安茶多糖抗氧化活性及其发酵特性的研究

目录TOC\o"1-3"\h\u7326目录 第一章引言1.1安茶概述安茶是产自安徽祁门的一种传统再加工黑茶，因其独特的香气和醇厚的口感深受消费者喜爱。安茶外形紧实，黑褐尚润，香气高长，汤色明亮，具有陈化特性，并兼具一定的药理功效REF_Ref10102\w\h[1]。但其加工过程比较复杂，通常包括杀青、揉捻、晒干、夜露、陈化等关键步骤。正是因为夜露这一核心工序，即在一个特定温湿度条件下，利用茶叶自身酶系和外源微生物协同作用的湿热发酵，使得茶叶内的化学成分发生了显著变化。例如，茶多酚、咖啡碱和氨基酸等含量会有所降低，而咖啡碱、茶褐素以及茶多糖的结构和含量也会发生明显变化REF_Ref14448\r\h[2]。近年来，随着对黑茶的深入研究，我们认为安茶中的功能性成分，特别是茶多糖，将具有更广阔的应用领域和市场前景。1.2茶多糖概述茶多糖是茶叶中一类重要的天然活性高分子物质碳水化合物。不同来源和提取方式得到的茶多糖，在单糖组成比例、主链与支链结构、糖苷键类型、分子量大小以及官能团特征等方面均可能存在差异REF_Ref21394\r\h[3]。因此茶多糖在抗氧化、调节血糖、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能方面也具有明显差异。例如，Xu等人发现，随着发酵程度的增加茶多糖的生物活性也呈现增长趋势。最重要的是，分子量较小的多糖更易被肠道吸收，生物利用度更高REF_Ref23347\r\h[4]；SUN等人利用三种不同的方法提取茶多糖，经过统计分析发现碱提茯茶多糖具有较高的糖醛酸含量，并且葡萄糖、糖醛酸结构的存在可能会提高多糖的抗氧化活性REF_Ref23781\r\h[5]。1.3安茶多糖作为潜在的益生元肠道菌群是人体内最为复杂的微生态系统之一，在营养代谢、免疫调节、屏障保护等方面发挥着重要作用。研究表明，肠道菌群的结构和功能的紊乱与多种慢性疾病密切相关，如肥胖、糖尿病、代谢综合征、炎症性肠病甚至神经系统疾病REF_Ref14540\w\h[6]，其代谢产物在调控宿主能量代谢、炎症反应中发挥关键作用，其中短链脂肪酸（SCFAs）是连接肠道菌群与宿主健康的重要桥梁。SCFAs不仅能为肠道上皮细胞提供能量，还可通过调节脂肪代谢、改善胰岛素敏感性等途径预防代谢性疾病天然多糖因可被肠道菌群发酵产生SCFAs，被广泛认为是潜在益生元REF_Ref5022\r\h[7]。由于茶多糖难以被上消化道酶解，能够直接到达结肠并被肠道细菌发酵利用，生成乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸（SCFAs），从而调节菌群结构和促进有益菌增殖，达到改善代谢的效果。例如，王广等REF_Ref30219\r\h[8]用党参多糖作用于灌胃盐酸林可霉素小鼠，他们发现这可以促进肠道中双歧杆菌的生长,提高乙酸的代谢。SUN等人REF_Ref31035\r\h[9]体外发酵研究表明，安茶多糖能够提高代谢物中乙酸和丙酸的含量。Flint等REF_Ref31169\r\h[10]报道显示，大豆低聚糖可刺激肠道中的短链脂肪酸产生菌代谢从而产生乙酸、丙酸和丁酸。1.4多糖的抗氧化活性机体在能量代谢过程中会不可避免地产生自由基。一旦自由基过量，它就会攻击细胞膜、DNA和蛋白质等生物大分子，进而对机体造成损伤REF_Ref2441\r\h[11]。多糖分子结构中含有大量的羟基(-OH)，部分多糖还含有羧基(-COOH)、硫酸基(-OSO3H)等活性基团。这些基团能够提供氢原子或电子，有效清除如超氧阴离子自由基、羟自由基(-OH)和DPPH自由基等，从而阻断自由基链式反应来减轻氧化损伤。例如，Wang等人研究发现，枸杞多糖能够有效地清除DPPH自由基和羟自由基，并对H₂O₂诱导的细胞氧化损伤具有显著的保护作用REF_Ref2731\r\h[12]。Zhang等人的研究表明，从灵芝中提取的多糖不仅能显著清除超氧阴离子自由基，还能增强小鼠体内抗氧化酶（如SOD和GSH-Px）的活性REF_Ref4501\w\h[13]。1.5研究内容与意义近年来，安茶的功能性成分及其健康功效受到了研究者的广泛关注，其中安茶多糖的抗氧化、抗炎及调节肠道菌群等生物活性已成为研究的热点。本文研究目的是探讨安茶多糖的抗氧化性以及其发酵特性。分析了安茶多糖模拟体外发酵过程中对短链脂肪酸（SCFAs）产生的影响，之后与其自身的抗氧化特性协同作用，从而发挥ATPS潜在健康效益，为开发基于天然多糖的功能性食品或药物提供科学依据。第二章ATPS发酵特性及抗氧化活性2.1试剂与仪器设备2.1.1材料与试剂本研究的原料是由安徽省黄山市孙义顺茶厂提供的2021年份的一级安茶（生产日期为2021年9月26日）。DB/DB小鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司。乙酸（Aceticacid,AA）、丙酸（Propanoicacid,PrA）、正/异丁酸（N-Butyricacid/I-Butyricacid,n/i-BA）及正/异戊酸（Valericacid/Isovalericacid,n/iVA）标品购自阿拉丁（中国上海），2-乙基丁酸购自源叶。