阿魏菇多糖提取与纯化流程的优化研究

摘要目的：阿魏菇作为一种新疆特色食用真菌，含有丰富的蛋白质、脂肪酸、多糖类物质，研究表明阿魏菇多糖具有较好的杀菌活性，因此，本研究将对阿魏菇多糖的提取与纯化工艺进行优化，提高多糖得率并降低杂质含量，为其工业化生产提供理论依据。方法：以新疆阿魏菇粉末为原料，分别考察提取溶剂（水、0.9%NaCl、2%NaOH）、提取方式（90℃热浸提、60℃超声波、80W微波）及醇沉浓度（60-90%）对多糖得率的影响；通过不同的三氯乙酸浓度梯度（1-11%）优化除蛋白工艺；比较4种大孔吸附树脂（D101、AB-8、D301、D152）和双氧水氧化（1-5mL，pH9）的脱色效果。结果：90℃热水浸提3h，结合80%乙醇沉淀可获得最高多糖提取率（11.2%）；用量为9%的TCA时蛋白去除率达21.64%，多糖保留率为78.36%；大孔树脂D301脱色率最高为22.00%，多糖保留率高达91.75%。因此，使用浓度为9%的TCA除蛋白结合大孔吸附树脂D301进行脱色时的纯化效果最佳。关键词：阿魏菇；多糖；工艺优化；三氯乙酸；大孔吸附树脂ABSTRACTObjective:Pleurotusferulae,anediblefungusrichinproteins,fattyacids,andpolysaccharides,hasdemonstratedantifungalactivity.ThisstudyaimedtooptimizetheextractionandpurificationprocessofpolysaccharidesfromP.ferulaemushroomtoenhanceyield,reduceimpurities,andprovideatheoreticalfoundationforindustrialproduction.Methods：UsingP.ferulaemushroompowderastherawmaterial,theeffectsofextractionsolvents(water,0.9%NaCl,2%NaOH),extractionmethods(90℃hotwater,60℃ultrasound,80Wmicrowave),andethanolprecipitationconcentrations(60-90%)onpolysaccharideyieldwereinvestigated.Proteinremovalwasoptimizedusingtrichloroaceticacid(TCA)atvaryingconcentrations(1-11%).Thedecolorizationefficiencyoffourmacroporousadsorptionresins(D101,AB-8,D301,D152)andhydrogenperoxideoxidation(1-5mL,pH9)wascompared.Results:Thehighestpolysaccharideyield(11.2%)wasachievedwithwatersolventat90℃for3hfollowedby80%ethanolprecipitation.Proteinremovalreached21.64%with11%TCA,whilepolysaccharideretentionwas78.36%.D301resinexhibitedthehighestdecolorizationrate(22.00%)andpolysaccharideretention(91.75%).Theoptimalpurificationcombined11%TCAforproteinremovalandD301resinfordecolorization.Keywords:Pleurotusferulae;polysaccharides;processoptimization;trichloroaceticacid(TCA);macroporousadsorptionresin引言阿魏菇（Pleurotusferulae），作为新疆特有的珍稀食药用菌——阿魏侧耳，是干旱草原上极其具有代表性的覃菌类，其子实体质地脆嫩可口，口感鲜美，且带有浓郁的香气，被誉为“草原牛肝菌”，此外，这种菌类还具有消积化食和杀虫等多种功效，兼备食用与药用价值[1]因此被称之为天山神菇，国际研究显示，这种珍稀菌类的子实体具有显著的降血脂，抗肿瘤及调节免疫等现代药理活性[2]。多糖作为阿魏菇最重要的活性成分之一，属于天然高分子多糖，由糖苷键连接的碳水化合物单体聚合而成，其性质不同于单糖，无甜味，且还原性强，阿魏菇多糖成分具有显著的抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等功能，在功能食品开发和药物研制等领域展现出广阔的应用前景和价值[3]，阿魏菇多糖是体现阿魏菇药用与营养价值的一种核心功能成分，具有显著的生物活性，非常具有开发前景，目前，阿魏菇多糖的提取纯化与结构研究已经成为热点领域。但阿魏菇多糖的产业化应用仍面临诸多挑战如传统提取工艺存在得率低、能耗高等问题；粗多糖中蛋白质和色素等杂质严重影响产品纯度和生物活性。现有研究多聚焦于医用价值开发，对其在农业领域的应用潜力关注不足，这种研究方向的局限性制约了阿魏菇资源的综合利用效率。未来需要通过提高资源利用效率，国内外学者在阿魏菇多糖提取和除杂研究上已取得一定进展。董洪新等采用酸碱法提取多糖，虽提高了得率（1.34%），但导致活性成分破坏[4]；李金玉团队曾通过不同溶剂提取和超声波，微波辅助提取阿魏菇多糖得出热水浸提的多糖得率效果最佳[5]，许程剑团队引入超声波辅助热水浸提法提取阿魏菇粗多糖的最佳工艺研究进行优化，得出阿魏菇粗多糖提取的最佳工艺，将得率提升至11.08%[6,7]，但未解决后续纯化难题。在除蛋白方面，三氯乙酸法虽然已经被广泛应用，但不同浓度（1%-11%）对多糖结构的影响机制尚未阐明；脱色工艺是阿魏菇多糖纯化过程中的关键步骤，目前主要采用化学法和物理法两大类技术路线[8],其中的化学方法的核心机理是利用强氧化剂破坏杂质的结构让其脱色，如双氧水等，但该方法极容易破坏多糖的结构和自身的功能[9]。而物理法则是利用物质的吸附能力吸附存在的杂质从而达到吸附效果，目前常用的吸附方法包括活性炭和大孔树脂等[10]。其中活性炭因孔径小，所以对分子量较大的杂质吸附困难，而且脱色时间较长就导致脱色效率低[11]，而大孔吸附树脂对杂质的吸附作用强，而且脱色过程温和不会对多糖的结构造成破坏，可通过物理作用选择性地吸附多糖提取过程中混有的蛋白质、水溶性色素等杂质再生后还可以重复使用[12]。此外，大孔吸附树脂吸附速率快、饱和吸附容量大、洗脱效率高、抗污染能力强等优点，且经试验表明，大孔吸附树脂脱色之后的多糖保留率和脱蛋白率相对较高[13]。特别需要指出的是，韩业明的最新研究表明，阿魏菇多糖对植物病原菌具有显著抑制作用[14]，这为拓展其农业应用提供了新思路，但相关研究仍处于起步阶段。本研究基于多学科交叉视角，构建了从提取到纯化的全流程优化体系，从多糖提取条件、提取方式、醇沉浓度，脱色工艺等方面进行筛选，不仅为阿魏菇多糖的标准化制备提供了可靠方案，更为其他食用菌多糖的研究提供了方法论参考，而且还分析了最佳的三氯乙酸除蛋白条件以及和脱色方法，对推动特色生物资源的深度开发具有重要理论意义和实践价值。1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要试剂本研究选用分析纯及以上级别的化学试剂，具体试剂信息见表1。