生物工程实验指导-课件 08-细胞工程实验

细胞工程实验实验一

培养材料灭菌和接种实验二

愈伤组织的诱导与增殖实验三

愈伤组织的分化实验四

植物细胞悬浮培养与同步化实验五

细胞原代培养实验六

细胞传代培养实验七

细胞的冻存和复苏实验八

骨髓干细胞的提取及培养实验九

细胞的分裂指实验十

细胞周期的测定实验一

培养材料灭菌和接种1实验目的培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中的一个重要环节。通过本实验,了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求,初步掌握培养材料灭菌,接种的操作技术。2实验原理无菌操作是在无菌室或超净台中进行,防止微生物进入人体或污染供试菌的操作技术。它是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。无论植物组织培养,还是动物细胞培养,都需要无菌技术的支撑。本实验涉及无菌操作台的操作规范,防止微生物感染破坏培养目标的连续培养,是一切细胞培养的基础。3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜块根、绿豆种子。3.2仪器设备超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯(50mL)、广口瓶(200mL)、一次性培养皿。3.3试剂0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、培养基母液。4实验步骤(1)准备好培养基,无菌水,培养皿及接种工具。(2)将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上,打开超净台紫外灯开关,同时打开接种室内的紫外灯,用紫外灯照射至少25min。然后,关室内紫外灯,打开送风开关,关闭台内的紫外灯,通风10min后,再开日光灯进行无菌操作。(3)接种前用肥皂洗手,特别是将手指洗净,然后用蘸有75%酒精的棉球把手消毒一次。(4)将绿豆种子在流水下冲洗干净。(5)将绿豆种子放于200mL广口瓶中,用75%的酒精溶液浸泡30s,然后用无菌水冲洗。接下来用0.1%升汞溶液(加入吐温2滴)浸泡样品,分别设置3mm、5mm、10min三个梯度处理时间,其间不断摇动溶液,然后用无菌水洗涤5遍,待用。(6)解除三角瓶上捆扎的线绳。必要时,可以用蘸有75%酒精的棉球擦洗三角瓶表面。将三角瓶整齐排列在接种台左侧,用75%酒精擦洗接种台表面。(7)接种用的镊子使用前插入95%乙醇溶液中,使用时在酒精灯上烧片刻,冷却后待用。(8)在酒精灯火焰旁揭去封口膜,将瓶口倾斜接近水平方向,用火焰灼烧瓶口。灼烧时应不断转动瓶口(靠手腕的动作,使试管口沾染的少量菌得以烧死),左手持瓶,使其靠近火焰,右手将烧过的镊子触动培养基部分,使其冷却。夹取绿豆种子,将其放在培养基上,用镊子轻轻按一下,使其部分浸入培养基。每瓶可放4~6个外植体。(9)转动瓶口灼烧后,将封口膜从酒精灯火焰上过一下,盖上封口膜,扎好绳子,标上接种日期、材料名称、姓名等。(10)将接种材料移到培养室培养。4实验步骤※注意事项:①从室外取得材料,要用自来水冲洗数分钟,对表面不光滑或长有绒毛等结构、不容易洗净的材料,冲洗时间要长,必要时可用毛刷刷洗。②外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素,最好选用两种消毒剂交替浸泡。初次实验时,灭菌时间要设置一定的时间梯度,以确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂见表8-1。4实验步骤③在工作台接种时,应尽量避免明显扰乱气流的动作(如说、笑、打喷嚏),以免影响气流,造成污染。另外,操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。④接种前培养基出现大量污染现象,若菌类只存在于培养基表面,且主要是真菌污染时,可能由培养瓶密封不严或存放环境不洁净、微生物种群密度过高所致。若污染菌存在于培养基内部,则可能是使用了污染的贮藏母液。此外,培养瓶不洁净或灭菌不彻底也是导致接种前污染的重要原因。避免此现象发生的方法包括:保持操作环境洁净,杜绝使用污染的母液,严格执行高压蒸汽灭菌程序,确保达到规定的灭菌时间和温度。⑤接种后,若培养基出现大面积污染且菌落分布不匀,此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能的原因包括:接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸,以及超净工作台出现故障等。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净,并定期用甲醛等熏蒸灭菌;在接种前,无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20~30min;用75%酒精喷雾进行杀菌和降尘,超净台开启15~20min后方可使用;镊子等接种工具必须经过严格彻底灭菌处理,且每次使用后都要重新灭菌一次;在操作过程中,应经常使用75%酒精等消毒剂擦洗手部、腕部等可能接触到的区域。⑥接种后若外植体周围发生菌类污染,可能由外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法如下:将外植体用饱和洗涤剂浸泡10~15min,然后用自来水冲洗0.5~2h。之后,选择适宜的灭菌剂进行消毒。一般而言,使用0.1%~0.2%的升汞灭菌效果较好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体,可以在灭菌剂中加入“吐温80”等湿润剂,以增加其渗透性,从而提高杀菌效果。5思考题①外植体用消毒剂消毒后,为什么要用无菌水漂洗?有时候会在消毒溶液中加入1~2滴表面活性物质,例如吐温80或吐温20,为什么?②在接种过程中,通过哪些措施来防止细菌对接种工具、接种材料的污染?③对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”?实验二

