月龄时的体重、体长、5胸围、体高等生长发育性状；测定各世代初产和经产母猪的总产仔数、产活数、初生个体重、泌乳力、断奶头数和断奶窝重等繁殖性状。在上述测定基础上，建立白香猪后备猪生长发育档案、母猪发情与配种档案、母猪产仔与哺育档案。同时，还建立种猪系谱档案、种猪防疫注射与疫病治疗档案1.3.4交配制度和世代间隔选育群内实行避免全同胞的随机交配与按家系选配相结合的方式交配，进行群体继代选育。允许少数优良种猪的世代重叠。1.3.5营养水平在选育过程中，力求保持每个世代有相对稳定的饲养管理条件，各世代营养水平保持相对一致，以消除环境偏差，提高选择的正确性。白香猪在空怀及妊娠早期采用甲料，妊娠后期及哺乳期采用乙料，公猪料参照乙料。后备种猪采用丙料。甲、乙、丙三种饲料的营养水平见下表。料别消化能（MJ/Kg）粗蛋白质（%）粗纤维（%）钙（%）磷（%）11.3711.223.530.630.52乙料11.7913.083.540.640.53丙料12.054.500.640.551.4近交系数计算1.4.1按白香猪群体的配种，繁殖记录来整理各世代亲缘系谱。1.4.2按系谱用下列公式计算各世代近交系数。Fx=Σ[(1/2)n1+n2+1(1+FA)]1/2：表示各代遗传结构之半数。n1：表示由父亲到共同祖先所经的代数。n2：表示由母亲到共同祖先所经的代数。FA：表示共同祖先本身的近交系数。Σ：表示所有共同祖先计算值加起来。如果共同祖先不是近交所生，则FA=0公式可由进一步简化为：Fx=Σ(1/2)n1+n2+1小群体近交系数为各个家系近交系数的加权平均数：F=(N1Fx1+N2Fx2+……NnFxn)/N6其中F为群体的近交系数。Ni为第i家系（窝）。Fxi为第i家系（窝）的近交系数。2结果与分析2.1白香猪核心群的规模变化2.1.12002年年底时白香猪核心群规模2001年8月底从广西引进巴马香猪58头（公5头、母53头），系2.5~3.5月据产仔和哺育性能确定了5头公猪和38头母猪构成零世代白香猪核心群。零世代种猪于2002年9月至11月又产下第二胎，至2002年年底，又淘汰了3头种母猪。从零世代第一胎后代中选择的3头公猪和31头母猪，于2002年10月至11月组织配种，构成了第1批一世代核心群（记作A1）。至2002年底香猪核心群规模表12002年年底香猪核心群规模零世代种猪一世代种猪（A1）5382.1.22003年年底时白香猪核心群规模在2003年5月至6月，从零世代第二胎中选择的3头公猪和37头母猪进行配种，构成了第2批一世代种猪核心群（记作A2），该批种猪于2003年9月至10月产下第一胎，待年底时根据产仔、哺育性能淘汰了1头公猪和5头母猪。A1核心群种猪于2003年2月至3月、8月至9月分别产下第一胎和第二胎后代，期间淘汰了1头种公猪和3头种母猪。从A1的第一胎后代中选留的3头公猪、27头母猪于2003年9月至10月进行配种繁殖，构成第1批二世代种猪群（记作零世代种猪继续按一年二胎进行繁育，从第三胎起不再从中留种，主要用于生产医学实验用猪。零世代种公猪淘汰2头，种母猪淘汰7头。2003年年底时香猪核心群规模情况见表2。表22003年年底香猪种群规模零世代种猪一世代种猪（A1+A2）二世代种猪（B1）32+2372828+32272.1.32004年7月底白香猪核心群规模2004年3月至4月，由A2核心群种猪的第一胎后代中选留的2头公猪和25头母猪组织配种，构成第2批二世代核心群种猪（记作B2）。淘汰B2核心群公猪1B1核心群种猪于2004年1月至2月产下第一胎，哺乳结束后淘汰1头公猪和4头母猪。零世代种群淘汰4头母猪，A1和A2种群中分别淘汰3头和4头母猪。至2004年7月底，香猪核心群规模及种群年龄结构分别见表3、表4。零世代种猪一世代种猪（A1+A2）二世代种猪（B1+B2）32+22+12425+2823+25表42004年7月白香猪种群年龄结构%%110.002520.00220.002318.401.5~2岁220.002822.402~2.5岁220.002520.002.5~3岁330.002419.20100.00100.002.2白香猪核心群的近交系数2.2.12004年7月底白香猪核心群的近交系数截止2004年7月，白香猪核心群拥有5个家系，零世代、一世代和二世代种公猪共10头，零世代、一世代和二世代种母猪共125头。白香猪核心群总的近交系数为11.264%，各家系的近交系数由于育种目标的不同而有较大差异，E系的近交系数最低，为8.191%；D系的近交系数最高，为14.917%。具体情况见表5。表52004年7月白香猪核心群的近交系数公（%）母（%）合计（%）A1.563（2头）9.903（25头）9.285B1.823（3头）9.684（27头）8.898C8.594（2头）15.182（26头）14.711D15.130（26头）14.917E3.125（2头）8.674（21头）11.26482.2.2各个世代白香猪核心群的近交系数各世代白香猪核心群的近交系数见表6、表7和表8。从表中可见，零世代核心群及各个家系的近交系数均较低，到一世代时近交系数均有一定提高，而根据育种目标，到二世代时近交系数则有大幅度增加。从零世代到一世代，核心群近交系数增量3.629个百分点；从一世代到二世代，核心群近交系数增加16.041个百分点。各家系中C系和D系增幅较大，一世代时分别增加3.156个百分点和5.784个百分点，二世代时分别增加22.345个百分点和16.833个百分点。表6零世代白香猪核心群的近交系数公（%）母（%）合计（%）A01.7601.540B01.6721.463C12.5002.0243.334D12.5002.3183.591E01.8931.6235.0001.9352.328表7一世代白香猪核心群的近交系数公（%）母（%）合计（%）A3.1256.2506.027B3.1254.5684.465C—6.4906.490D9.3759.3759.375E3.1253.4373.4094.6886.0425.957表8二世代白香猪核心群的近交系数公（%）母（%）合计（%）A—18.83718.837B2.34419.76618.182C4.68831.25028.835D—26.20826.208E3.12517.96916.3203.38623.16121.9982.3白香猪核心群种猪的生长发育2.3.1零世代核心群白香猪的体重和体尺零世代白香猪的体重、体长、胸围的测定结果见表9。由表9可知，白香猪生长缓慢，体型小。公、母香猪0~8月龄期间的平均日增9重仅为105.50g/d和113.33g/d；18月龄（接近成年）时，公、母香猪的体重和体长仅分别为38.75kg和89.24cm、44.68kg和93.50cm。表9零世代白香猪的体重、体长和胸围单位：kg、cm月龄体重体长胸围0♂♀50.56±0.040.54±0.04————————2♂♀55.45±0.7735.55±2.7635.83±3.8929.90±3.0229.95±3.654♂♀513.36±0.9813.83±1.8953.72±3.8054.31±5.3548.63±3.9248.78±4.316♂♀520.47±1.7521.64±2.7665.46±4.7367.29±5.9260.12±4.5660.87±4.788♂♀525.92±3.0427.79±3.7869.58±5.3372.07±6.1464.90±5.4765.89±6.09♂♀538.75±4.8144.68±8.7388.24±6.8590.50±9.8780.76±6.9384.41±9.402.3.2一世代、二世代核心群白香猪的体重和体尺一世代和二世代白香猪的体重、体长、胸围的测定结果见表10、表11。表10一世代白香猪的体重、体长和胸围单位：kg、cm月龄体重体长胸围0♂♀60.58±0.030.55±0.04————————2♂♀66.17±0.526.04±0.4136.68±2.7736.16±3.0230.39±2.8030.65±3.144♂♀615.57±0.7215.17±1.3956.83±3.6655.67±5.0550.67±3.8351.03±4.676♂♀622.77±2.3821.63±1.8067.61±4.2566.17±3.5462.03±5.7460.50±4.148♂♀626.85±2.8927.12±2.9770.22±4.7170.31±4.6865.33±5.8865.20±5.13♂438.66±3.7287.84±6.7779.67±6.65♀41.83±6.9190.67±9.1285.30±8.78表11二世代白香猪的体重、体长和胸围单位：kg、cm月龄体重体长胸围0♂♀50.57±0.030.56±0.03————————2♂♀55.75±0.555.52±0.8736.24±2.1036.45±2.3429.21±2.0529.46±2.134♂♀514.96±0.7014.75±1.0754.29±2.5655.37±3.7249.07±2.6750.11±3.096♂♀521.34±1.3221.79±1.7965.98±3.0266.56±3.9559.89±2.8561.34±3.428♂♀426.17±1.5127.45±2.1370.43±3.5871.52±4.2765.05±3.1965.78±3.96从表10和表11中看到，一世代和二世代白香猪各阶段的体重和体尺值与零世代香猪基本一致，仍表现为生长缓慢和体型小的特点。