生物工程实验指导-课件 09-发酵工程实验

发酵工程实验实验一

菌种的扩大培养实验二

淀粉糖化及酒精发酵实验三

发酵罐的构造及操作实验四

发酵罐的灭菌实验五

从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析实验六

利用发酵罐进行谷氨酸的发酵生产实验七

柠檬酸产生菌的分离及柠檬酸的固体发酵实验八

固态低盐发酵法制备酱油工艺实验一

菌种的扩大培养1实验目的(1)为发酵罐发酵提供足量的符合质量的菌种。(2)使学生理解发酵的第一环节———菌种扩培在发酵过程中的地位及作用。2实验原理菌种扩大培养基于微生物的生长和繁殖规律进行。这一过程涉及对保藏菌种进行活化和逐级繁殖培养,旨在为发酵生产提供相当数量、代谢旺盛并满足一定生理要求的微生物细胞。菌种扩大培养的目的是让菌体在短时间内快速增殖,与发酵生产过程中的培养目标不同,后者主要为了获得代谢产物。因此,采用的培养条件可能有所不同,接种过程中要注意防止杂菌污染。这一过程还能使菌种得到驯化,同时也有助于缩短发酵时间、保证生产水平。微生物菌种的扩培过程包括几个关键阶段:延迟期、对数期、减速期、稳定期和衰亡期。在不同的生长阶段,微生物的形态、生理和生化特征都会有所不同。因此,需要根据不同的生长阶段来调整培养基成分和环境条件,以促进微生物的生长和繁殖。在菌种的扩培过程中,一般采用液体培养基或固体培养基进行培养。液体培养基可以提供充足的营养物质,并且可以方便地进行通气和搅拌,有利于微生物的生长和繁殖。而固体培养基则可以提供较为稳定的生长环境,并且可以方便地进行分离和纯化。3实验材料及设备3.1实验材料固体培养基、液体培养基、菌种。3.2仪器设备灭菌锅、超净工作台、摇瓶(500mL)、无菌接种针、棉塞、牛皮纸。3.3试剂及其配制方法培养基配方(1L):酵母提取物10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g,调整pH为5.5。4实验步骤(1)种子培养基的配制按照种子培养基配方,配制1500mL培养基,并用pH试纸调好pH。(2)分装分装到5个500mL的摇瓶中,每瓶300mL。用松棉塞塞住瓶口,并用牛皮纸包扎好瓶口。(3)灭菌放入高压灭菌锅,121℃灭菌20min。(4)一级种子培养在超净工作台上,用无菌接种针挑取一针斜面菌种,接入一级种子培养基(固体培养基),28℃条件下培养,培养16h。(5)二级种子培养将一级种子接入二级种子培养基(液体培养基)。在28℃条件下培养,培养16h。5结果与分析(1)记录实验过程。(2)扩培出一定量生长旺盛的种子。6思考题①实验过程中如何保证无菌条件?②好氧菌与厌氧菌在扩培过程中的比较。实验二

淀粉糖化及酒精发酵1实验目的掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程。在无氧条件下,酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的过程称为酒精发酵。这是生产酒精及各种酒类的基础。通过测定发酵过程中产生的二氧化碳的量和最终产物酒精的量,可以评估酵母菌的发酵能力。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料大米粉、活性干酵母。3.2仪器设备粉碎机、灭菌锅、离心机。3.3试剂淀粉酶、糖化酶、重铬酸钾、硫酸、氢氧化钠。4实验步骤(1)原料粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎到一定程度。(2)蒸煮糊化称取一定量(100g)的粉碎后的淀粉质原料,按照一定的料水比(100g∶200mL),调制淀粉乳。在90~100℃条件下恒温水浴加热,淀粉乳受热后在一定温度范围内,淀粉粒开始破坏,体积膨大,黏度急剧上升。(3)糖化糊化醪液调整pH为4.5,向其中加入一定量的淀粉酶(120U/g)、糖化酶(120U/g)。在60℃恒温下不断搅拌,直至淀粉糖化完全。酶参考用量:淀粉乳33%,60℃,pH为4.5,酶240U/g绝干淀粉,糖化时间16h。(4)发酵干酵母活化:将干酵母按1∶20的比例投放于37℃的温水中复水20min。淀粉醪液糖化后,取400mL上清液于洁净的可乐瓶中,加入相同体积的水稀释,加入活化好的酵母种液5mL,混匀,28℃培养箱中静置培养36h。(5)二氧化碳检验接种完擦干瓶外壁于天平上称量,记为W1。实验结束时取出瓶,轻轻摇动使二氧化碳尽量逸出,在同一天平上称量,记为W2。二氧化碳生成量=W1-W2。(6)酒精检验打开瓶塞,嗅闻有无酒精气味。取发酵液5mL,加10%硫酸2mL。再加入1%重铬酸钾溶液10~20滴,如颜色由黄色变为黄绿色,则说明有酒精产生。5结果与分析详细记录实验过程中各参数及数据,并对数据进行分析。6思考题现有几株不同来源的酒精酵母,请设计实验比较其酒精发酵能力。实验三