愈伤组织的诱导与

增殖1实验目的学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素。对有些植物材料而言,生长素和细胞分裂素对维持愈伤组织的快速生长是必要的,特别是两者结合使用时,能更有效地刺激愈伤组织的形成。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜。3.2仪器设备超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯(50mL)、广口瓶(200mL)、一次性培养皿。3.3试剂0.1%升汞、75%酒精、次氯酸钠、无菌水、培养基母液、2,4-D、水解酪蛋白、氯化汞。4实验步骤(1)配制培养基①诱导胡萝卜愈伤组织的培养基:MS+2,4-D1.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH为5.8。②愈伤组织增殖培养基:MS+2,4-D0.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH为5.8。(2)胡萝卜营养根的消毒。①将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净,用小刀切去外围组织。然后将胡萝卜切段,每段厚约0.5cm。②将胡萝卜段用无菌水漂洗干净。③将胡萝卜段在75%的酒精溶液中浸泡30s。④将胡萝卜段在0.1%氯化汞溶液中分别浸泡2min、5min、10min、12min。在浸泡过程中,使用镊子轻轻搅拌,以确保消毒充分。⑤浸泡后的胡萝卜段用无菌水冲洗3~5次,洗去残留的氯化汞后切片。(3)三角瓶的准备解开三角瓶上捆扎的线绳。如有必要,可以用蘸有75%酒精的棉球擦拭三角瓶表面。将三角瓶按培养基处理的要求整齐排列在接种台左侧,然后用75%酒精擦洗接种台表面。4实验步骤(4)胡萝卜营养根切片胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分。在切片消毒之前,首先除去皮层的最外层,以减少胡萝卜营养根的带菌量。形成层的分生能力最强,是产生愈伤组织的主要部分,因此在切片时应使每一个切片上都有形成层。消毒以后的所有操作过程,都应在超净工作台上进行。操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前应插入95%乙醇溶液中,使用时在酒精灯火焰上灼烧片刻,冷却后再进行操作。(5)接种操作过程轻轻打开封口膜,将三角瓶口在火焰上方灼烧2~3s以进行灭菌,同时将长镊子也放在火焰上方灼烧消毒。将烧过的镊子轻轻触动培养基部分,使其冷却,避免高温烧死被接种的外植体。然后,将培养皿打开一小缝,用镊子取出切好的胡萝卜切片,放置在培养基表面,并用镊子轻轻向下按一下,使切片部分嵌入培养基。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈,再次对瓶口进行灼热灭菌。然后用封口膜封口,并在牛皮纸上记录培养材料、接种日期、姓名等信息。※注意事项:植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成极为重要的因素。研究具体问题时,要设置一定的浓度梯度,以寻找最佳浓度。5结果与分析①在接种1周后,观察接种的外植体产生愈伤组织的颜色和质地,计算愈伤组织诱导率。②分析影响愈伤组织诱导和分化的主要原因。实验三