所有其他化学试剂均为分析级市售试剂。2.1.2仪器设备表2-1仪器与设备Table2-1Instrumentsandequipment仪器厂家BHH-4型数显恒温水浴锅TGL-16M高速冷冻离心机常德比克曼生物科技有限公司上海卢湘仪离心机仪器有限公司ME-104/02电子天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司N-1399旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司Alpha1-4LSCBasic冷冻干燥机德国Christ公司全波长紫外扫描上海美谱达仪器有限公司傅里叶红外Agilent7890N气相色谱仪（GC）MultiskanFC酶标仪高效液相透析袋赛默飞气相安捷伦公司赛默飞科技有限公司Waters源叶ZHJH-C1109B超净工作台上海智城分析仪器制造有限公司2.2实验方法2.2.1安茶多糖的提取参考CHENREF_Ref5022\r\h[7]等人的方法，先将安茶烘干并粉碎，过60目筛后，加入10倍体积的无水乙醇浸泡24h，进行脱色脱脂处理。抽滤后保留沉淀，经烘干后得到预处理茶粉。准确称取10g处理好的茶粉，按1:30的比例加入蒸馏水，在90℃条件下恒温浸提2.5h，过滤后收集提取液。重复提取滤渣两次，合并三次浸提液，通过减压浓缩后加入4倍体积的无水乙醇来进行醇沉，在静置24小时后，通过离心操作收集沉淀。随后采用Sevag试剂（氯仿:正丁醇=4:1）脱蛋白至无沉淀生成，收集多糖溶液并去除残留有机溶剂，最后用流动水透析48h，冻干后得到安茶多糖成品。2.2.2体外发酵模型的构建配制基础营养培养基：蛋白胨1g、酵母浸膏2g、NaCl0.05g、K₂HPO₄0.02g、KH₂PO₄0.02g、MgSO₄·7H₂O0.005g、CaCl₂·6H₂O0.005g、NaHCO₃1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.25g、胆盐0.25g、氯化血红素0.01g、刃天青0.5mg、吐温80(Tween80)1mL、维生素K15μL，用蒸馏水定容至500mL。高压蒸汽灭菌冷却后，在无菌条件下使用经0.22μm滤膜过滤除菌的0.1MHCl溶液或NaOH溶液,将培养基pH值精确调节至7.0±0.1。取1.6gDB/DB糖尿病雄性小鼠粪便样本，将其与14.4mL经高压灭菌处理的改性生理盐水溶液进行搅拌，使两者充分混合均匀。随后进行低速离心操作，去除其中较大的粪便颗粒，得到10%的小鼠粪便悬浮液，将其用作体外发酵的菌群接种物。在无菌操作条件下，准确量取1mL粪便悬浮液，加入到含有100mgATPS的9mL基础培养基中（ATPS组），混合均匀后转移至已灭菌的锥形瓶内。将锥形瓶放入含有产气包的厌氧盒中，然后置于37℃培养箱中培养。同时设置对照实验：以菊粉、粪便接种物和培养基的作为阳性对照（INULIN组）；以葡萄糖、粪便接种物和培养基的作为空白对照（Glucose）；仅含有粪便接种物和培养基的作为阴性对照（BLANK组）。在发酵0h、6h、12h和24h时取样，并立刻于4℃环境下以2000rpm转速离心10min来分别获得上清液和菌群沉淀。所得样本用于后续pH值的测定、短链脂肪酸(SCFAs)、总糖、HPLC等代谢产物分析，标记后放于-80°C冷冻保存。2.2.3ATPS成分含量测定（1）单糖组成测定：采用PMP衍生结合HPLC的方法进行测定。（1）多糖样品酸水解。称取5mg样品，用蒸馏水将其配置成浓度为5mg/mL的溶液。取100μL该溶液，加入到具塞试管中，再加入100μL4mol/L的三氟乙酸。之后向试管内通入氮气来进行封管操作，把试管放在120℃油浴锅中水解2h。反应结束后，将试管冷却至室温。最后，向水解液中加入200μL甲醇，用氮气把溶液吹干，如此重复三次。（2）PMP衍生化。向100μL酸水解之后的样品中加入100μL0.6molNaOH，将其充分混匀。接着取100μL上述溶液，添加100μL0.5mol的PMP甲醇溶液，将混合物放入70℃的水浴锅，反应100min。反应结束冷却后，向试管中再加入50μL0.3molHCl，用N2吹干后，再加入1mL蒸馏水和1mL三氯甲烷充分振荡。静置分层后吸取上层水相，弃去下层氯仿相。重复操作三次，用来彻底除去PMP。最后将得到的水相溶液通过0.22μm的滤膜过滤，收集滤液备用。（3）实验条件：检测柱：HypersilGOLD-C18柱（250×4.6mm，5μm），流速1mL/min，进样量：20μL，流动相：0.1molPBS（pH=6.7）与乙腈体积比83:17，检测器：Waters2998紫外检测器，测定ATPS的单糖组成。（2）ATPS的总糖含量测定：采取苯酚硫酸法REF_Ref32615\r\h[14]。精准配置浓度为1mg/mL的ATPS溶液和不同浓度梯度的葡萄糖溶液。分别取1mL溶液，并加入100μL5%的苯酚和500μL浓硫酸，反应30min，最后在490nm处测定吸光值，以浓度梯度/吸光值绘制标准曲线，结合标准曲线计算ATPS的总糖含量。