其中，乙醇（纯度≥99.7%）作为多糖沉淀剂，其挥发性低、毒性小的特性可确保试验安全性；三氯乙酸（TCA）；氢氧化钠（纯度≥96.0%）用于调节提取体系pH值，其强碱性可促进细胞壁多糖溶出。特别试验选用4种具有不同极性的大孔吸附树脂（D101、AB-8、D301、D152），其物理化学参数见表2。表1主要试剂规格及供应商信息试剂名称纯度生产厂家储存条件无水乙醇≥99.7%国药集团室温避光三氯乙酸≥99.0%Sigma-Aldrich4℃干燥氢氧化钠≥96.0%阿拉丁干燥器保存表2大孔吸附树脂特性参数树脂型号极性平均孔径(nm)D101非极性9.0±0.5AB-8弱极性13.5±1.0D301弱碱性15.0±1.2D152弱酸性12.0±1.01.1.2仪器设备低温冰箱（HaierBCD-211WE）、超低温冰箱（Forma）、台式高速离心机（Mikro22R）、台式冷冻高速离心机（Eppendorf）、KQ-500DE超声波提取仪、电热恒温水浴锅（H.H.SL1-4）、UV-2600紫外可见分光光度计、超纯水系统（Milli-Q）、纯水系统（AMB-10-1-P）、微型离心机（ECW）等设备。1.2试验方法1.2.1阿魏菇粉制备新鲜子实体经去杂→纯水冲洗→55℃热风干燥→万能粉碎机粉碎，最终获得试验用粉末，储存于-20℃冰箱。1.2.2多糖提取条件优化（1）提取溶剂的配制与筛选本研究系统考察了水、0.9%NaCl和2%NaOH三种溶剂对阿魏菇多糖提取效率的影响。准备3份100mL水溶液，其中2份分别加入0.9gNaCl和2gNaOH，配制成0.9%的氯化钠溶液和2%氢氧化钠溶液，取2g阿魏菇粉末，分别加入的配制好的提取溶液中，搅拌器在温度90℃，转速700r/min条件下搅拌3h，搅拌完成之后用离心机冷却离心15min，转速为8000r/min，取上清液浓缩至20mL，按1:4分别加入预冷的无水乙醇，加完冷却静止6h，用无水乙醇洗清沉淀3次，晾干称重，用苯酚硫酸法测定多糖含量。（2）提取方式比较取2g阿魏菇粉末加入100mL水溶液，分别用90℃搅拌器搅拌3h、60℃超声波提取1h、80w微波提取20min，提取完成之后用离心机冷却离心15min，转速为8000r/min，上清液浓缩至20mL，按1:4比列加入100mL冷乙醇，静置过夜6h之后再次离心留沉淀，每份洗涤3次之后将沉淀烘干称重，用水定容至50mg/mL，用配置好的苯酚硫酸法测定多糖含量。（3）醇沉条件优化取5g阿魏菇粉末加入100mL水溶液，90℃搅拌3h提取，用离心机冷却离心15min之后上清液浓缩至100mL，以2:3的比例分别加入浓度为60%、70%、80%、90%的预冷无水乙醇后进行抽滤，用无水乙醇洗清沉淀3次，晾干称重，用苯酚硫酸法测多糖含量。1.2.3三氯乙酸法除蛋白条件优化取40mg阿魏菇粗多糖，溶于40mL水中，分别加入三氯乙酸至浓度为1、3、5、7、9、11%，4℃静置4h，用高速离心机离心15min，转速为8000r/min，离心完成后取上清液弃沉淀，测上清液中蛋白质和多糖的含量。1.2.4脱色方法筛选（1）大孔吸附树脂脱色本研究比较了4种大孔树脂的脱色性能，分别是D101、AB-8、D301、D152（表3）。取1%粗多糖溶液20mL，分别加入1g不同的大孔吸附树脂，震荡脱色2h，检测脱色前后480nm吸光值并计算脱色率，同时利用苯酚硫酸法测定多糖含量。表3不同大孔吸附树脂的性质树脂型号极性平均孔径(nm)D101非极性9.0±0.5AB-8弱极性13.5±1.0D301弱碱性15.0±1.2D152弱酸性12.0±1.0（2）双氧水氧化脱色取1%粗多糖溶液20mL，分别加入30%双氧水1、2、3、4、5mL，调整pH为9，60℃搅拌4h，分别测定脱色前后480nm吸光值，计算脱色率；同时利用苯酚硫酸法测定多糖含量。