愈伤组织的分化1实验目的了解愈伤组织再分化原理,学习诱导愈伤组织分化的方法。愈伤组织在离体培养过程中,组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达,伴随着反复的细胞分裂,又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织重新分化,而产生新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象,称为再分化。在一定的培养条件下,愈伤组织通过分化可以形成苗或根的分生组织,甚至是胚状体,继而发育成完整的植株。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜。3.2仪器设备超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、烧杯(50mL)、广口瓶(200mL)、一次性培养皿。3.3试剂培养基母液、6-BA、NAA、IBA、蔗糖、琼脂。4实验步骤(1)诱导胡萝卜愈伤组织形成(参见实验二)。(2)配制生芽和生根培养基。①分化培养基(生芽):MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%,pH为5.8。②生根培养基:1/2大量元素+MS其他成分+IBA1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%,pH为5.8。(3)具体操作:按照无菌操作,小心挑取愈伤组织3~5个,放置到分化培养基中。注意标明接种日期和外植体名称。(4)放置培养室培养,10d后统计愈伤组织分化情况。①统计愈伤组织分化率和生根率。5思考题②愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关?实验四

植物细胞悬浮培养与同步化1实验目的学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法及同步化方法。植物离体细胞作为生物反应器,具有生产周期短、提取简单、易规模化、不受外界环境干扰、产量高,以及化学稳定性和化学特性好等特点。因此,利用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者的重视,且已有成功先例。同时,研究发现,在离体培养条件下,细胞系的种类、培养条件、培养基的组成及植物生长调节剂等,均会对次生代谢物质的合成产生重要影响。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜。3.2仪器设备超净工作台、震荡摇床、接种工具、手动吸管泵、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管(20mL)、离心机。3.3试剂培养基母液、2,4-D、蔗糖、琼脂。4实验步骤(1)诱导愈伤组织形成(参见实验二)。(2)制备液体培养基:MS+2,4-D1mg/L+蔗糖3%.(3)在超净工作台上,从形成愈伤组织的培养瓶中,挑选质地松弛、生长旺盛的愈伤组织,放入盛有30mL液体培养基的三角瓶中,用镊子轻轻捏碎愈伤组织。每瓶接入约2g愈伤组织,置于震荡摇床固定,在黑暗条件下或弱散射光下,以100r/min的转速震荡培养。(4)将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中(孔径47μm,81μm或更大)。(5)如果网眼被细胞团堵塞,可用吸管反复吸、吹。(6)再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团。(7)重复步骤4~6。(8)将细胞悬浮液先通过较大孔径的尼龙网过滤,再通过较细孔径(31μm或26μm)的尼龙网过滤,并用吸管反复吸吹,以确保细胞分散均匀。(9)经过分级过滤的细胞,经离心(50g,5min)后收集,然后加入液体培养基进行培养,或进一步同步化处理。5思考题①研究细胞悬浮培养的意义是什么?挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题?②建立细胞悬浮系的步骤包括哪些?一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征?实验五

细胞原代培养1实验目的学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞原代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础,并进一步学习无菌操作技术。将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中,待组织块黏着后,沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞。细胞在生长的同时也发生移动,致使组织培养难以长时间维持其原有结构,最终结果就成了细胞培养。将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置于合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称为原代培养。利用胰蛋白酶消化分解细胞间的连接,将组织解离成单细胞悬液后进行贴壁培养,从而得到大量的组织细胞。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备CO2

培养箱(调整至37℃),一次性培养瓶(75mL3)、一次性培养板、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、棉球、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)。3.3试剂1640培养基(含20%小牛血清)、0.25%胰酶、胎牛血清、Hank’s液、碘酒、酒精。①D-Hank’s液配方:KH2PO40.06g,NaCl8g,NaHCO30.35g,KCl0.4g,葡萄糖1g,Na2HPO4·H2O0.06g,加水定容至1000mL。②Hank’s液配方:CaCl20.14g,KCl0.4g,KH2PO40.06g,MgCl2·6H2O0.1g,MgSO4·7H2O0.1g,NaCl8g,NaHCO30.35g,葡萄糖1g,Na2HPO4·7H2O0.09g,加水定容至1000mL。(注:Hank’s液可以高压灭菌,置于4℃保存)4实验步骤4.1胰酶消化法(1)将妊娠10~14d的母鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置于75%酒精中浸泡2~3s(时间不能过长,以免酒精从口和肛门浸入体内)。再用碘酒消毒腹部。在超净台内解剖取胎鼠(或将新生小鼠直接置于超净台内)。解剖取肝脏,置于平皿中。(2)用Hank’s液洗涤肝脏三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。(3)用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液清洗三次,转移至培养板中。(4)根据组织块的量加入5~6倍体积的0.25%胰酶液(称取所需胰蛋白酶,加入无菌的D-Hank’s溶液中,用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.2~7.4。过滤除菌,分装后置于-20℃冻存备用)。将组织块置于37℃环境中消化20~40min,每隔5min振荡一次,或用吸管吹打一次,以促进细胞分离。(5)加入3~5mL含5%胎牛血清(FBS)的Hank’s液,以终止胰酶的消化作用(或加入胰酶抑制剂)。(6)静置5~10min,使未分散的组织块下沉,将上清液(细胞悬液)转移至离心管中。(7)以1000r/min,离心10min,弃上清液。(8)加入5mLHank’s液,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。(9)加入1~2mL培养液(视细胞量而定),用血球计数板计数细胞。4实验步骤4.1胰酶消化法(10)将细胞浓度调整至约5×105个/mL,转移至75mL3细胞培养瓶中,在37℃下培养。上