（3）蛋白含量的测定：采用考马斯亮蓝法REF_Ref32644\r\h[15]。配置不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）溶液以及1mg/mL的ATPS溶液各1mL，分别加入5mL的考马斯亮蓝溶液，并在595nm下测定其吸光值，以浓度梯度/吸光值绘制标准曲线，结合标准曲线计算ATPS的蛋白含量。（4）多酚含量的测定：采用福林酚法REF_Ref32680\r\h[16]。配置不同浓度的没食子酸溶液以及1mg/mL的ATPS各1mL，分别加入5mL福林酚试剂反应5min，接着再加入3mL浓度为20%Na2CO3溶液，放于室内避光静置60min后测吸光度值，以浓度梯度/吸光值绘制标准曲线,结合标准曲线计算ATPS的多酚含量。（5）糖醛酸含量的测定：采用间羟基联苯法REF_Ref32710\r\h[17]。配置不同浓度的半乳糖醛酸溶液和1mg/mL的ATPS溶液，分别量取反应液各1mL于洁净的反应管中。在各反应管中加入5mL的四硼酸钠-浓硫酸溶液，充分混匀后，将反应管放在沸水浴中加热5min。反应结束后，将其立即放在冰水浴中冷却，之后再加入80μL的间羟基联苯溶液，混匀5min，再用超声去气泡。最后使用分光光度计在525nm波长处测定吸光值，以浓度梯度/吸光值绘制标准曲线，结合标准曲线，进而计算ATPS的糖醛酸含量。2.2.4ATPS的傅里叶红外光谱首先称150mg的溴化钾粉末，将其放于远红外快速恒温干燥箱中完全干燥。干燥结束后，将溴化钾粉末转移至在白炽灯下研磨均匀。然后称取ATPS样品1mg与溴化钾按1:150在白炽灯下混合研磨，之后把混合好的粉末放在压片机中压片。最后，用傅立叶变换红外光谱仪在4000-400cm-1区间进行红外光谱扫描。以溴化钾压片红外扫描光谱作为空白，得到多糖样品的红外光谱图。2.2.5超氧阴离子自由基清除活性测定参考吴以龙REF_Ref1307\r\h[18]等的方法并作适当调整。取500μL样品溶液(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、和4.0mg/mL)与2mLTris-HCI缓冲液(pH=8.0)混匀，室温水浴20min。加入200uL2.5mmol/邻苯三酚，静置3min后加入5mL2moI/LHCI混匀，325nm处测定吸光值。依据公式（1）测算超氧阴离子自由基清除率，同时选取VC作为阳性对照开展实验分析。超氧阴离子自由基清除率（式中:A0为500μL样品溶液与2mlTris-HCl缓冲液的吸光值;A1为500μLH2O与2mLTris-HCl缓冲液的吸光值。2.2.6ABTS+自由基清除活性测定取等体积的7mmol/LABTS溶液与2.45mmol/L过硫酸钾溶液，充分混合均匀后，置于避光条件下静置14h，制得ABTS测定液备用。取50μL样品溶液(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0mg/mL)到2mL测定液中混匀。将样品于避光环境下静置10分钟，使用分光光度计在734nm波长处测定吸光值。实验以VC作为阳性对照，基于公式（2）对ABTS⁺自由基清除率进行计算。ABTS式中:A0为50μLH2O与2mLABTS测定液的吸光值;A1为50μL样品溶液与2mLABTS测定液的吸光值;A2为2mLPBS缓冲液和50μL样品溶液的吸光值。2.2.7DPPH+自由基清除活性测定取500μL样品溶液(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、和4.0mg/mL)到500μL无水乙醇和125μL0.02%DPPH混合液中混匀。将反应体系置于避光环境中反应25min，之后使用分光光度计在510nm波长处测定吸光度值。本实验采用VC作为阳性对照，通过式（3）计算DPPH+自由基的清除率。DPPH式中:A0为500μL样品溶液与500μL无水乙醇和125μL0.02%DPPH混合液的吸光值;A1为500μL样品溶液与625μL无水乙醇的吸光值;A2为500μLH2O与500μL无水乙醇和125μL0.02%DPPH混合液的吸光值。2.2.8羟基自由基清除活性测定取500μL样品溶液(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、和4.0mg/mL)到500μL9mmol/LFeSO4和500μL水杨酸-50%乙醇(9mmol/L)混合液中混匀。加入500μL0.03%H2O2,混匀，37℃水浴1h。在室温条件下静置10min，于510nm波长处测定吸光值。以抗坏血酸（VC）作为阳性对照，依据公式（4）来计算羟基自由基的清除率。

羟基自由基清除率（%）=1−(A0−A2)A1×100（4）

