阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2的急性毒性影响

目录28364摘要 斑马鱼凭借其独特的生物学特性，成为生命科学研究中的重要模式生物REF_Ref7441\r\h[1]。其胚胎透明，便于无创观察从单细胞到器官形成的全过程，为发育生物学研究提供了理想窗口。斑马鱼与人类基因高度同源，尤其在肿瘤和心血管疾病相关基因上相似，能有效模拟人类疾病，助力机制研究和治疗探索REF_Ref3612\r\h[2]。此外，其强繁殖力和易饲养特性，使得大规模遗传筛选和药物测试高效可行，显著降低了研究成本。细胞模型是生命科学研究的核心工具，能在体外模拟细胞微环境，精确调控各种因素，探究细胞生理和病理过程。相比动物实验，细胞模型操作简便、条件可控、重复性强，能加速科研验证。斑马鱼细胞模型结合了遗传优势和培养灵活性，既可体外模拟体内过程，又适合高通量实验，为分子机制研究和医药转化提供了有力支撑REF_Ref3665\r\h[3]。斑马鱼作为重要的模式生物，在药物筛选、基因功能研究和疾病模型等生物医药研究领域应用广泛REF_Ref7637\r\h[4]。其在毒理学、遗传学等方面也有重要作用，使得科研机构、制药企业等对斑马鱼的需求持续稳定增长REF_Ref209\r\h[5]。作为全球范围内使用最广泛的农药之一，阿维菌素的环境释放可能对非靶标生物（如水生脊椎动物）产生潜在风险REF_Ref3841\r\h[6]。阿维菌素（AVM）作为广谱高效的大环内酯类抗生素，广泛应用于农业、畜牧业及水产养殖的寄生虫防治REF_Ref3900\r\h[7]。然而，其对水生生态系统，尤其是水生脊椎动物的潜在风险逐渐受到关注。有研究表明REF_Ref3955\r\h[8]，阿维菌素对多种淡水水生动物具有较强急性毒性。通过换液法对蚤状溞、异育银鲫鱼苗/鱼种、食蚊鱼、鲢鱼苗的实验显示，染毒后（蚤状溞48h，其余96h），死亡率随处理时间延长和药物浓度升高而增加REF_Ref4014\r\h[9]。不同物种对阿维菌素的敏感性存在差异，其中蚤状溞最为敏感（48hLC₅₀=0.00037mg/L，安全浓度0.000037mg/L），异育银鲫鱼苗、食蚊鱼、鲢鱼苗的96hLC₅₀分别为0.018、0.06、0.08mg/L，安全浓度依次为0.0018、0.006、0.008mg/LREF_Ref4014\r\h[9]。斑马鱼作为水生生物学研究中的重要模式生物，也被用于阿维菌素相关研究。有研究REF_Ref4167\r\h[10]通过高含量筛选（HCS）分析来探究阿维菌素对斑马鱼胚胎的影响。结果表明，阿维菌素可诱导早期斑马鱼胚胎出现快速且可逆的活动减退现象。进一步研究发现REF_Ref4229\r\h[11]，用γ-氨基丁酸（GABA）拮抗剂预处理可阻断阿维菌素诱导的活动减退。由于斑马鱼和哺乳动物的离子型GABA受体亚基具有同源性，这暗示阿维菌素对斑马鱼胚胎的神经毒性机制可能与啮齿动物模型甚至人类具有相关性。综上，阿维菌素在水环境中对水生脊椎动物存在急性致死风险与长期神经发育毒性。在生产应用中需充分评估其对水生生态系统的潜在危害，加强监测与管理，以降低生态风险。已有研究表明，阿维菌素可诱导哺乳动物神经细胞凋亡REF_Ref4327\r\h[12]，干扰昆虫细胞的钙离子通道REF_Ref4383\r\h[13]，还能通过氧化应激途径对人源肝细胞造成损伤REF_Ref4445\r\h[14]。然而，现有研究多聚焦于哺乳动物或昆虫的特定细胞系，缺乏对水生生物离体细胞的探索。斑马鱼作为毒理学研究的重要模式生物，其细胞模型在环境污染物毒性评估中展现出独特优势。目前，尚未有关于阿维菌素对斑马鱼离体细胞毒性作用的报道。本文首次以斑马鱼离体细胞为研究对象，深入探究阿维菌素的毒性效应及其潜在作用机制，旨在填补这一领域的研究空白，为全面评估阿维菌素的生态毒性提供新视角，同时为水生生物毒理学研究提供重要数据支撑。