1.2.5苯酚硫酸法测定多糖含量精准称取10mg标准品葡萄糖，用去离子水溶解并定容至50mL，分别取0、0.05、0.1、0.15、0.2mL置于试管中，定容至1mL，加入0.5mL6%的苯酚溶液（避光保存），摇匀后迅速加入浓硫酸2.5mL（沿管壁缓慢加入，避免剧烈放热），摇匀后室温静置30min，在490nm下吸光值，平行重复三次，取平均值，以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。将待测样品配制成500μg/mL，取1mL后按照以上方法处理并根据标准曲线计算糖含量，根据标准曲线计算多糖含量。2结果与分析2.1多糖提取工艺优化结果2.1.1不同溶剂提取效果比较试验结果表明，3种提取溶剂对阿魏菇多糖的提取效率存在显著差异（表4）。水提法展现出最优的提取性能，多糖得率达到10.8%，0.9%氯化钠提取效率最低，仅为8.5%。表4不同溶剂提取多糖提取率比较溶剂类型多糖得率(%)水10.8±0.4a0.9%NaCl8.5±0.5c2%NaOH9.2±0.3b2.1.2不同提取方式的比较如表4所示，采用3种多糖提取方式进行水提时表现出显著差异。传统热浸提获得最高多糖得率，在90℃条件下提取3h，能够有效破坏细胞壁，有利于多糖的提取，多糖得率为12.2%。微波和超声波提取方式所获得的多糖得率较低，仅为9.8%和10.5%，但效率大大提高，微波提取法可在20min内就可达到水提法80%提取效果，超声波提取法可在1h内达到水提法86%的提取效果。表5不同提取方式的多糖得率提取方法多糖得率(%)处理时间热浸提12.2±0.3a3h超声波10.5±0.4b1h微波9.8±0.5b20min2.1.3醇沉浓度优化结果乙醇浓度梯度试验揭示了利用不同浓度乙醇进行醇沉，多糖得率有较大差异（图1）。当乙醇浓度在60%至80%时随着浓度的增加多糖得率也随之增加，增加至80%时最高为11.5%，继续将浓度升高至90%时多糖得率出现下降趋势。由此可知，醇沉条件的最适浓度为80%。图1乙醇浓度对多糖得率的影响2.2TCA除蛋白方法优化试验结果表明TCA浓度与蛋白去除率之间有密切关系。由图2A可知，随着TCA浓度的升高除蛋白率也随之增加，浓度为1%时蛋白去除率为14.43%，TCA浓度达到7%-11%时，蛋白去除率为20.01%-21.64%，差异不显著。由图2B可知随着TCA浓度升高，多糖保留率先升高有降低，9%TCA浓度条件下，多糖回收效果最佳，保留率达为78.56%。该浓度条件下，蛋白去除效率和多糖保留程度达到最优平衡，综合考虑得出当浓度为9%时的除蛋白效率最好，多糖保留率最高。图2不同浓度TCA的除蛋白效果（A：除蛋白率；B：多糖保留率）2.3脱色方法比较2.3.1树脂类型对脱色率的影响4种大孔树脂的脱色性能比较显示，树脂D301具有最佳的吸附选择性，其脱色率为22.00%（图3A），多糖的平均保留率为91.75%（图3B），显示出良好的多糖回收效率；树脂D152显示出最佳的多糖保留性能（98.31%），与D301和D101无显著差异，但其脱色效果最不理想，仅仅为1.84%。经综合分析大孔树脂D301具有最佳的吸附选择性。图3不同大孔树脂的脱色效果（A：除蛋白率；B：多糖保留率）2.3.2双氧水的脱色效果分析双氧水脱色试验显示，随着双氧水用量增加，脱色率呈现先升高后区域稳定，保持在60~70%左右（图4A），而多糖保留率则随着双氧水用量的增加而逐步下降（图4B），综合两个因素考虑得出用双氧水脱色时的最适用量为2mL。双氧水脱色效果显著高于大孔吸附树脂，但由于其氧化作用会导致多糖的结构发生改变，从而影响生物活性，因此，最终推荐使用更稳温和的大孔吸附树脂进行脱色。图4不同用量双氧水的脱色效果（A：除蛋白率；B：多糖保留率）3讨论多糖是一类具有高分子结构的天然糖类化合物，其分子结构十分庞大是由数十至数千个单糖分子通过糖苷键失水与缩合构成的高分子聚合物[15]。