TBDF对小鼠肝脏RNA肥胖靶基因的表达分析

目录1814摘要 A1A2A3B1B2B3H1H2H3N1N2N3图1小鼠肝脏碱基错误分布图（上）及碱基含量分布图（下）2.1.2小鼠肝脏样本相关性用红色代表相关系数为1，借助不同颜色的方块来展现两个样本相关性的程度。经检测，各组小鼠肝脏基因表达水平的相关系数均在0.75以上，其中大部分更是超过0.90，十分接近1。这一数据表明，基因在各组肝脏样本中的表达量极为相似，也就意味着这批肝脏样本之间具有良好的相关性，由此得出的后续分析结果具备较高的参考价值REF_Ref9356\r\h[1]（图2）。图2小鼠肝脏样本间相关性热图PAGEPAGE22.1.3小鼠肝脏转录组差异基因表达分析设定将差异倍数FoldChange≥1.5和错误发现率FDR作为筛选标准，log2FC的绝对值越大，FDR值越小的基因差异变化越明显REF_Ref22092\r\h[19]。获得各组之间的DEGs。(图3)。图3小鼠肝脏转录各表达量差异统计图将A组与B组、H组与A组、H组与B组、N组与A组、N组与B组、N组与H组的六个比对记为G1组、G2组、G3组、G4组、G5组、G6组。G1G2G3G4G5G6图4小鼠肝脏转录组间表达差异火山图2.1.4小鼠肝脏转录组DEGs的维恩分析(Venn分析)对4组小鼠肝脏转录组测序后的DEGs进行Venn分析。G1组与G2组两组之间共有244个DEGs；G1组与G3组两组之间共有55个DEGs；G1组与G4组两组之间共有339个DEGs；G1组与G5组两组之间共有122个DEGs；G1组与G6组两组之间含相同DEGs共37个；G2组与G4组两组之间共有87个DEGs；G2组与G3组两组之间共有316个DEGs；G1组与G3组两组之间共有122个DEGs；G2组与G5组两组之间共有67个DEGs；G2组与G6组两组之间共有63个DEGs；G4组与G3组两组之间共有44个DEGs；G4组与G5组两组之间共有88个DEGs；G4组与G6组两组之间共有59个DEGs；G5组与G3组两组之间共有186个DEGs；G5组与G6组两组之间共有89个DEGs；但六组之间没有相同DEGs(图5)。图5小鼠肝脏转录组差异基因Venn图2.1.5小鼠肝脏转录组DEGS的GO富集分析GO分析主要由三个关键部分构成，分别是生物学过程（BiologicalProcess）、分子功能（MolecularFunction）以及细胞组分（CellularComponent）。GO体系里的基础单元是term（条目或节点），每一个term都具备相应的属性与之对应。基于基因注释的结果，在GO数据库的二级分类层面，对差异表达基因开展分类统计，如此一来，便能直观地知晓与差异基因主要相关的功能条目，为直观呈现富集结果中的Term，可转化为柱状图等可视化图形。分析GO功能富集信息能预测差异基因功能，以qvalue值越低越显著，我们发现在GO分析过程中BP（生物过程）层面所表现出的有关控制脂肪的基因作用更加显著，富集到的数目也更多，所以重点研究BP层面。GO富集结果气泡图见图6。G1G2G3G4G5G6图6小鼠肝脏转录组DEGs各组之间的GO富集分析气泡图2.1.6小鼠肝脏转录组DEGdsKEGG富集分析利用KEGG富集分析筛选肝脏脂质代谢显著富集Pathway，可视化结果如下。G1G2G3G4G5G6图7小鼠肝脏转录组DEGs各组之间的KEGG富集分析气泡图2.1.7小鼠肝脏脂质代谢异常的基因筛选通过GO和KEGG富集分析方法，能够明确不同饮食干预手段会致使小鼠肝脏内与脂质代谢相关的基因通路产生变化。基于此，研究设定了严格的筛选标准，将|log2FC|≥1.5且P<0.05作为判定基因显著表达的依据，旨在从显著富集的脂质代谢相关通路里，筛选出了存在差异表达的脂质代谢相关基因（DEGs）。GO富集分析主要包括BP、CC、MF三大类。我们发现在GO分析过程中BP（生物过程）层面所表现出的有关控制脂肪的基因作用更加显著，富集到的数目也更多，所以重点研究BP层面。