2.4白香猪核心群种猪繁殖性能2.4.1零世代核心群白香猪的繁殖性能测定了零世代白香猪第1至第4胎的产仔数、初生窝重、断奶窝重和哺育率等指标（见表12），结果显示，白香猪的产仔性能不高，各胎次平均产仔数仅为7.55头，平均初生窝重仅为4.20kg；各胎次平均断奶头数也只有6.36头。第一胎时白香猪的各项繁殖指标都较低，第二胎开始明显提高，第三胎起逐渐趋于稳定。表12零世代白香猪的繁殖性能单位：头、胎次产仔数初生窝重断奶头数断奶窝重哺育率15.28±1.463.06±0.954.23±1.3119.03±6.8784.3527.34±1.8526.32±7.7289.713288.83±2.054.84±1.037.60±1.8532.42±7.8592.604269.02±1.974.92±1.207.75±1.8333.15±7.1092.33平均7.55±2.134.20±1.326.36±1.9027.63±7.8189.752.4.2一世代核心群白香猪的繁殖性能一世代核心群白香猪第1至第3胎的产仔数、初生窝重、断奶头数、断奶窝重和哺育率的测定结果见表13。从表13可知，一世代香猪各胎次的产仔数、断奶头数、哺育率等指标均较零世代香猪的对应值高，这与香猪场逐步加强了选种选配和饲养管理工作密切相关。表13一世代白香猪的繁殖性能单位：头、kg、%胎次头数产仔数初生窝重断奶头数断奶窝重哺育率1625.45±1.823.12±0.744.41±1.5318.74±6.6385.202587.61±1.984.28±0.956.47±1.7626.80±6.1891.443538.87±2.104.95±1.077.71±1.8531.23±5.7493.52平均7.31±2.344.12±1.166.20±1.8725.59±6.7590.053.1经过三年研究，制订了选育制度和方案，保持了香猪的矮小、白毛特性，在严格选育和饲养管理基础上香猪的繁殖性能有所提高，已形成10头种公猪和125头种母猪构成的白香猪核心群种群规模，并且该种群具有较合理的年龄结构。3.2为了满足生物医学研究时对实验用小型猪的遗传质量要求，在对白香猪核心群种猪的选育过程中采用一定程度的近亲交配，以提高血统纯合度，因而各家系的近交系数上升较快，特别是C系和D系，一世代时分别上升3.156个百分点和5.784个百分点，到二世代时分别上升了22.345个百分点和16.833个百分点。到2004年7月，白香猪核心群总的近交系数为11.264%，各家系的近交系数以E系最低，为8.191%，D系的近交系数最高，为14.917%。3.3白香猪生长缓慢，成年时体重和体尺值小，这有助于将其开发成为生物医学实113.33g/d；公、母白香猪18月龄时体重和体长仅分别为38.75kg和89.24cm、44.68kg和93.50cm。一世代和二世代白香猪各阶段的体重和体尺值与零世代香猪基本一致，且各项指标的变异系数减小，说明该白香猪群体的生长发育性能较稳定，整齐度正在不断提高。3.4白香猪的产仔性能不高，有待进一步选育提高。零世代各胎次平均产仔数仅为7.55头，平均断奶头数也只有6.36头。虽然经过加强选种选配和饲养管理工作，使一世代白香猪各胎次的产仔数、断奶头数、哺育率等指标均较零世代白香猪的对应值有所提高，但提高的幅度不够大，今后应开展白香猪产仔数主基因方面的研究，在选种实践中运用标记辅助选择等手段来进一步提高该核心群种猪的产仔性能。3、零世代种公猪397号(家系B)4、一世代种公猪421号(家系A)5、一世代种公猪447号(家系D)6、一世代种公猪453号(家系B)7、一世代种公猪475号(家系E)8、二世代种公猪515号(家系C)9、二世代种公猪539号(家系B)EABAEBDBCDEBCBEACDADDCACDCBBABAECEABBDECBEADDCCACDBABBAACBAECBBEDDCECCDDDAAEEBDACEBCDAECBAEDBCAEDDBCDCEABEDCBDABCEADBCDABECAD4结果判定目前我国已发布并实施的实验用猪遗传学质量监测标准均采用了微卫星DNA标记技术。对于繁殖方式为猪群的其他种属实验动物，例如啮齿类实验动物和豚鼠，目前也多采用微卫星标记技术进行猪群遗传概貌的检测和判定。以小鼠为例，研究人员利用筛选出的30个微卫星位点设计引物，对