发酵罐的构造及操作1实验目的熟悉发酵罐的结构及规范操作;了解空气过滤器及空气管路的消毒;掌握发酵罐在微生物发酵过程中的应用。发酵罐的罐体主要用来培养发酵各种菌体,具有以下特点和功能:密封性要好,防止菌体被污染;罐体当中有搅拌桨,用于发酵过程中不停地搅拌;空气处理系统,用来供给菌体生长所需要的空气或氧气;蒸汽净化系统,供给发酵罐空消及实消所需的蒸汽;罐体上有控制传感器,最常用的是pH电极和溶氧电极,用来监测发酵过程中发酵液pH和DO(溶解氧)的变化;此外有些发酵罐还配有电气控制系统。2实验原理发酵罐3实验设备4实验步骤(1)熟悉发酵罐的结构。(2)演示发酵罐的规范操作。(3)学生进行发酵罐的操作。(1)记录实验操作过程,包括各参数的设置和监测结果。(2)分析发酵过程中pH和DO的变化,评估发酵效果。5实验结果①发酵罐有哪几种?②描述发酵罐的结构。③对于用发酵罐进行好氧发酵如何规范操作?6思考题实验四

发酵罐的灭菌1实验目的学习发酵罐灭菌的方法。发酵罐的结构比较复杂,内部的边边角角不容易彻底灭菌。一般的发酵罐配备有自动清洗装置,清洗完之后需要进行彻底灭菌。灭菌过程通过高温蒸汽实现。2实验原理发酵罐、灭菌锅3实验设备4实验步骤4.1实罐灭菌(实消)先将输料管路内的污水放掉并冲净。然后将配制好的培养基泵送至发酵罐(种子罐或料罐)内,灭菌前先将各排气阀打开,将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热。待罐温升至80~90℃,将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中(如有冲视镜管,也同时进气),使罐温上升到118~120℃,罐压维持在0.09~0.1MPa(表压),并保持30min左右。各路进气要畅通,防止短路或逆流;各路排气要畅通,但排气量不宜过大,以节约用气量。在保温阶段,凡进口在培养基液面以下的管道及冲视镜管应持续进汽;凡开口在液面以上的管道均应保持排气。无论与罐连通的管路如何配置,在实消时均应遵循“不进则出”的原则,以保证灭菌彻底,不留死角。保温结束后,依次关闭各排气、进气阀门,待罐内压力低于空气压力后,向罐内通入无菌空气。在夹套或蛇管中通入冷却水,使培养基的温度降至所需温度,进行下一步的发酵或培养。在引入无菌空气前,应注意罐压必须低于过滤器压力,否则会导致物料倒流,污染过滤器,造成严重后果!灭菌时,总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35MPa,使用压力不低于0.25~0.3MPa。4.2空罐灭菌(空消)发酵罐罐体的灭菌。空消时一般维持罐压在0.15~0.2MPa,罐温在125~130℃,保持30~45min。要求总蒸汽压力不低于0.3~0.35MPa,使用蒸汽压力不低于0.25~0.3MPa。5结果与分析详细记录实验过程中各参数及数据,并对数据进行分析,确保灭菌过程符合要求。6思考题①什么是实消?②什么是空消?实验五

