生物工程实验指导-课件 10-基因工程实验

基因工程实验实验一

植物和动物基因组DNA的提取实验二

细菌DNA的提取实验三

紫外吸收法测定核酸含量实验四

琼脂糖凝胶电泳实验五

细菌16SrDNA的PCR扩增实验六

文蛤的ISSR-PCR扩增实验七

细菌16SrDNAPCR-RFLP多态性分析实验一

植物和动物基因组DNA的提取1实验目的学习从动物或植物组织中提取基因组脱氧核糖核酸(DNA)的方法;理解和掌握不同提取方法的原理;学会和掌握提取基因组DNA的技术。2实验原理核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在。其中,DNA主要存在于细胞核中,而RNA主要存在于核仁及细胞质中。DNA的提取过程如下:首先利用机械法破碎细胞。加入蛋白质变性剂(如苯酚氯仿)使蛋白质变性。通过酚-氯仿-异戊醇抽提去除溶液中的蛋白质,得到含DNA的水溶液。由于DNA不溶于乙醇,向含有DNA的水相中加入冷的无水乙醇,DNA会以纤维状沉淀析出。苯酚-氯仿混合液作为蛋白质变性剂,能有效抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)的降解作用。处理匀浆液时,由于蛋白质与DNA的连接键被破坏,且蛋白质分子表面含有许多与苯酚相似且相溶的极性基团,因此蛋白质会溶于酚相,而DNA则溶于水相。离心分层后,取出水相,多次重复操作并合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,通过乙醇沉淀DNA。此法提取的DNA能保持天然状态。真核细胞DNA的分离通常在乙二胺四乙酸(EDTA)及十二烷基磺酸钠(SDS)等表面活性剂存在下,用蛋白酶K消化细胞获得。在制备核酸时应避免过酸、过碱及其他可能引起核酸降解的因素。全部操作过程应在低温下进行,必要时加入酶抑制剂,如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA等,以抑制DNA酶活性。同时,SDS或苯酚等蛋白质变性剂也可能破坏核酸降解酶。脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加,其溶解度逐渐升高,在1mol/L氯化钠溶液中的溶解度比纯水高2倍。核糖核蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度影响较小,在0.14mol/L氯化钠溶液中溶解度较大。因此,在提取时,常利用盐浓度差异分离这两种核蛋白。3实验材料及设备3.1实验材料(1)动物组织:蛤的斧足肌肉、青虾的尾部肌肉、蟹的腿部肌肉、鸡肝、猪肝等任选一种。(2)植物组织:植物的根、茎、叶、种子等。3.2仪器设备电子分析天平、灭菌锅、电热恒温水箱、高速冷冻离心机、冰箱、pH计、微量移液器(量程:100~1000μL,10~100μL和0.5~10μL)、烧杯(500mL和1000mL)、试剂瓶(50mL和250mL)、量筒(100mL)、容量瓶(50mL和250mL)、50mL塑料离心管、1.5mLEP离心管及离心管盒、吸头(1000μL、100μL和10μL)及吸头盒、牛皮纸及橡皮筋。注:上述部分器材需经121.3℃高温高压灭菌、烘干后备用。3.3试剂及其配制方法①0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA,pH=8.0):称取Na2EDTA46.527g,置于500mL烧杯中,加入200mL双蒸水,加热搅拌至完全溶解,用NaOH调节pH至7.6,定容至250mL。分装后,121.3℃高温高压灭菌,常温保存。②1mol/LTris-HCl(pH=8.0):称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)30.275g,置于500mL烧杯中,加入双蒸水200mL充分搅拌溶解。加入约10.5mL浓盐酸(11.6N)调节pH至8.0,定容至250mL。121.3℃高温高压灭菌后室温保存。注:溶液冷却至室温后再调pH,因为Tris的pH随温度变化。3实验材料及设备3.3试剂及其配制方法③10%SDS:称取5g高纯度SDS,置于100mL烧杯中,加入40mL无菌双蒸水,68℃加热溶解,定容至50mL,室温保存。④20%SDS:称取10g高纯度SDS,置于100mL烧杯中,加入40mL无菌双蒸水,68℃加热溶解,定容至50mL。121.3℃高温高压灭菌后室温保存。⑤蛋白酶K(20mg/mL):吸取500μL无菌双蒸水于无菌EP离心管中,称取0.01g蛋白酶K加到EP离心管中,颠倒混匀后-20℃保存。使用浓度约为50μg/mL。(注:无须灭菌)⑥TE缓冲液:成分为10mmol/LTris-HCl、1mmol/LNa2EDTA。取1mol/LTris-HCl500μL和0.5mol/LNa2EDTA100μL,加双蒸水定容至50mL,灭菌后室温保存。⑦改进的细胞裂解液:成分为10mmol/LTris-HCl,100mmol/LNa2EDTA。取1mol/LTris-HCl500μL和0.5mol/LNa2EDTA10mL,加无菌双蒸水定容至50mL,现用现配。⑧5mol/LNaCl溶液:称取14.625g氯化钠晶体于100mL烧杯中,加入40mL双蒸水,充分搅拌溶解后转移至50mL容量瓶中,加双蒸水定容至刻度线。121.3℃高温高压灭菌后,4℃保存。⑨6mol/LNaCl溶液:称取17.55g氯化钠晶体于100mL烧杯中,加入40mL双蒸水,充分搅拌溶解后转移至50mL容量瓶中,加双蒸水定容至刻度线。121.3℃高温高压灭菌后,4℃保存。3实验材料及设备3.3试剂及其配制方法⑩