1材料与方法1.1试验动物及药品本研究使用的斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2购自国家实验细胞资源共享平台，细胞复苏后经形态学观察及支原体检测后确认无污染，符合实验要求。复苏后的细胞于L-15培养基(Gibco)中进行培养操作，该培养基成分包含10%胎牛血清(上海达特希尔生物科技有限公司)与1%双抗溶液(biosharp)，其中青霉素-链霉素双抗溶液的终浓度达到100U/ML。随后将其放置28摄氏度恒温培养箱中培养，培养基每24-48小时更换一次，均使用新鲜配制的培养基。这一稳定、规范的培养体系，为后续实验的顺利开展奠定了坚实基础。最后选择生长良好的细胞进行铺板和CCK-8检测。阿维菌素（纯度≥98%）购自Sigma公司；CellCountingKit-8(CCK-8)试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司；胰蛋白酶购自Solarbio公司；PBS（磷酸盐缓冲液）购自百哈（上海）生物科技有限公司；细胞培养瓶和96孔细胞培养板均购自LABSELECF。1.2试验分组试验分为空白对照组（未做处理）；药物处理组（5个浓度梯度）：2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、15.0μg/mL、20μg/mL。每组设置3个平行组，调整细胞悬液密度至1x105/mL,然后于96孔板每孔接种200ul细胞悬液。1.3试验过程显微镜下观察当细胞汇合度达到80%-90%范围之际进行细胞铺板。旧培养基需从培养瓶中完全弃除，加入PBS对细胞实施两次轻柔漂洗除去残留培养基。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1毫升后，适度晃动培养瓶，随后置于室温消化2-3min后待所有细胞脱落，立即加入10mL的完全培养基终止消化。将细胞悬液1000r/min离心3min以除去消化液，然后加入5mL完全培养基将细胞重悬浮。之后取10ul细胞悬液进行细胞计数。调整细胞密度至1x105个，将细胞接种至96孔板，每孔200ul。培养24h后，在孔板中加入五个浓度的阿维菌素（2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL）溶液。然后分别在24h和48h后镜检观察细胞形态变化，同时加入CCK-8试剂定量检测细胞活性。1.4斑马鱼胚胎成纤维细胞中CCK-8的测定(原理）斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2在培养箱中孵育24h和48h之后，每孔加入20μlCCK-8试剂，轻轻摇晃混匀后继续避光培养4h。终止培养后，从培养箱中取出96孔板，此时细胞悬液由玫红色变为橙黄色，细胞毒性越大颜色越浅。随后使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度（OD值），并依据公式“（实验组OD值-NC组OD值）/（对照组OD值-NC组OD值）×100％”，计算不同浓度阿维菌素作用下的细胞存活率，进而确定半抑制浓度（IC50）。1.5数据处理与分析检测结束后，运用EXCEL软件对实验数据进行汇总、整理和初步分析。再借助SPSS22.0软件对整理好的数据进行深入分析，并通过GraphPadprism软件作图，用柱状图表示。当P值小于0.05时，被处理的数据被认为有统计学意义，反之无意义。同时，利用GraphPadprism计算细胞存活率（IC50）。2结果与分析2.124h和48h阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2存活率的影响由图1所示，药物作用24h后，斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2活性整体呈下降趋势，随着阿维菌素浓度的升高，细胞活性下降越明显。当药物浓度达到10μg/mL时，细胞活性低于50%，约为43%。