从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析1实验目的(1)从土壤中分离产抗生素放线菌。(2)抗生素产生菌的抗菌谱测定。放线菌是重要的抗生素产生菌,主要分布在土壤中,其数量仅次于细菌,一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物,必须将其从混杂的微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求,常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变,或土壤预先处理(120℃热处理1h),或加入某种抑制剂(如加数滴10%酚等),都可以使细菌(本实验加入重铬酸钾150mg/L),霉菌出现的数量大大减少,从而淘汰了其他杂菌。再通过稀释法,使放线菌在固体培养基上形成单独菌落,并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素,抑制其他菌种的生长,挑取纯菌落进行抗菌谱分析,指示菌为大肠杆菌(G-)和枯草芽孢杆菌(G+)。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、高氏一号培养基、LB培养基。3.2仪器设备灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、振荡器、三角瓶、移液管、培养皿、玻璃珠、无菌水。4实验步骤(1)高氏一号培养基的制备可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,氯化钠0.5g,K2HPO4·3H2O0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,琼脂20g,水1000mL,pH=7.4。配制时,先用冷水将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,加热,边搅拌边加入其他成分。溶解后,补足水分至1000mL。112℃灭菌20min(实验中所用无菌器具均在此时灭菌)。(2)土壤取样及其悬液梯度稀释选定取样点(最好是有机质含量高的菜地),按对角交叉(五点法)取样。先除去表层约2cm的土壤,将铲子插入土中数次,然后取2~10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀,除去碎石、植物残根等,土样取回后应尽快投入实验。称10g土样于盛有90mL无菌水并装有玻璃珠的三角瓶中,振荡10~20min,使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散,此即为浓度10-1

的菌悬液,静置30s。另取装有9mL无菌水的试管4支,编号10-2、10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-1

浓度的土壤悬液1mL并加入编号10-2

的无菌试管中,并吹吸吸管3~4次,使其与9mL水混匀,即为10-2

浓度的土壤稀释液。依此类推,直到稀释至10-5

的试管中。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。(3)稀释倒平板法分离土壤中放线菌取3支1mL移液管分别从10-3、10-4、10-5

菌悬液中吸取1mL菌悬液,分别注入编号10-3、10-4、10-5

的培养皿内,每一梯度2个平板。将温度为45~50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内,轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀,凝固后,将培养皿倒扣放置在28℃条件下培养一周,每天观察培养基表面有无微生物菌落。将平皿上的放线菌菌落挑取在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化,28℃恒温培养一周,观察放线菌菌落特征。(4)抗菌谱测定配制LB培养基,灭菌后倒平板。将摇床培养12h的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别涂布于固态LB培养基,静置10min。挖取一个放线菌菌落(含培养基),倒置于平板分区的中央,培养一天后,观察并测量抑菌圈大小。5结果与分析(1)描述分离到的放线菌培养特征。(2)观察并测量对指示菌的抑菌圈大小。6思考题以某一抗生素为例,描述其工业生产过程。实验六

利用发酵罐进行谷氨酸的发酵生产1实验目的(1)了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制,为发酵实验准备菌种。(2)掌握对发酵罐及其管道的灭菌方法。(3)巩固发酵罐的操作,完成谷氨酸发酵的全过程。谷氨酸发酵过程中影响产酸的因素有以下几点:(1)氧谷氨酸产生菌是好氧菌,通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率,还会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期,加大通气量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时产生的是乳酸或琥珀酸。(2)温度菌种生长的最适温度为30~32℃。当菌体生长到稳定期,适当提高温度有利于产酸。因此在发酵后期可将温度提高到34~37℃。(3)pH谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0~8.0。但在发酵过程中,随着营养物质的利用和代谢产物的积累,培养液的pH会不断变化。(4)磷酸盐磷酸盐是谷氨酸发酵过程中必需的,但浓度不能过高,否则会转向缬氨酸发酵。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料谷氨酸产生菌(通常使用谷氨酸棒状杆菌或其他高产谷氨酸的菌株)无菌水、指示菌、尿素、磷酸盐、一级种子培养基、二级种子培养基、一级种子液、发酵培养基。3.2仪器设备发酵罐、灭菌锅、恒温培养箱、搅拌器、pH计、温度计、蠕动泵、玻璃珠、无菌吸管、三角瓶、培养皿。4实验步骤(1)一级种子培养将斜面菌种接入已灭菌冷却的一级种子培养基中(250mL三角瓶内接入1~2环)于32℃、250r/min条件下培养12h。一级种子质量要求:种龄12h;pH=6.4;吸光度净增0.5以上;无菌检查呈阴性,噬菌体检查:无。(2)二级种子培养在已灭菌的二级种子培养基中,按0.5%~1%的接种量接入上述培养好的一级种子,于32℃、250r/min条件下培养7~8h。二级种子质量要求:种龄7~8h,pH=6.8~7.2,吸光度净增0.5左右,无菌检查呈阴性,噬菌体检查:无,残糖消耗1%左右;镜检生长旺盛,排列整齐。(3)发酵操作①添加尿素:当发酵液冷却至40℃左右时,通过蠕动泵加入第一次尿素,添加量为0.8%~1.0%。②接种:将制备好的二级种子以8%~10%的接种量接入发酵罐,于35℃、250r/min条件下培养35h。③发酵过程的温度控制:谷氨酸发酵0~12h为长菌期,最适温度为30~32℃;发酵12h后进入产酸期,控制温度在34~36℃。由于发酵期代谢活跃,发酵罐需注意冷却,防止温度过高导致发酵迟缓。④发酵过程的pH控制:0~8h,pH控制在7.0~7.6;8~20h,pH控制在7.2~7.3;20~24h,pH控制在7.0~7.1;24~35h,pH控制在6.5~6.6。⑤糖液流加:从第10h开始,每隔4h补糖一次,每次补入1%的水解糖液;在发酵26h前补入4%的水解糖液。5结果与分析(1)发酵过程中测定糖含量和谷氨酸含量。(2)实验报告中附一张成品图片。6思考题①谷氨酸发酵的原理是什么?②比色法测定还原糖的原理是什么?③操作过程中的注意事项是什么?实验七