通过KEGG富集分析，筛选肝脏脂质代谢相关通路。G1组涉及肝脏脂质代谢相关通路主要为AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用（signalingpathwayincomplicationsofdiabetes）；G2组涉及肝脏脂质代谢相关通路主要为青少年发病型糖尿病（Juvenileonsetdiabetes）；G3组涉及肝脏脂质代谢相关通路主要为类固醇生物合成（Steroidbiosynthesis）、皮质醇的合成和分泌（Synthesisandsecretionofcortisol）、PPAR信号通路（PPARsignalingpathway）、胆固醇代谢（cholesterolmetabolism）；G4组涉及肝脏脂质代谢相关通路主要为类固醇激素的生物合成（Thebiosynthesisofsteroidhormones）、PPAR信号通路（PPARsignalingpathway）；G5组涉及肝脏脂质代谢相关通路主要为类固醇生物合成（Steroidbiosynthesis）、胆固醇代谢（cholesterolmetabolism）、胆固醇代谢（cholesterolmetabolism）、花生四烯酸代谢（arachidonicacidmetabolism）；G6组涉及肝脏脂质代谢相关通路主要为类固醇生物合成（Steroidbiosynthesis）、PPAR信号通路（PPARsignalingpathway）、青少年发病型糖尿病（Juvenileonsetdiabetes）如图7。图G1涉及肝脏脂质代谢相关生物过程的条目主要有：细胞对脂磷壁酸的反应（Cellresponsetolipoteichoicacid），主要受调控的基因为Nr1d1、Cd14、Lbp。其中基因Cd14显著下调，会引起免疫细胞对脂磷壁酸的识别能力下降，这可能导致机体对细胞感染的抵抗力降低，使慢性炎症状态更易持续的存在，慢性炎症会干扰脂肪代谢和能量的平衡，促使脂肪在体内逐渐增多聚拢，增加小鼠肥胖风险。脂多糖的细胞反应（Cellularresponsetolipopolysaccharide），主要受调控的基因为Nr1d1、Tbxa2r、Trim41、Cx3cr1、Lbp、Nfkb2、Ly96、Vim、Il1b、Bcl10、Pde4b、Tnfrsf1b、Trib1、Cxcl10、Ccl2、Spon2、Serpine1、Akap12、Hmgb2、Fcgr4。其中基因Lbp主要影响脂多糖的结合与转运、传递受体、放大免疫信号，且Lbp基因显著下调，会通过影响脂多糖的信号通路干扰体内激素的正常分泌作用，可能使瘦素分泌减少，增加其食欲，能量消耗减少，从而使得体重增加；结合上述结果可以看出，TBDFB组（饮用水加2g/100mlTBDF）比TBDFA组（饮用水加1g/100mlTBDF）对小鼠的体重增加干扰效果更好。图G2涉及肝脏脂质代谢相关生物过程的条目主要为细胞对脂多糖的反应（Cellresponsetolipopolysaccharide），主要受调控的基因为Cmpk2、Nfkb2、Ly96、Pde4b、Tnfrsf1b、Trib1、Cxcl10、Ccl2、Akap12、Jun、Gbp6、Cnp、Pdcd4、Tbxa2r、Cactin。其中基因Ly96能增强基因Cd14对脂多糖的敏感性、其上调会引起胰岛素的抵抗，使身体对葡萄糖的摄取和利用能力下降，多余的葡萄糖会通过糖代谢转化为脂肪，进而促进肥胖；其中基因Nfkb2显著上调，同样会引发炎症，活化后会抑制脂肪分解基因的活性，进而促进肥胖；其中基因Ccl2显著上调，会使得编码单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达增加，它能聚集单核细胞、巨噬细胞到脂肪组织，引发局部炎症，干扰脂肪代谢从而使其含量增加；其中基因Cxcl10显著上调，编码趋化因子IP-10表达增多，它会吸引自然杀伤细胞、T淋巴细胞等免疫细胞聚集到脂肪组织，导致脂肪合成分解失衡，促进其积累。