当药物浓度达到20μg/mL时，细胞基本全部死亡，活性仅为3%左右。图124h阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞的急性毒性影响由图2所示，药物作用48h后，斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2活性整体也呈下降趋势，随着阿维菌素浓度的升高，细胞活性下降越明显。当药物浓度达到15μg/mL时，细胞活性低于50%，约为31%。当药物浓度达到当药物浓度达到20μg/mL时，细胞基本全部死亡，活性仅为0.4%左右。图248h阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞的急性毒性影响CCK-8结果显示，与对照组相比，不同浓度阿维菌素（2.5、5、10、15、20μg/mL）处理细胞24h后，随着阿维菌素浓度增大，斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2的活力逐渐降低，且呈剂量相关性。24h斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2的IC50为7.396μg/mL（见图3）。图324h阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2存活率的影响与24h相比，48h后细胞活力有所回升，但趋势仍是随着阿维菌素浓度增大，细胞的活力逐渐降低。48h斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2的IC50为11.46μg/mL（见图4）。48h半致死浓度高于24h半致死浓度可能与以下三个原因有关：细胞修复与适应、药物代谢与排出和细胞周期影响。但无论是24h还是48h处理都是随着阿维菌素浓度的增大而活力逐渐降低，所以阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2有明显的抑制作用，并呈现剂量依赖性。图448h阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2存活率的影响2.2阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞形态的影响在细胞形态方面，常指细胞出现变圆、皱缩和破裂，甚至死亡等异常变化。由图3所示，2.5μg/mL：细胞形态基本正常，贴壁良好，只有少量脱落的现象。5.0μg/mL：部分细胞边缘轻微模糊，偶见少量圆形凋亡细胞和皱缩细胞。10.0μg/mL：细胞皱缩明显，贴壁能力下降，胞质内颗粒增多，凋亡细胞比例增加。15.0-20.0μg/mL：大量细胞悬浮，细胞裂解破碎，胞膜完整性破坏。图524h阿维菌素对斑马鱼PAC2细胞形态的影响黑色箭头表示正常细胞状态，白色箭头表示细胞脱落，红色箭头表示细胞皱缩，黄色箭头表示细胞碎片由图4所示，低浓度组（2.5μg/mL）:少数细胞变圆、轻微脱壁。中浓度组（5.0-10.0μg/mL):大量细胞脱落、皱缩，呈悬浮状态；细胞核固缩或破裂（凋亡特征）；未脱落细胞可见线粒体肿胀（光镜下呈空泡样变）。高浓度组（15.0-20.0μg/mL):大部分细胞死亡，呈圆形或碎片状，胞膜破裂，内容物释放；残留贴壁细胞可见核溶解、胞质崩解（坏死特征）；培养上清中悬浮细胞碎片增多。综上可得2.5-5.0μg/mL：低浓度组细胞仅见轻微形态改变；10.0μg/mL及以上：损伤呈剂量依赖性加重，细胞数量显著减少，细胞裂解，细胞碎片增多。图648h阿维菌素对斑马鱼PAC2细胞形态的影响黑色箭头表示正常细胞状态，白色箭头表示细胞脱落，红色箭头表示细胞皱缩，黄色箭头表示细胞碎片3分析与结论3.1斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2通过CCK-8对存活率变化的分析阿维菌素最开始是一种兽药，后面在水生生物三文鱼中被开发来治疗鱼虱等寄生虫，但其对于鱼类的副作用正在被日渐关注。