柠檬酸产生菌的分离及柠檬酸的固体发酵1实验目的(1)学习从环境中选出能产柠檬酸的霉菌。(2)掌握柠檬酸的发酵、提取、检测方法。柠檬酸发酵是利用微生物在一定条件下的生命代谢活动而获得产品的过程。不论采用何种菌株,柠檬酸发酵均为典型的好氧发酵。工业上的好氧发酵法主要有三种方式:表面发酵、固体发酵和液体深层发酵。前两种方法主要利用空气中的氧气,而第三种则利用液体中的溶解氧。至今,在柠檬酸发酵工业中,上述三种发酵工艺仍并存。尽管液体深层发酵已大量取代了固体发酵,但由于一些废渣的利用及投资较少等原因,在某些地区,浅层固体发酵法仍在使用。适合固体发酵法生产柠檬酸的原料包括甘薯渣、木薯渣、苹果渣和甘蔗渣等。柠檬酸的固体发酵工艺分为浅层法和厚层法,其原理是将发酵原料、辅料及菌体放在疏松的固体支持物上,通过微生物的代谢活动,将原料中的可发酵成分转化为柠檬酸。葡萄糖首先通过糖酵解(EMP)和磷酸戊糖途径(HMP)生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸,然后经过一个不完整的三羧酸循环,实现柠檬酸的积累。糖酵解是生物体进行单糖的分解和利用的主要途径之一,总共包括10个连续步骤,每一步均由特定的酶催化。不仅黑曲霉,许多生命体都存在这种获取能量的方式。黑曲霉发酵糖类生成柠檬酸的能力很强,主要是由于其耐酸性极强,在pH为1.6的情况下仍能良好生长。利用这一特点,采用pH为1.6的酸性营养培养基即可分离黑曲霉。发酵产物中柠檬酸是一种多羧基有机酸,能与CaCO3

形成沉淀,利用钙盐法即可检测含量。黑曲霉发酵生成柠檬酸的过程中,在发酵初期发酵液中葡萄糖含量较高,而高浓度的葡萄糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的抑制物,因此三羧酸循环(TCA循环)就中断了,酸度开始积累(注意此时积累的是酸度而不是柠檬酸)。但当酸度积累到pH小于2.0时,催化柠檬酸⇌顺乌头酸⇌异柠檬酸正逆反应的顺乌头酸水合酶不再表现出活力,这样TCA循环在合成柠檬酸之后就不会向后继续反应,从而达到柠檬酸的积累。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料霉烂橘皮。3.2实验菌种黑曲霉IFFI2315。3.3仪器设备白瓷托盘、保鲜膜、切刀、菜板、培养皿、250mL三角瓶、恒温培养箱、灭菌锅、酸碱滴定管、纱布、牛皮纸。4实验步骤(1)深层液体发酵①菌种分离:取霉烂橘皮(0.04cm2)放入100mL三角瓶中,振荡3~5min,然后用水稀释5~10倍。②菌种纯化:取稀释液0.5~1mL放入酸性培养基上(稀释液∶培养基=1∶10)摇匀,倾倒在平皿中的滤纸上,25℃培养2~3d即有菌落产生。③发酵:将培养出的霉菌接种入液体酸性蔗糖发酵培养基中,30℃摇床培养2~3d,过滤收集发酵液。(2)浅层固体发酵①培养基制备:将米糠、麸皮按照2∶1的比例配料,加65%的水分,拌匀后按15g/250mL分装到三角瓶中,用纱布、牛皮纸封扎瓶口,置于121℃