STE缓冲液:成分为0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl,1mmol/LNa2EDTA。吸取5mol/LNaCl500μL,1mol/LTris-HCl250μL,0.5mol/LNa2EDTA50μL,加无菌蒸馏水至25mL。⑪

1mol/LDTT(二硫苏糖醇):称取3.09gDTT,加入50mL无菌塑料离心管内,加入20mL无菌双蒸水,溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。适量分成小份后,于-20℃保存。⑫

2×CTAB提取缓冲液:称量CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)2g,加入双蒸水40mL,溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH=8.0)10mL,5mol/LNaCl溶液28mL,定容至100mL,灭菌后室温保存。⑬

3mol/LNaAc(pH=5.2):将40.8gNaAc·3H2O(三水合醋酸钠)置于200mL烧杯中,加入约40mL双蒸水搅拌溶解,用冰醋酸调节pH至5.2,用双蒸水定容至100mL。121.3℃高温高压灭菌后,4℃保存。4实验步骤4.1常规法———苯酚-氯仿-异戊醇抽提法(1)取动物肌肉组织约100mg,用剪刀剪碎置于EP离心管中(或用液氮研磨至粉末状)。加入裂解液(TE400μL、蛋白酶K3μL和10%SDS25μL),置于55℃水浴中消化2~3h,至溶液呈透明黏稠状。(2)取出EP离心管,12000r/min离心10min。用大口Tip头吸取上清液至另一洁净的EP离心管中,并加入等体积的Tris-饱和酚,用封口膜密封后,缓慢颠倒混匀10min。(3)12000r/min离心10min。用大口Tip头吸取上清液至另一洁净的EP离心管中,并加入等体积的Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇(体积比为25∶24∶1)进行抽提,缓慢颠倒混匀10min。(4)12000r/min离心10min。用大口Tip头吸取上清液至另一洁净的EP离心管中,并加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24∶1)进行抽提,缓慢颠倒混匀10min。(5)12000r/min离心10min。用大口Tip头吸取上清液至另一洁净的EP离心管中,加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/20体积的3mol/LNaAc,将EP离心管置于-20℃中沉淀DNA约20min。(6)用预冷的75%乙醇洗涤DNA3次后室温干燥,用TE溶解,置于4℃保存备用。4实验步骤4.2改进法(1)取动物肌肉组织约100mg,用剪刀剪碎,置于EP离心管中(或用液氮研磨至粉末状),加入400μL改进的细胞裂解液,3μL蛋白酶K、25μL10%SDS,混匀后置于55℃水浴中消化2~3h,至溶液呈透明黏稠状。(2)重复4.1常规法———苯酚-氯仿-异戊醇抽提法中的(2)~(6)步骤。4.3高盐裂解液法(1)取动物肌肉组织约100mg,用剪刀剪碎置于EP离心管中(或用液氮研磨至粉末状)。加入消化液(STE200μL、10%SDS45~50μL、蛋白酶K4~5μL),置于55℃水浴中消化2~3h,至溶液呈透明黏稠状。(2)消化后加入6mol/LNaCl溶液300μL,混匀后离心。取上清液并加入等体积的异戊醇抽提。其余步骤同4.1常规法———苯酚-氯仿-异戊醇抽提法中的(2)~(6)步骤。4实验步骤4.4DTT法(1)取动物肌肉组织约100mg,用剪刀剪碎置于EP离心管中。加入消化液(STE500μL、10%SDS60μL、1mol/LDTT24μL、蛋白酶K4~5μL),置于55℃水浴中消化2~3h,至溶液呈透明的黏稠液体。(2)消化后加入6mol/LNaCl溶液300μL,混匀后离心。取上清液并加入等体积的异戊醇抽提。其余步骤同4.1常规法———苯酚-氯仿-异戊醇抽提法中的(2)~(6)步骤。4.5CTAB法(1)取5粒泡发后的大豆(或其他植物组织约200mg),去净种皮后置于研钵中,加入液氮充分研磨至粉末状。将粉末装入EP离心管中(每管约0.1g),加入400μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液,5μL蛋白酶K(20mg/mL),25μL的10%SDS,60℃水浴50min左右。(2)重复4.1常规法———苯酚-氯仿-异戊醇抽提法中(2)~(6)的步骤。5结果与分析(1)记录不同样品离心管的编号、所采用的DNA提取方法、实验材料名称,以及溶解DNA时的TE添加量,并以三线表的形式写在报告中。(2)拍摄样品在水浴前、水浴中和水浴后的照片并放在报告中,描述样品在消化细胞不同阶段的状态,并分析原因。(3)抽提蛋白质离心后,注意观察并记录不同实验材料蛋白质层厚度的区别,并分析原因。?6思考题①在提取DNA的过程中,如何避免DNA的机械断裂?②从准备实验、配制试剂到提取DNA的过程中,如何避免外源DNA的污染?实验二