式中:A0为500uL样品溶液与500uL9mmol/LFeSO4和500μL水杨酸-50%乙醇(9mmolL)混合液的吸光值;A1为500μLH2O与500μL9mmol/LFeSO2.2.9pH的测定用pH计对离心后的发酵产物进行pH值测定，并将上清液放置2mL离心管中储存。2.2.10短链脂肪酸的测定采用气相色谱法(GC)测定，SCFAs中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量。具体操作如下：向400μL的样品或标准溶液中，加入400μL0.2MHCl中0.3mg/mL的2-乙基丁酸(内标)溶液。将其充分混匀后，以8800rpm的速度离心5min，取1μL上清液放入气相色谱(7890N,Agilent)，搭配HP-INNOWAX色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent)进行分析。其中，载气为氮气(N2)，流速设置为19.0mL/min；空气、氢气和N2补气的流量分别为260、30和30mL/min。柱温程序设置：初始温度100℃保持1min，随后以5mL/min的速度将柱温提高到180℃，并继续在该温度下维持4min。在进行上样检测之前，将各个发酵液的上清液通过0.22μm的水相滤膜进行过滤操作，随后依据上述气相色谱法所设定的检测条件进行上机检测。对照各SCFAs标准溶液的标准曲线，记录各峰值面积和保留时间，计算出SCFAs在发酵液中的含量。2.2.11多糖分子量分布测定样品检测采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）。具体色谱条件如下：选用日本产TSKgelguardcolumnPWXL（6.0mm×400mm）凝胶色谱柱，配备Waters2414示差检测器(RID)。以娃哈哈水作为流动相，设置流速为0.5mL/min、进样量为20μL。上机检测前，先将发酵液过0.45μm的膜，之后再装样。采用Waters2414高效液相色谱仪进行测定，并分别记录各组的保留时间。2.2.12统计分析实验数据采用GraphPadPrism10及Origin2021软件进行分析。所有实验均设置三组平行样本，试验结果均以平均值±标准差（mean±SD）表示。组间差异评估方法如下：两组数据对比采用t检验；多组间显著性分析就采用One-wayANOVA结合Tukey检验。当P<0.05时，判定结果具有显著性差异。结果与分析3.1ATPS化学成分测定分析经过冷冻干燥之后得到的ATPS粗品，根据表3-1可以知道ATPS的成分及含量，其多糖含量为43.59%±0.90%，多酚含量约为7.50%±1.50%，糖醛酸含量约为19.78%±1.19%，且检测不到蛋白质含量，说明经过Sevag除蛋白后能够较好将蛋白质去除。其中总糖含量标准曲线为y=0.0093x-0.0232，R2=0.9973;糖醛酸含量标准曲线为y=0.0287x+0.2608，R2=0.9903；蛋白质含量的标准曲线为y=0.0008x-0.0043，R2=0.9917；多酚含量的标准曲线为y=5.4714x+0.0644，R2=0.9989。表3-1ATPS化学成分测定结果Table3-1ChemicalcompositiondeterminationresultsofATPS化学成分ATPS多糖含量%43.59%±0.90%蛋白含量%ND多酚含量%7.50%±1.50%糖醛酸含量%19.78%±1.19%图3-1(A)、(B)、(C)、(D)分别为总糖、糖醛酸、蛋白、多酚标准曲线;分别采用苯酚-硫酸法、间羟基联苯法、考马斯亮蓝法、福林酚法并结合Excel数据分析得到标准曲线如图所示Figure3-1(A),(B),(C),and(D)showthestandardcurvesfortotalsugar,uronicacid,protein,andpolyphenols,respectively.Thesecurveswereobtainedusingthephenol-sulfuricacidmethod,m-hydroxybiphenylmethod,CoomassieBrilliantBluemethod,andFolin-Ciocalteumethod,respectively,combinedwithExceldataanalysis,asdepictedinthefigure.3.2ATPS的单糖组成如图3-2所示，ATPS中由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸以及核糖这6种单糖组成，它们的摩尔比为Man:Rha:GalA:Gal:GlcA:Rib=1.43:9.60:30.45:32.27:6.08:20.16，可以看出ATPS中主要含有半乳糖醛酸、半乳糖、核糖且这三种主要单糖含量占比超过70%，少量含有鼠李糖和甘露糖，又因为GalA含量较高，所以ATPS中含有较高的糖醛酸含量，故ATPS属于酸性多糖。茯砖茶多糖（FBTPS-2-1）由Gal，Ara和Glc组成，其中Man、Rha、GalA和GlcA的摩尔比很少，摩尔比为46.59:22.13:13.57:8.20:6.02:2.12:1.38REF_Ref9368\r\h[19]。