结合上述结果可以看出，TBDFA组（饮用水加1g/100mlTBDF）比HDF组（高脂对照）更能抑制小鼠的体内炎症，使脂肪分解代谢平衡稳定，小鼠的体重增加干扰效果更好。图G3涉及肝脏脂质代谢相关生物过程的条目主要为细胞对胰岛素细胞的刺激反应（Stimulusresponsetoinsulincells），主要受调控的基因为Gpt2、Baiap2l1、Cpeb2、Dnaic1、Grb10、Anxa1、Got1、Ppargc1a、Eif4ebp1、Plcb1。其中基因Grb10下调，对胰岛素受体机制抑制作用减弱，使得胰岛素信号加强，细胞过度摄取葡萄糖在细胞体内转化为脂肪储存；其中基因Ppargc1a下调，可以使得线粒体和脂肪酸氧化过程减弱，细胞消耗能量减少，更多的能量以脂肪的形式储存，导致体重增加；其中基因Eif4ebp1下调，可以抑制蛋白质的合成，可能导致细胞代谢率降低，能量消耗减少，多余的能量易转化为脂肪储存。结合上述结果，可以看出TBDFB组（饮用水加2g/100mlTBDF）比HDF组（高脂对照）更能稳定胰岛素的信号机制，使其正常代谢，促进线粒体和脂肪酸的氧化过程，从而使得脂肪堆积减少。图G5涉及肝脏脂质代谢相关生物过程的条目主要为胆固醇内稳态（Cholesterolhomeostasis），主要涉及的基因为Cyp7b1，Stard3nl，Pltp，Cyp7a1，Apoa5，lipq，Abcg8，Nceh1，Cln6，Abcg1，Abcg5。其中基因Cyp7b1上调加速胆固醇转化为胆汁酸，促进肝脏摄入血液中的低密度脂蛋白胆固醇，降低血液中胆固醇水平，有助于减轻肥胖。从上述结果中，可以看出ND组（正常对照组）比TBDFB组（饮用水加2g/100mlTBDF）对肥胖的抑制效果更好，所以对于体重的增加方面，摄入一定的膳食纤维虽然也能帮助控制肥胖，但是控制饮食清淡，少摄入高脂食品对体重的减少十分重要，比摄入高脂食品后再摄入膳食纤维来减肥效果更好。图G6涉及肝脏脂质代谢相关生物过程的条目为糖酵解过程的负调节（Glycolysisprocess），主要涉及基因为Ppara，基因Ppara显著下调，使得过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达减少，使得糖酵解的关键酶活性增加，减少葡萄糖转化为脂肪的机会，还可以抑制乙酰辅酶A羧化酶的活性，减少脂肪酸的合成，同时也有助于抑制食欲，减少能量的摄入，从而对肥胖起到抑制作用，从上述结果中，我们可以看出ND组（正常对照组）比HDF组（高脂对照）抑制肥胖效果更好。综上所述，各组基因表达结果肥胖抑制作用从强到弱结果如下：ND组（正常对照）、TBDFB组（饮用水加2g/100mlTBDF）、TBDFA组（饮用水加1g/100mlTBDF）、HDF组（高脂对照）。3讨论根据测序结果显示，在脂多糖合成与代谢通路上存在差异基因的表达，我们筛选出变化与假设结果一致的Lbp脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharidebindingprotein)基因，它是一种重要的免疫调节蛋白，近年来发现它在脂质代谢和肥胖中扮演着非常关键的角色。脂多糖结合蛋白(Lbp)是一种由肝脏合成的急性期反应蛋白，分子量约为58-60kDa，属于模式识别分子家族成员。Lbp最初被发现能够识别并结合革兰阴性细菌细胞壁成分——脂多糖(LPS)，主要在免疫防御中发挥作用。方皓舒团队研究发现NAC处理实验为Lbp相关肥胖的治疗提供了线索，NAC能有效诱导LBPKI/KI小鼠外周脂肪细胞的脂解，处理3小时即可逆转淀粉诱导的TG积累，伴随血清游离脂肪酸(FFA)水平升高和TG水平降低这些结果支持抗氧化疗法作为治疗Lbp引起肥胖的潜在策略，研究人员提出，Lbp作为抗氧化剂和氧化应激躲避的核心分子，是连接压力和氧化应激以及肥胖的重要枢纽REF_Ref17907\r\h[22]。