述消化分离方法是最基本的方法。在此基础上,可以根据需要进一步分离不同类型的细胞。不同实验室的细胞分离方法可能不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酸酶等)。4.2组织块直接培养法按4.1中操作步骤(1)~(3)操作后,将组织块转移到培养瓶中,使其贴附于瓶底。翻转培养瓶,使瓶底朝上,将培养液加至瓶中,但不要让培养液接触组织块。在37℃下静置3~5h,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(避免组织漂起),继续在37℃下培养。※注意事项:①自取材开始,保持所有组织和细胞处于无菌条件。细胞计数可以在有菌环境中进行。②在超净台中,组织、细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。③凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。④根据组织类型选择适当的消化液,并控制消化时间,尽量减少细胞损伤。5思考题比较组织培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。实验六

细胞传代培养1实验目的以原代培养的胎鼠细胞为材料,学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞传代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础。细胞在培养瓶中长成致密单层后,已基本饱和。为了使细胞能继续生长并扩大数量,必须进行传代(再培养),否则细胞将因密度抑制和接触抑制而停止生长。传代培养不仅是一种保存细胞的方法,也是利用培养细胞进行各种实验的必要步骤。悬浮型细胞传代培养可以直接分瓶,而贴壁细胞需要经过消化后才能分瓶。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备超净工作台、CO2

培养箱、倒置显微镜、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、滤膜。3.3试剂Hank’s液、D-Hank’s液、胰酶溶液、1640培养基。1实验目的以原代培养的胎鼠细胞为材料,学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞传代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础。细胞在培养瓶中长成致密单层后,已基本饱和。为了使细胞能继续生长并扩大数量,必须进行传代(再培养),否则细胞将因密度抑制和接触抑制而停止生长。传代培养不仅是一种保存细胞的方法,也是利用培养细胞进行各种实验的必要步骤。悬浮型细胞传代培养可以直接分瓶,而贴壁细胞需要经过消化后才能分瓶。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备超净工作台、CO2

培养箱、倒置显微镜、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、滤膜。3.3试剂Hank’s液、D-Hank’s液、胰酶溶液、1640培养基。4实验步骤(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去,用2mLHank’s液清洗一次。(2)加入0.5~1mL0.25%胰酶溶液,确保瓶底的细胞完全浸入溶液中。(3)瓶口塞好橡皮塞,放在倒置显微镜下观察细胞。随着时间推移,原贴壁的细胞会逐渐趋于圆形。在细胞还未漂起时,弃去胰酶溶液(约需3min),加入10mLHank’s液以终止消化。观察消化也可以用肉眼,当瓶底发白并出现细针孔状空隙时,消化终止。一般室温下消化时间为1~3min。注意加Hank’s液冲洗细胞时,动作要轻,以免将已松动的细胞冲掉。(4)加入5mL培养液,用吸管吸取培养液将贴壁的细胞吹打成均匀的悬液,吹打时勿用力过猛,以免损伤细胞。(5)将悬浮液分成等份,接种到另外三个培养瓶中,每个培养瓶中加入培养液3mL,塞好橡皮塞,置于37℃培养箱中继续培养。每三天更换一次培养液,观察细胞的贴壁生长情况。5思考题什么是细胞株?什么是细胞系?两者相同吗?实验七