黑砖茶多糖（DTP）由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成REF_Ref17368\w\h[20]。此外，研究结果表明，核糖经发酵后可以显著促进丙酸生成；而半乳糖与半乳糖醛酸在发酵过程中，也会对乙酸和丁酸的合成具有明显的促进作用。这与前文安茶多糖粗品ATPS体外酵解时，SCFAs中丙酸和乙酸的含量明显增多相对应REF_Ref10606\r\h[21]。图3-2ATPS的单糖组成Figure3-23MonosaccharidecompositionofATPS3.3ATPS的傅里叶红外光谱通过傅里叶变换红外光谱技术，我们对安茶多糖(ATPS)的结构特征进行了分析(图3-3)。结果显示，ATPS确实具备典型的多糖吸收特征。在3424cm⁻¹附近存在了一条强而宽的吸收带，这是因为分子内和分子间氢键关联的O-H在伸缩振动REF_Ref7366\r\h[22]。而位于2929.34cm⁻¹的峰则代表了C-H键的伸缩振动模式REF_Ref8519\r\h[23]。光谱分析又进一步提示了ATPS是一种酸性多糖，因为它在1735.13cm⁻¹处酯羰基(COOR)能够被吸收表征；1629.73cm⁻¹处的峰是因为羧酸根离子(-COO⁻)产生的不对称伸缩信号REF_Ref8695\r\h[24]；随后在1419.35cm⁻¹处也出现了与羧基C-O对称伸缩相关的吸收峰REF_Ref7366\r\h[22]。1400-1200cm-1处的一系列微弱峰是多糖特征性吸收峰REF_Ref20768\r\h[25]。同时，1200-1000cm⁻¹区域的吸收也主要对应于糖环骨架和糖苷键中的C-O-H或C-O-C伸缩振动REF_Ref10491\r\h[26]。图3-3ATPS的傅里叶红外光谱图Figure3-3FTIRspectrumofATPS3.4ATPS体外抗氧化活性分析我们通过DPPH自由基清除、超氧阴离子清除、ABTS自由基阳离子清除以及羟基自由基清除四种体外检测模型，系统分析了安茶多糖（ATPS）的抗氧化能力。ATPS在所有检测体系中均表现出一定的自由基清除活性，并且清除率随ATPS浓度的升高而增加。与阳性对照VC组相比，ATPS在多数测定体系及浓度下的清除效力相对较低，尤其在DPPH和羟基自由基清除测定中差异更为显著。ATPS对超氧阴离子和ABTS+表现出显著的清除能力，在较高浓度（≥2-3mg/mL）时，其清除率可分别达到约95%和99%以上。相比之下，ATPS对DPPH自由基和羟基自由基的清除效果就相对有限。从起始效力来看，ATPS在极低浓度下对超氧阴离子的清除作用最为迅速，而对ABTS和羟基自由基的初始清除率则相对较低。图3-4不同浓度ATPS对DPPH+、超氧阴离子、ABTS+以及羟基自由基的清除效果。Figure3-4ScavengingactivityofATPSatdifferentconcentrationsagainstDPPH,superoxideanion,ABTS+,andhydroxylradicals.3.5发酵液pH值分析pH值是糖酵解过程的重要指标之一，体外发酵过程中，发酵液样品在不同时间的pH值变化可以在一定程度上反映体外发酵过程。图3-5中可以看出，菊粉组pH值从7.49降低至5.33，葡萄糖组pH值从7.40降低至3.80，ATPS组的pH值从7.04降低至5.57，且在0-24h的发酵进程中，ATPS组的pH值始终低于空白对照组，这一现象表明，当在发酵培养基中添加安茶多糖、菊粉或葡萄糖时，会促使大量酸性代谢产物生成。图3-5pH变化示意图Figure3-5ChangesinpH3.6发酵过程中总糖含量测定为了评估安茶多糖(ATPS)的体外肠道发酵特性，我们监测了发酵过程中总糖含量的变化(表3-2)。最后结果显示，与空白对照组(NC)相比，ATPS组总糖含量在12h和24h都出现显著降低(P<0.01)的情况，这也表明了ATPS能够被有效利用。与此同时，阳性对照菊粉组(INU)和葡萄糖组(Glc)也观察到类似的底物消耗趋势。表3-2不同发酵时间点各组总糖含量变化及组间差异(葡萄糖当量,mg/mL,Mean±SD)Table3-2Changesintotalsugarcontentacrossdifferentgroupsoverfermentationtimeandinter-groupdifferences(glucoseequivalents,mg/mL,Mean±SD)发酵时间（h)空白组菊粉组葡萄糖组安茶多糖组0h0.743(0.007)1.092(0.001)*0.839(0.004)0.984(0.001)6h0.795(0.001)0.795(0.005)0.806(0.0005)0.803(0.007)12h0.766(0.020)0.706(0.016)*0.460(0.005)***0.463(0.005)***24h0.415(0.020)0.207(0.008)**0.278(0.007)**0.220(0.011)**注：***、**、*表示估计结果在0.01、0.05、0.1的水平上显著；括号内的数字为标准误；3.7短链脂肪酸含量的测定短链脂肪酸在调控肠道内免疫细胞的分化以及维护肠道屏障完整性方面发挥着关键作用，这些功能使其与各类肠道疾病发生密切相关。