有研究报道REF_Ref542\r\h[15]阿维菌素对昆明裂腹鱼幼鱼96h的半致死浓度为0.0122mg/L，表现为中毒现象，鱼体可见，在水体底部发生侧翻现象，初期阶段，游动行为偶有发生；随着时间推移，仅鳃盖部位保持运动状态，耐受性较强，持续时间较为持久。另一个研究报道REF_Ref672\r\h[16]指出阿维菌素对江黄颡鱼的24和48h半致死浓度分别为0.43mg/L和0.28mg/L。因此，在水生生态系统中，阿维菌素对水生动物尤其是鱼类存在毒性作用，它对于非标靶生物的毒性具有重要的生产意义。李兴洋等REF_Ref813\r\h[17]研究中阿维菌素会致使鱼类多个器官的组织学发生变化，像在脑部、肾脏以及鳃部出现退行性改变。不同种属的鱼类对阿维菌素的敏感性存在明显差异，部分鱼类对阿维菌素极为敏感，低浓度的阿维菌素就可能对其生存与健康构成严重威胁REF_Ref4014\r\h[9]。向阳等REF_Ref4775\r\h[18]的研究表明阿维菌素对鱼类的毒性存在着种属差异，对不同类别水生生物的急性毒性也存在着明显的差异；对水生节肢动物中的枝角类毒性最大，而对克氏原螯虾、日本沼虾等的毒性相对较小。在水产养殖中，若阿维菌素使用不当，极有可能对养殖鱼类造成灾难性后果，导致经济损失。在李清雪等人REF_Ref4873\r\h[19]的研究中，观察到随着药物浓度的梯度递增，斑马鱼的死亡数量呈现出显著的上升趋势。这一发现与本实验结果契合：通过精确记录阿维菌素5个不同浓度处理组在24小时和48小时后的斑马鱼胚胎成纤维细胞死亡数据，经统计学分析证实，斑马鱼细胞死亡率与阿维菌素浓度之间存在剂量依赖性—即随着阿维菌素浓度的逐步升高，细胞死亡数量呈现出阶梯式增长态势。该结果不仅验证了前人关于药物浓度-毒性效应的研究结论，也为阿维菌素对水生生物细胞毒性机制的深入探究提供了新的实验依据。本实验首次采用阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2进行急性毒性试验，而斑马鱼作为水产养殖中具有代表性的模式生物，其试验结果对于整个水产养殖行业具有重要的借鉴价值REF_Ref4958\r\h[20]。24h和48h阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞存活率能够评估阿维菌素的急性毒性。试验结果表明浓度依赖性毒性：随阿维菌素浓度升高，细胞存活率显著下降，20μg/mL组在48小时存活率仅约15%，提示高浓度具有强细胞毒性。细胞培养作为一种研究工具，在毒理学研究中很重要。这一研究结果与GuanTianyu等人REF_Ref1231\r\h[21]探究阿维菌素对红沼泽小龙虾细胞的毒性影响结论一致。在其研究中发现，随着阿维菌素药物浓度逐步升高，细胞凋亡率显著上升，同时P.clarkii的肝胰腺出现损伤情况，其中膜结构受损尤为明显。阿维菌素会对P.clarkii产生氧化损伤，致使其防御系统遭到破坏，不仅会抑制非特异性免疫功能和抗氧化能力，还会加速细胞凋亡进程。本实验中观察到的斑马鱼细胞毒性与阿维菌素浓度的相关性，进一步佐证了阿维菌素在水生生物毒性效应研究领域中，浓度-毒性正相关的普遍规律。细胞形态是细胞生理状态的直观体现REF_Ref5147\r\h[22]。阿维菌素若对斑马鱼胚胎成纤维细胞有毒性，往往会率先在细胞形态上有所表现REF_Ref5209\r\h[23]。观察细胞形态的变化，如细胞的大小、形状、轮廓、胞质和胞核的结构等是否出现异常，能够直接判断阿维菌素是否对细胞造成损伤，为评估其毒性提供最基础且直观的证据。在罗丹等REF_Ref5278\r\h[24]研究阿维菌素（AVMs）对胶质母细胞瘤U251细胞增殖、凋亡的影响中，AVMs对U251细胞的增殖抑制作用呈时间、剂量依赖性，和我们的试验结果一致。