这一理论框架为理解肥胖的分子机制开辟了新视角，也为开发针对性治疗策略提供了科学依据。这一系列发现暗示，在肥胖小鼠摄入苦荞膳食纤维的干预过程中，或许能通过Lbp基因调控肝脏转录组的方式，对机体脂质代谢过程产生影响REF_Ref3504\r\h[21]。4结论与展望我们从生物过程BP层面研究发现，不同浓度的苦荞膳食纤维会对脂肪有不同的抑制作用，主要表现在脂多糖的基因调控上，关键基因Lbp下调，说明饮用水中添加2g/100ml苦荞膳食纤维喂养小鼠对比水中添加1g/100ml苦荞膳食纤维喂养小鼠后的苦荞膳食纤维组肥胖抑制效果更好。高脂饲料喂养的小鼠配合少量的苦荞膳食纤维后，对比完全高脂喂养的小鼠，前者对肥胖的抑制效果更好，也主要体现在脂多糖的基因调控上。适当增加苦荞膳食纤维的添加量，对肥胖的抑制作用会更佳，主要是因为膳食纤维量增加引起细胞对胰岛素刺激反应的相关基因的表达，胰岛素是调节葡萄糖代谢的关键，决定了细胞摄入葡萄糖量的多少，改善肥胖更直观更有效。从正常对照与加了膳食纤维的高脂组比较结果中，我们可以看出，正常组抑制肥胖的效果更好，这主要体现在胆固醇内稳态的相关基因调控上。从正常组与高脂对照组的比较结果中我们可以看出，正常组抑制肥胖的效果更好，这主要体现在糖酵解的负调控的相关基因调控上。综上所述，综合表达结果符合预期，可以间接阐明TBDF对脂肪的生成有抑制作用。与多项研究中膳食纤维能对减肥起到促进作用结论一致。对该问题进行深入探索可为临床选择科学合理的饮食策略提供可靠证据，并可通过探讨其背后机制进一步寻找减重因子，本研究通过饮食组分调控的形式，连续性观察肥胖小鼠的基因表达相关变化REF_Ref9356\r\h[1]，在本次科研探索中，借助转录组学测序技术，以肝细胞因子为切入点，致力于挖掘能够助力体重减轻的关键因子，进而为深入探究体重减轻后维持机制筑牢理论根基与数据支撑。研究尚未进行mRNA及蛋白水平的验证，以及相关通路研究，后续将进一步行验证工作REF_Ref9356\r\h[1]。参考文献孙烁烁.脂质代谢相关肝脏mRNA转录组在肥胖小鼠减重及体重恢复中的变化及意义[D].南京:南京中医药大学,2022芦淑娟.苦荞种籽抗氧化特性与麸皮膳食纤维研究[D].陕西:西北农林科技大学,2010张小雪.不同剩余采食量羔羊生产性能和瘤胃微生物区系及肝脏转录组研究[D].甘肃:兰州大学,2019程贤鹦,何银辉.神经调节蛋白4在肥胖及代谢性疾病作用的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2019,13(09):684-688符旭栋.柠檬皮渣膳食纤维制备及生物改性研究[D].重庆:西南大学,2022范涛.蛋白组学—基因组学联合分析揭示拟南芥通过选择性剪接和选择性翻译响应ABA信号[D].山东:山东农业大学,2016武惠岩,刘璐璐,杨辉等.利用转录组测序技术分析ADC和NOS基因mRNA在鹅等级前卵泡中的表达[J].吉林农业大学学报,2017,39(04):465-470+476.武妍凝,吴莉,伍荷洁等.从多糖利用位点的差异表达研究两种健脾中药复方多糖影响脆弱拟杆菌体外生长机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(22):21-28张如平,卢艳平,曾炳山等.相思杂种优势的转录组初步分析[J].分子植物育种,2021,19(05):1516-1521王婷婷,陈鸽,包悦琳等.大豆根系响应早期缺铁胁迫的转录组分析[J].南京农业大学学报,2022,45(02):224-234孟珍,黎建辉,周园春等.一种基因序列测序数据质量控制方案[J].科研信息化技术与应用,2012,3(02):25-34吴迪,张燕燕,林楠等.基于代谢组学和转录组学探究草珊瑚叶和根中黄酮类成分差异积累的转录调控机制[J].中国中药杂志,2023,48(21):5767-5778高原,朱晓东,李梦圆,等.基于转录组RNA测序分析牙髓炎中的核心基因[J].口腔生物医学,202