本研究测定了小鼠粪便发酵液中SCFAs（包含乙酸、正丁酸、丙酸、正戊酸、异戊酸以及异丁酸）的含量，结果如表3-3所示。表3-3不同发酵时间发酵液中SCFAs含量Tab.3-3ThecontentofSCFAsinfermentationliquidsacrossdifferentfermentationdurations发酵时间(h)SCFAs（mmol/L）组别丙酸乙酸正丁酸异丁酸异戊酸正戊酸0BLANK8.18±0.0218.60±2.202.40±1.360.01±0.000.00±0.000.12±0.12INULIN6.07±0.1220.49±4.552.08±0.12**0.00±0.000.00±0.000.00±0.00Glucose8.23±5.27*21.18±9.47***2.10±2.100.01±0.010.00±0.000.20±0.20ATPS8.08±0.5820.43±18.92*2.12±0.04**0.00±0.000.00±0.000.00±0.006BLANK13.85±1.1251.63±2.764.36±1.160.02±0.0040.01±0.0040.001±0.001INULIN6.47±1.06***69.50±11.66*4.43±0.890.01±0.002*0.004±0.001*0.001±0.001Glucose6.79±1.50***92.10±18.05**4.49±0.600.03±0.010.01±0.0020.02±0.01**ATPS8.47±1.58***71.43±13.00*3.47±0.730.001±0.001***0.01±0.0020±012BLANK23.90±1.2567.13±5.437.45±1.020.004±0.0010.003±0.0010.002±0.001INULIN39.81±2.05***115.01±3.97***30.13±2.13***0.0001±0.0001***0.05±0.002***0.004±0.003Glucose6.57±1.54***102.80±22.57*5.33±0.95*0.004±0.0030.04±0.01***0.004±0.002ATPS24.31±4.57104.01±21.53*3.34±0.87**0.001±0.001**0.02±0.005**0±0**24BLANK47.78±3.4386.54±9.3520.17±2.510.00±0.000.03±0.0010.001±0.0003INULIN65.88±1.60***163.14±8.67***57.61±2.87***0.00±0.000.02±0.004*0.00±0.00**Glucose8.88±3.01***102.59±10.81*1.30±1.30***0.00±0.000.01±0.001**0.00±0.00**ATPS93.73±12.63***154.25±16.51***4.09±0.54***0.00±0.000.02±0.003*0.00±0.00**注：***、**、*表示估计结果在0.01、0.05、0.1的水平上显著；括号内的数字为标准误；3.8ATPS分子量变化安茶多糖(ATPS)因其结构的特性通常能抵抗上消化道的酶解，能被运输到结肠作为微生物的潜在底物。图3-6HPGPC色谱图表现了安茶多糖组(ATPS)在不同发酵时间点的响应曲线。由图中可见，6h时的曲线形态与0h相比产生了非常明显的变化。每个时间段曲线的主峰向更短的保留时间移动，同时，其峰形也变得更为复杂。在12h和24h时，色谱图的形态又逐渐恢复，与0h时的形态更为接近，但峰响应值也有所降低。总得来说，ATPS大分子在0h~6h之间会被快速降解或转化为其他物质。图3-6ATPS体外发酵过程中分子量的HPGPC色谱图Figure3-6HPGPCchromatogramofATPSmolecularweightduring

invitro

fermentation这个结果就清晰地表明安茶多糖在模拟厌氧环境中被肠道菌群动态地降解和转化。这种有效的底物利用过程，为后续观察到的pH值变化及SCFAs的产生提供了直接的分子层面的证据，证实了ATPS作为可发酵底物发挥其调节肠道菌群代谢功能的潜力。4讨论茶多糖是茶叶中一类十分重要的天然活性高分子物质碳水化合物，具有一定抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、抗皮肤老化以及其抑制糖尿病、增强免疫力的能力REF_Ref14448\r\h[2]。本研究先是提取出安茶中的多糖类物质作为研究对象，通过体外模拟肠道发酵，进而初步探讨安茶多糖(ATPS)的抗氧化活性以及发酵特性。首先，我们对提取制备的ATPS进行了表征。通过PMP衍生结合HPLC技术检测发现，ATPS组成成分中，多糖占比达43.59%，为主要构成物质；同时含有7.50%的多酚与19.78%的糖醛酸，且经鉴定未检测到蛋白质成分，这充分体现了Sevag法在脱蛋白处理上的高效性。