细胞的冻存和复苏1实验目的了解细胞冻存的常用方法和复苏方法,为后续的综合实验奠定基础。在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时,细胞内外的水分都会形成冰晶,这会导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性、甚至引起细胞死亡。如果向培养液中加入保护剂,可以使冰点降低。在缓慢冻结条件下,保护剂能帮助细胞内的水分在冻结前透出细胞,减少冰晶的形成。将细胞贮存在-130℃以下的低温环境中,可以进一步减少冰晶的形成。细胞复苏时,速度要尽可能快,以便迅速通过细胞最易受损的温度区间(-5~0℃)。如果复苏得当,细胞仍能正常生长,活力受损不大。目前,常用的保护剂为二甲基亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管(10mL)、离心机、水浴锅、血球记数板。3.3试剂2.5%胰酶、1640培养基、甘油、DMSO。4实验步骤(1)冻存①按照常规的实验方法消化细胞,将细胞悬液收集至离心管中。②以1000r/min转速离心10min,弃上清液。用Hank’s液清洗1~2次。③使用配制好的Hank’s液+20%胎牛血清+10%甘油或DMSO的细胞冻存液。将沉淀用冻存液稀释,计数,调整细胞浓度至5×106个/mL左右。④将细胞悬液分装至冻存管中,每管1mL。⑤将冻存管口封严。如果使用安瓿瓶,则进行火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。⑥在冻存管上贴上标签,写明细胞种类和冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。⑦按下列步骤降温:室温→4℃(20min)→冰箱冷冻室(30min)→低温冰箱(-30℃,1h)→气态氮(30min)→液氮。(2)复苏①准备一个茶缸或1000mL的烧坏,内装2/3的37℃温水。②从液氮中迅速取出冻存管,立即置于温水中,并不断搅动,使冻存管中的冻存物在1min内融化。4实验步骤③用酒精棉球消毒冻存管表面,打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中,并立即加入5倍以上的Hank’s液。④以1000r/min转速离心10min,弃去上清液。⑤将沉淀加10mL培养液,吹打均匀,再离心10min,弃上清液。⑥加入适量培养基,调整细胞浓度至5×105个/mL。将细胞转移至培养瓶中,37℃、5%二氧化碳、饱和湿度下培养。第二天观察细胞生长情况。※注意事项:冷冻操作和添加液氮时要注意戴保护眼镜和手套,避免液氮伤人。切勿用手直接接触液氮,以免冻伤。液氮要定期检查,当液氮挥发1/2时要及时补充,绝对不能挥发干净。一般30L液氮能用30~45d。留在液氮罐外的细绳要做好标记,并沿着罐口顺序摆放。5思考题在冷冻过程中为什么要用慢速冷冻的方法,而不采用将细胞放入液氮中的超速冷冻方法?复苏时则相反,为什么?实验八