随着现代科技的进步和分离纯化技术的发展，多糖研究取得了突破性进展，经研究证明多糖具有广泛的的生物学功能，涉及免疫调节、癌变、抗肿瘤作用和抗衰老效应等方面，这些重要发现使多糖在医药领域，功能食品，农业生产，环保工程等领域展现出巨大应用潜力[16]，多糖作为生命体重要的天然活性大分子，展现出独特的生物学特性与广阔的应用前景[17]。近年以来，随着绿色农业发展理念的推广以及可持续发展战略的实施，多糖在农业生产中展现出了非常重要的作用，多糖不仅可以促进植物生长，改良土壤环境而且还能够对病虫害进行综合防治。常用的多糖提取方法有超声波处理，热浸提，离心，微波处理等方法[18]，粗多糖由于本身的结构复杂性，其提取物通常呈现出多组分混合体系，主要包含蛋白质，色素，氨基酸等杂质，因此需要对粗多糖进行分离和纯化来系统去除多糖中的蛋白质，色素等干扰成分[19]。目前主要采用的脱蛋白方法有三氯乙酸法（TCA），有机溶剂法，盐析法，酶工程法[20]，目前用于脱色素的方法有活性炭法，双氧水法，大孔树脂吸附法等[21]，基于此，本研究通过系统优化多糖提取和纯化流程条件，经试验得出用水作为提取溶剂，90℃热浸提，以浓度为80%的乙醇所得到的多糖最高，浓度为9%的TCA进行脱蛋白的效果最好，由于双氧水脱色可能会影响活性多糖的化学结构，因此推荐使用大孔吸附树脂D301进行脱色。多糖的分离与纯化是生物化学，食品科学，农药开发等领域的重要研究方向，阿魏菇多糖作为具有显著生物活性的天然产物，其分离纯化技术的研究具有重要的理论意义和实践意义。随着技术的进步，多糖的提取与纯化研究将会朝着高效率，高精准，高环保的方向发展，随之出现的问题是如何平衡纯度和得率，提高纯度导致得率下降，而追求高得率又可能牺牲产品纯度等问题，后续也将基于这些问题进行研究。本研究成果为阿魏菇多糖的分离纯化提供了可靠的技术参数和理论依据，确定了最适提取温度，时间等关键参数值，建立了系统的纯化方案，包括脱蛋白，脱色等工艺流程，为未来生产提供了系统解决思路。参考文献陈帅,许程剑,李应彪,刘冰,王雪铭,何燕等.阿魏菇多糖的结构分析[J].2015,31(3):30-35.DuBokChoi,Wol-SukCha,Si-HyungKang,etal.EffectofPleurotusferulaeextractsonviabilityofhumanlungcancerandcervicalcancercelllines[J].BiotechnologyandBioprocessEngineering,2004,9(5):356-361陈忠纯.我国阿魏侧耳的驯化与栽培[J].食用菌学报,1996,3(4):11-14.董洪新李金玉,李艳红,李金耀,葛风伟,王茹,赵惠新等.阿魏菇多糖的制备方法、结构特性及生物活性[J].2019,39(5):966-972.牛博楠,许程剑,刘冰,何月,王思月,等.超声波提取新疆阿魏菇蛋白质工艺优化[J].食品研究与开发,2014.35(8):29-33.王雪铭,许程剑,牛博楠,卢士玲.胃-胰蛋白酶联合酶解阿魏菇蛋白制备抗氧化多肽[J].食品研究与开发.2015,36(3):23-27.YUXH,MUN,LIUXC,etal.AgreenmethodfordecolorizationofpolysaccharidesfromalfalfabyS-8macroporousresinandtheircharacterizationandantioxidantactivity[J].RSCAdv,2023,13(14):9642-9653.RENH,LIZY,GAOR,etal.StructuralcharacteristicsofRehmanniaglutinosapolysaccharidestreatedusingdifferentdecolorizationprocessesandtheirantioxidanteffects