基于单糖组成分析结果，ATPS主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成，三者合计占比超过70%。其中较高比例的半乳糖醛酸，有力地证实了ATPS属于酸性多糖。而FTIR光谱结果也佐证了这一点，3424cm-1处的O-H伸缩振动REF_Ref7366\r\h[22]、2929.34cm-1处的C-H伸缩振动REF_Ref8519\r\h[23]，及1735.13cm-1（酯羰基）和1629.73cm-1REF_Ref8695\r\h[24]（羧酸根离子）等处的特征吸收峰，都是多糖特别是酸性多糖的典型特征。ATPS的这些结构特点，特别是酸性基团的存在，通常与多糖的溶解性、持水性及生物活性密切相关，并且可能影响其与肠道微生物的互作方式REF_Ref7366\r\h[22]。为了进一步探究ATPS是否能被肠道菌群利用并调节其代谢活性，我们构建了体外发酵实验。在体外发酵实验中，ATPS展现出良好的被肠道菌群利用的特性。发酵液pH值的显著下降（从7.04降至5.57），以及总糖含量的持续消耗，都表明了ATPS可作为碳源被来自肥胖小鼠的粪便菌群有效地发酵，并且产生酸性代谢产物。这一现象也与菊粉和葡萄糖等阳性对照组观察到的趋势一致，并与其他研究中关于可发酵膳食纤维（如秋葵果胶多糖）的报道相符REF_Ref10491\r\h[26]。根据HPGPC色谱图分析，我们可以观察到，在发酵初期（0-6h）ATPS的分子量迅速发生变化，大分子多糖逐渐被分解。这一结果就直接证明了肠道菌群对ATPS有分解作用，能够将其转化为更容易被利用的小分子片段。这种降解过程与CHENG等人REF_Ref22636\r\h[27]对茯砖茶多糖体外发酵的研究结果非常相似，他们也观察到了多糖在发酵过程中分子量会显著降低并且发生结构的改变。发酵液pH值的下降通常与短链脂肪酸（SCFAs）的产生密切相关。研究显示，通过降低肠腔pH值，可以有效抑制部分有害微生物的活动，并为有益的结肠菌群创造更佳的生长环境REF_Ref7366\r\h[22]。ATPS的发酵显著促进了短链脂肪酸（SCFAs）的产生。与空白对照组相比，ATPS组在发酵24h后，乙酸和丙酸的产量都有显著的提高，总SCFAs产量也大幅增加。乙酸、丙酸和丁酸是肠道菌群发酵膳食纤维产生的主要SCFAs，它们不仅为肠道上皮细胞提供能量，还在调节宿主代谢、免疫及肠道屏障功能中发挥核心作用REF_Ref8519\r\h[23]。本研究中SCFAs产量的增加，特别是乙酸和丙酸的提升，与许多关于茶多糖益生效应的研究结果一致，例如许凌凌等人REF_Ref25447\r\h[29]发现普洱茶多糖能够调节健康小鼠短链脂肪酸代谢。这些结果表明，ATPS能够通过模拟体外发酵，产生有益的代谢产物，从而可能对宿主健康产生积极影响。除了作为发酵底物调节肠道菌群代谢外，我们还进一步评估了ATPS本身的直接生物活性，特别是它的抗氧化能力。通过对DPPH、超氧阴离子、ABTS+和羟基自由基的清除实验发现，ATPS确实具有多方面的体外抗氧化活性，并且这种活性与其浓度呈正相关，尤其对超氧阴离子和ABTS+自由基的清除效果较为显著。茶多糖的抗氧化活性已被广泛报道REF_Ref2514\r\h[30]，这种直接的抗氧化能力可能有助于减轻肠道内的氧化应激，为肠道细胞提供保护，从而协同其通过调节菌群产生的间接健康效应。综上所述，本研究通过体外实验证实了安茶多糖（ATPS）不仅具有直接的抗氧化活性，更重要的是能够作为一种可发酵底物，被肥胖小鼠的肠道菌群有效利用，然后能够促进有益代谢产物短链脂肪酸的生成、pH值的降低和自身分子量的降解。这些发现与先前对其他黑茶（如茯砖茶REF_Ref22636\r\h[5]、普洱茶REF_Ref25447\r\h[10]）多糖的研究结果相似，共同表明茶多糖在调节肠道微生态平衡和促进健康方面具有巨大潜力。本研究为安茶多糖的益生功能提供了实验依据，并为其作为功能性食品或益生元制剂的开发提供了理论支持。结论与展望本研究通过研究安茶多糖（ATPS）抗氧化特性以及其发酵特性，证实了安茶多糖确实具有良好的益生潜力和抗氧化能力。研究结果表明，ATPS作为一种高分子量多糖，能够在体外进行模拟结肠的发酵。并且会出现pH值显著下降、总糖消耗及其分子量动态变化。非常关键的是，短链脂肪酸(SCFAs)分析表明，与空白对照组相比，ATPS处理显著提高了总SCFAs的产量，尤其是乙酸、丙酸的水平得到显著提升。与此同时，我们也发现ATPS具备一定的抗氧化能力，尤其在较高浓度下会对特定自由基的清除能力较强。这与其结构中存在一定的酸性基团以及多酚类物质密切相关。所以，我们认为安茶多糖不仅具有天然抗氧化剂的潜力，更是一种可发酵底物，具备有效调节肠道代谢功能，促使其产生有益健康的代谢产物。本研究证实了安茶多糖（ATPS）在体外能够促进有益短链脂肪酸（SCFAs）的生成，为后续研究奠定了坚实基础。未来的研究重点应在于揭示其作用的微生物机制，即通过16SrRNA测序等技术明确ATPS如何塑造肠道菌群结构，以及哪些特定菌群（尤其是产丁酸菌）的增长与观察到的SCFAs谱变化直接相关。