骨髓干细胞的提取及

培养1实验目的了解骨髓干细胞的常用提取方法和培养方法,熟练掌握梯度密度离心技术,为后续的综合实验奠定基础。骨髓间充质干细胞是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞,其细胞特性稳定,即使在连续传代培养和冻存后仍保持多向分化潜能。本实验采用梯度密度离心法。通过在离心管内形成连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质顶部,利用重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。常用的密度梯度离心介质包括氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖等。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备6孔培养板、天平、振荡器、高速离心机、微量移液器(量程:0.5~10μL、20~200μL和100~1000μL)。移液枪(1mL、200μL、20μL、10μL、2μL),吸头(1mL、200μL、20μL)、匀浆管(5mL)、吸头盒(1mL、20μL)、离心管(10mL)、棕色广口试剂瓶(60mL)、青霉素小瓶(分装无水乙醇,高压的DEPC水,-20℃保存)、量筒(50mL、250mL、500mL)、容量瓶(250mL、500mL、1000mL)、试管架(适用于5mL、1.5mL、20μL试管)。3.3试剂淋巴细胞分离液、75%乙醇、α-MEM培养基、胎牛血清。4实验步骤4.1骨髓干细胞提取(1)采用脱颈法处死小白鼠,放在75%的乙醇中浸泡2~3min。(2)在无菌室内间,用灭过菌的剪刀剪下小鼠的四肢,剔除多余的肌肉组织。然后将剔好的骨头浸泡于75%乙醇中2~3min,之后用生理盐水冲洗掉残留酒精和血水。剪去股骨两端,用注射器吸取已加入肝素的生理盐水,反复冲洗小鼠骨髓腔,直至骨头呈白色。最后收集细胞悬液。(3)反复吹打细胞悬液,使其分散均匀。向10mL离心管中加入6mL淋巴细胞分离液,沿着管壁缓缓轻柔地注入3mL细胞悬液。在1800r/min,4℃条件下离心15min。(4)小心取出离心管,用1mL移液枪吸取中间白色絮状的悬浮层,转移至新的10mL离心管中。在1300r/min,4℃条件下离心10min。(5)弃掉上清液后,加入6mL胎牛血清和α-MEM培养基(按1∶9混合)。用吸管轻柔吹打细胞沉淀,使其均匀悬浮于体系中,充分混匀。(6)吸取一滴细胞悬液,在镜下用血球计数板进行细胞计数。4实验步骤4.2骨髓干细胞培养(1)使用含10%胎牛血清的混合培养基,将细胞浓度调整为5×105个/mL。然后将细胞接种于6孔培养板上,放置于37℃、5%CO2、饱和湿度95%的恒温培养箱中培养。(2)培养过夜后,观察细胞生长状况。轻轻吸出上清液,弃掉尚未贴壁的细胞,并加入新配的混合培养液,继续培养。(3)每隔3d左右更换一次培养液(可根据培养液的颜色来确定),并观察细胞生长形态。(4)待小鼠的骨髓间充质干细胞生长至成纤维细胞形态,同时呈旋涡状或放射状生长,细胞之间并不紧靠连成片,且细胞生长接近瓶底的80%时,弃掉上清液,用生理盐水冲洗2~3次,加入0.25%胰蛋白酶没过细胞层,在37℃条件下消化3~5min(根据细胞形态而定)。(5)待细胞呈圆形、不再黏连时,加入1~2滴胎牛血清终止反应。再加入新配制的混合培养基重新悬浮细胞,反复吹打混匀,接种到新的培养板。然后将培养板置于5%CO2、37℃、饱和湿度95%的恒温培养箱中继续培养。(6)培养过夜后换液,弃去未贴壁的细胞,以后每隔2d换培养液,直至细胞贴壁增殖成片,面积为瓶底80%时,重复以上操作,再次传代培养。5思考题除了梯度密度离心法以外,设计另一种干细胞提取方法。实验九

细胞的分裂指1实验目的学习和掌握细胞分裂指数的测定方法。体外培养细胞生长和分裂繁殖的能力可以通过分裂指数来表示。分裂指数与生长曲线有一定的联系。例如,随着分裂指数的不断提高,细胞进入指数生长期。分裂指数是指细胞群体中分裂细胞所占的百分比,是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据。分裂指数测定可以用盖玻片培养法,也可以直接在小平皿中进行。此外,细胞分裂指数也是衡量洋葱根尖细胞分裂状况的指标之一。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备CO2培养箱、超净工作台、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、普通显微镜、细胞培养皿、盖玻片。3.3试剂磷酸盐缓冲液、甲醇、冰醋酸、Hank’s液、D-Hank’s液、胰蛋白酶、NaOH、1640培养基、吉姆萨染液。①磷酸盐缓冲液的配制:KCl0.2g、KH2PO40.2g、NaCl8g,Na2HPO4·7H2O1.56g加水定容至1000mL。②吉姆萨染液配制:准确称取吉姆萨粉末0.5g,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33mL)。在56℃下保温90~120min。加入33mL甲醇,置于棕色瓶中保存,此为吉姆萨原液。使用时按要求用磷酸盐缓冲液稀释,一般稀释10倍。4实验步骤(1)消化细胞,将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。(2)在CO2

培养箱中培养48h,使细胞长在盖玻片上。(3)取出盖玻片,按下列顺序操作:用磷酸盐缓冲液漂洗3min→将盖玻片放入甲醇-冰醋酸(体积比为3∶1)固定液中固定30min→用吉姆萨染液染色10min→用自来水冲洗。(4)盖玻片晾干后反扣在载玻片上,用显微镜观察。(5)计算分裂指数。※注意事项:操作时动作要轻,以免使盖玻片上的细胞脱落。影响分裂指数大小的因素有哪些?