灭菌30min。②接种:将培养基趁热打散,待降温到37℃即可将黑曲霉孢子接种到其中,振荡混匀。③发酵:培养温度30~32℃,经24h培养后摇瓶一次,并测定pH。将三角瓶放平后继续培养24h左右,使培养基形成块状。此时应扣瓶,以充分通气并散热,同时测定pH。继续培养72h,待瓶内长满丰盛的孢子后即可出料,并测定pH。(3)产物检测①柠檬酸鉴定。②产酸量测定。5结果与分析(1)将发酵全过程中测定的pH绘制成曲线图。(2)计算出实际实验发酵液的产酸量。6思考题柠檬酸发酵过程应注意哪些操作要点?实验八

固态低盐发酵法制备

酱油工艺1实验目的学习固态低盐发酵法制备酱油工艺;掌握固态低盐发酵法制备酱油发酵过程中出品率、原料利用率的计算过程。酱油是中国传统的液体调味品,由大豆、麦、麸皮酿造而成,色泽红褐,酱香独特,滋味鲜美,能有效促进食欲。酱油的原料是植物性蛋白质和淀粉质。植物性蛋白质取自大豆榨油后的豆饼或溶剂浸出油脂后的豆粕,也有以花生饼、蚕豆作为代用,传统生产中以大豆为主;淀粉质原料普遍采用小麦及麸皮,也有以碎米和玉米作为代用,传统生产中以面粉为主。原料经蒸熟冷却,接入纯培养的米曲霉菌种制成酱曲,酱曲移入发酵池,加盐水发酵,待酱醅成熟后,以浸出法提取酱油。制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长,并大量产生和积蓄所需要的酶,如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。在发酵过程中,风味物质的形成是利用这些酶的作用。在制曲及发酵过程中,从空气中落入的酵母和细菌也进行繁殖并分泌多种酶,也可添加纯培养的乳酸菌和酵母菌。由乳酸菌产生适量乳酸,由酵母菌发酵产生乙醇,以及由原料成分、曲霉的代谢产物等所产生的醇、酸、醛、酯、酚、缩醛和呋喃酮等多种成分,虽多属微量,但却能赋予酱油复杂的香气。此外,由原料蛋白质中的酪氨酸经氧化生成黑色素,淀粉酶水解产物与氨基酸反应生成类黑素,使酱油产生鲜艳有光泽的红褐色。发酵期间的一系列极其复杂的生物化学变化所产生的鲜味、甜味、酸味、酒香、酯香与盐水的咸味相混合,最后形成风味独特的酱油。酱油的生产方法根据加盐量的不同,分为无盐发酵、低盐发酵、高盐发酵。固态低盐发酵法是当前我国广泛采用的酱油生产工艺。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料菌种(米曲霉沪酿3042)、麸皮、黄豆饼粉、食盐。3.2仪器设备电炉、铝盒、瓷盘、标本缸、三角瓶、温度计、酒精灯、接种针、玻璃棒、75%酒精、波美表、量筒。4实验步骤(1)三角瓶种曲制作①原料配比:麸皮100g,水100mL,拌匀。②装瓶灭菌:将配好的原料装入250mL三角瓶中,装量约1cm厚,擦净瓶口,加棉塞,用纸包扎后灭菌30min。灭菌后趁热摇散。③接种与培养:待到冷却后,接入斜面或麸皮管培养的米曲霉3042,摇匀后置于30℃恒温培养。约18h后,三角瓶内曲料稍发白结块,摇瓶一次,将结块摇碎,继续培养。再过4h左右,曲料再次发白结块,再摇瓶一次。经过2d培养,将三角瓶倒置,继续培养至全部长满绿色孢子,即可使用。若需保存较长时间,可在37℃温度下烘干后置于阴凉处保存。(2)酱油曲的制作制曲是酱油酿造的重要环节,