最终，通过体内动物实验验证这些体外发现，评估长期补充ATPS对肥胖模型动物的体重控制、代谢改善、炎症抑制和肠道屏障功能的实际效果，并阐明其体内分子机制。此外，探索ATPS的最佳剂量、来源差异及与其他功能成分的协同作用，将加速推动其作为功能性食品或微生态制剂的开发与应用。参考文献张彪,王思强,姚婷,等.祁门安茶的研究进展[J].食品安全导刊,2021,(16):56-59.韩艾利,李立祥,徐小倩.安茶品质与化学成分分析[J].茶业通报,2016,38(02):79-83.YuC,AhmadiS,ShenS,etal.Structureandfermentationcharacteristicsoffivepolysaccharidessequentiallyextractedfromsugarbeetpulpbydifferentmethods[J].FoodHydrocolloids,2022,126:107462.XUL,CHENY,CHENZ,etal.Ultrafiltrationisolation,physicochemicalcharacterization,andantidiabeticactivitiesanalysisofpolysaccharidesfromgreentea,oolongtea,andblacktea[J].JournalofFoodScience,2020,85(11):4025-4032.孙玉姣,马芸皓,王凡,等.不同提取方法对茯茶多糖理化性质和抗氧化作用的影响[J].陕西科技大学学报,2021,39(05):31-38.LOOYT,HOWELLK,CHANM,etal.Modulationofthehumangutmicrobiotabyphenolicsandphenolicfiber-richfoods[J].ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety,2020.19(4):1268-1298.G.Chen,Y.Bai,Z.Zeng,etal.StructuralcharacterizationandimmunostimulatoryactivityofheteropolysaccharidesfromFuzhuanbricktea[J].Agriculcural.FoodChemistry.69(2021),pp.1368-1378王广.党参多糖对肠道菌群失调小鼠的调整作用机制的初步研究[D].佳木斯市:佳木斯大学,2010.SunY,LiS,CaoJ,etal.DigestionCharacteristicsandProbioticActivityofAnTeaPolysaccharides:PromotingLactobacillusandBifidobacteriumInVitroandInVivo[J].Fermentation,2025,11(2):97.FlintHJ,ScottKP,LouisP,etal.Theroleofthegutmicrobiotainnutritionandhealth[J].NaturereviewsGastroenterology&hepatology,2012,9(10):577-589.MitraS,IzumiT,BoldoghI,etal.IntracellulartraffickingandregulationofmammalianAP-endonuclease1(APE1),anessentialDNArepairprotein[J].DNArepair,2007,6(4):461-469.Wang,J.,Hu,S.,Nie,S.,Yu,Q.,&Xie,M.Reviewsonmechanismsofinvitroantioxidantactivityofpolysaccharides.OxidativeMedicineandCellularLongevity,2016,5692852.Zhang,L.,Li,Z.,Wang,M.,&Chen,J.AntioxidantandimmunomodulatoryactivitiesofpolysaccharidesfromGanodermalucidum.InternationalImmunopharmacology,4(2),231-239.YINL,FUS,WUR,etal.Aneutralpolysaccharidefromgreentea:Structure,effectonalpha-amylaseactivityandhydrolysisproperty[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics,2020,687:108369.CHENH,HUANGY,ZHOUC,etal.Effectsofultra-highpressuretreatmentonstructureandbioactivityofpolysaccharidesfromlargeleafyellowtea[J].FoodChemistry,2022,387:132862.陈