我们的试验结果表明空白组细胞形态完整呈梭形，而药物处理组细胞变圆、脱落和悬浮，这与胡薪蕊等REF_Ref5340\r\h[25]研究α-干扰素（IFN-α）联合索拉菲尼对肝癌细胞增殖的抑制作用中空白对照组细胞形态完整，轮廓清晰，呈梭形，贴壁状态良好，药物处理组胞浆肿胀、胞膜破裂、细胞形态、胞膜界限模糊不清，有些甚至死亡的结果一致。3.2结论本研究显示，阿维菌素对斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2存在显著毒性作用，主要特征为细胞形态学改变及增殖活性抑制，且毒性效应呈现剂量依赖关系。通过实验测定，该细胞系在24小时和48小时的半数抑制浓度（IC50）分别为7.396μg/mL与11.46μg/mL。数据表明，随着药物浓度升高，PAC2细胞的结构完整性和生理功能受损程度加剧。因此，PAC2细胞可以作为阿维菌素敏感的水生动物细胞毒理学模型，为后续毒性机制以及药物开发研究提供细胞工具以及数据基础。PAGE29参考文献董娟聪,王婧洁,于金环,程娇,党旭红,杨国栋.模式生物斑马鱼在放射医学研究中的应用现状[J].中国实验动物学报,2025,33(01):141-148.王泽泰,娄丹丹,彭燕,朱道琦,李爱武,宫凤英,吕英,范钦.鼻咽癌斑马鱼移植瘤模型的构建及姜黄素对CNE-2细胞的抑制作用[J].吉林大学学报(医学版),2022,48(01):9-17.张云.转基因斑马鱼模型在药物安全性评价中的应用与创新[A].中国毒理学会第十一次全国毒理学大会论文集[C].中国毒理学会:2024:66-67.李璘,邱蓉丽,魏凯峰,程海波,孙东东.斑马鱼在抗肿瘤药物和临床研究中的应用[J].中国实验动物学报,2025,33(4):00-00.孙文龙,宋新华.斑马鱼在药理学实验教学中的应用研究[J].教育教学论坛,2020,(47):385-38王亮,崔海鹏,杨景峰,贾艳红.阿维菌素和高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎的毒性研究[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版),2018,33(06):504-507.HanyuWangetal.Ferulicacidalleviateslong-termavermectin-induceddamagetothespleenofcarpandrestoresitsinflammatoryresponseandoxidativebalance[J].JournalofEnvironmentalSciences,2025,151:616-626.许玉艳,刘巧荣,付晓苹,李强,孟娣,宋怿.阿维菌素对水生动物的毒性效应及残留检测研究进展[J].食品安全质量检测学报,2016,7(06):2281-2288.王锡珍,陆宏达.阿维菌素对几种淡水水生动物的急性毒性作用[J].环境与健康杂志,2009,26(07):593-597.RafteryTD、IsalesGM、YozzoKL、VolzDC。高内涵筛选测定，用于鉴定影响斑马鱼胚胎自发活动的化学物质。环境科学技术.2014;48(1):804-810.doi：10.1021/es404322p陈进军,房文红,王松刚.阿维菌素对水生动物安全性及其对寄生虫驱杀作用[J].科学养鱼,2015,(02):90.倪腾腾,彭大鹏,陈冬梅,王玉莲,潘源虎,陶燕飞,袁宗辉.阿维菌素类药物残留在动物体内的毒性、毒理和分布规律的研究进展[A].中国畜牧兽医学会2017年学术年会论文集[C].中国畜牧兽医学会:2017:208.杨晓洁.德国小蠊（Blattellagermanica）脂肪体线粒体对阿维菌素胁迫的生理响应及代谢组学研究[D].导师：张棋麟.昆明理工大学,2022.杨帆,宋莉,周晓蓉.阿维菌素亚急性染毒对大鼠肝脏和血清氧化应激指标的影响[J].职业卫生与应急救援,2014,32(03):133-136.杨通枝,詹会祥,姚俊杰,杨梅,韦玉来,杨龙保.五种农药对昆明裂腹鱼幼鱼的急性毒性试验[J].山地农业生物学报,2019,38(02):32-36+79.谢瑞涛,黄凯,覃志彪,赵鑫