T-CVMA 309-2025 非洲猪瘟病毒检测纳米抗体夹心ELISA方法

法中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。1非洲猪瘟病毒检测纳米抗体夹心ELISA方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语ASF：非洲猪瘟（AfricanSwineFever）ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwinELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssHRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidasPBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSalinSDAL：抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL（NanobodySSDAZ：抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAZ（NanobodyS采用双抗体夹心ELISA反应原理，酶标板上包被抗ASFVp30蛋白的纳米抗体SDAL，捕获待检样品中的ASFV抗原，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗A2物后不显色；根据样品检测的吸光度，可以定性39检测操作步骤9.1样品处理血液样品反复冻融3次，检测时无需稀释。组织样品用生理盐水按照1:10倍稀释（1g组织生理盐水用组织研磨器或其他工具将组织研磨混匀，3000r/min离心5min，取上清9.2配置洗涤液将25×浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至工作浓度备9.3包被弃去液体，每孔加300μL洗涤液洗板3次，弃去残液，置9.5封闭每孔加200μL封闭液，置37℃条件下孵育1h；洗涤1次后，置于吸水纸上拍干。9.6加待检样本和对照样本孵育封板膜封板，37℃条件下孵育30min。9.8加酶标记抗体孵育9.10加底物显色9.11终止显色4若样品OD450nm＜0.2时，判定为非洲猪瘟病毒抗原阴性。若样品0.2≤OD450nm＜0.3时，判定5A.1生产用菌种的培养表达抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL的工程菌种为BL21-ASFV-SDAL，将工程菌种按1:1种LB培养液（含100μg/mL卡那霉素），在37℃条件下，以220r/min振荡培养5h。A.2抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL取新鲜培养的工程菌种BL21-ASFV-SDAL按1:100比例接种LB培养液（含100μg/mL卡那霉素），在37℃条件下，以220r/min振荡培养至OD600nm值为0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃A.3抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL12000r/min离心10min，收集上清，上清用0.45μ-20℃以下保存备用。纳米抗体SDAL的纯度不低于90%，浓度不低于1mg6表达抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAZ的工程菌种为BL21-ASFV-SDAZ，将工程菌种按1:1种LB培养液（含100μg/mL卡那霉素），在37℃条件下，以220r/min振荡培养5h。B.2抗ASFVp30蛋白纳取新鲜培养的工程菌种BL21-ASFV-SDAZ按1:100比例接种LB培养液（含100μg/mL卡那霉素），在37℃条件下，以220r/min振荡培养至OD600nm值为0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃B.3抗ASFVp30蛋白纳12000r/min离心10min，收集上清，上清用0.45μm的滤器的咪唑，同样的方法洗脱3次，除去杂蛋白；开阀门，收集洗脱液，共洗脱10次，经SDS过夜透析，-20℃以下保存备用。纳米抗体SDAZ的纯度不低于90%，浓度不低于1mg/ml。7将上述溶液装入透析袋中，置2000mL的0.05mmol/L碳酸盐缓冲液中透析和硫酸铵溶液，4℃放置30min，4℃条件下4000r/min离心20min，弃上清。将沉淀溶于少量PBS溶液离心30min，吸取上清，无菌定量分装，-20℃以下保存备用。8D.1.1ASFVp30重组蛋白的制备37℃条件下，以220r/min振荡培养至OD600nm值为0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃条件下诱导表达5h后收集菌液。将收集的菌液置2℃~8℃、以6000r/min离心10min，收集BL21-ASFV-p30菌体，PBS重悬洗涤3次后，置冰浴进行超声破碎，以悬液趋于透明，吹吸时无明显凝用Bradford方法测定纯化的ASFVp30蛋白的浓度，将纯化的蛋白浓度定量9溶液配制称取1.59gNa2CO3称取20gBSA，加入PBS溶液