细菌DNA的提取1实验目的学习并掌握从细菌培养物中提取DNA的原理和方法。溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶(Muramidase),是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁的不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽,导致细胞壁破裂,内容物逸出,从而使细菌溶解。利用酶法破坏细菌细胞壁后,加入蛋白质变性剂SDS使蛋白质变性,再用酚-氯仿-异戊醇抽提去除溶液中的蛋白质,得到含DNA的水溶液。由于DNA不溶于乙醇,向含有DNA的水相中加入冷的无水乙醇,DNA会以纤维状沉淀析出。苯酚-氯仿混合液作为蛋白质变性剂,能有效抑制DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,蛋白与DNA的连接键被破坏,蛋白质分子表面含有许多与苯酚相似的极性基团,因此蛋白质溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水相,多次重复操作,合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA。经过70%乙醇洗涤和干燥后,用TE缓冲液或无菌水溶解DNA备用。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料细菌培养物的制备:取1g新鲜土壤,置于盛有99mL无菌水的三角瓶中,向三角瓶中放入约15粒无菌玻璃珠,充分振荡15~30min,制成稀释100倍的样品稀释液。静置30s后,用无菌移液管吸取1mL土壤水溶液,置于盛有150mL液体LB培养基的三角瓶中,于震荡培养箱中37℃培养16h备用。3.2仪器设备电子分析天平、灭菌锅、电热恒温水箱、高速冷冻离心机、冰箱、pH计、微量移液器(量程:100~1000μL,10~100μL和0.5~10μL)、烧杯(500mL和1000mL)、试剂瓶(50mL和250mL)、三角瓶(150mL)、量筒(100mL)、容量瓶(50mL和250mL)、1.5mLEP离心管及离心管盒、吸头(1000μL、100μL和10μL)及吸头盒、牛皮纸及橡皮筋。注:上述部分器材需经121.3℃高温高压灭菌、烘干后备用。3实验材料及设备3.3试剂及其配制方法①LB培养基配方:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,pH=7.2,用蒸馏水定容至1L。121.3℃灭菌20min。②0.5mol/LNa2EDTA(pH=8.0):称取Na2EDTA46.527g,置于500mL烧杯中,加入200mL双蒸水,加热搅拌至完全溶解。用NaOH调节pH至7.6,定容至250mL,分装后121.3℃高温高压灭菌,常温保存。③1mol/LTris-HCl(pH=8.0):称取Tris30.275g,置于500mL烧杯中,加入200mL双蒸水,充分搅拌溶解。加入约10.5mL浓盐酸(11.6N)调节pH至8.0,定容至250mL。121.3℃高温高压灭菌,室温保存。注:应使溶液冷却至室温后再调pH,因为Tris的pH随温度而变。④10%SDS:称取5g高纯度SDS,置于100mL烧杯中,加入40mL无菌双蒸水,68℃加热溶解,定容至50mL,室温保存。⑤溶菌酶:用灭过菌的蒸馏水配制成50mg/mL的溶菌酶溶液,用已灭菌的离心管盛装,分装成小份并保存于-20℃(使用浓度为1mg/mL)。(注:无须灭菌)⑥

蛋白酶K(20mg/mL):吸取500μL无菌双蒸水于灭过菌的EP离心管中,称取0.01g蛋白酶K加到EP离心管中,颠倒混匀,-20℃保存。(注:使用浓度约为50μg/mL,无须灭菌)⑦TE缓冲液:成分为10mmol/LTris-HCl、1mmol/LNa2EDTA。取1mol/LTris-HCl500μL和0.5mol/LNa2EDTA100μL,加双蒸水定容至50mL,121.3℃高温高压灭菌后室温保存。⑧3mol/LNaAc(pH=5.2):将40.8gNaAc·3H2O置于200mL烧杯中,加入约40mL双蒸水搅拌溶解,用冰醋酸调节pH至5.2,用双蒸水定容至100mL。高温高压灭菌后,4℃保存。4实验步骤(1)细菌收集取1mL培养物于1.5mLEP离心管中,室温8000r/min离心5min,弃上清。再取1mL培养物,8000r/min离心5min,弃上清。沉淀重新悬浮于0.5mLTE离心管中(pH=8.0)。(2)菌体裂解在离心管中加入6μL50mg/mL溶菌酶,置于37℃作用30min~1h。再加入50μL10%SDS和3μL20mg/mL蛋白酶K,50℃作用3h或37℃过夜(此时菌液应为透明黏稠液体)。(3)抽提加入与菌液等体积的Tris-饱和酚,混匀后室温静置10min,12000r/min离心10min。用大口Tip头吸取上清液至新的EP离心管中,加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比为25∶24∶1),混匀后室温静置10min,12000r/min离心10min。用大口Tip头吸取上清液至新的EP离心管中,加等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24∶1),混匀后室温静置10min,12000r/min离心10min。取上清液至新的离心管中。(4)沉淀加入2倍体积的冷无水乙醇和1/5体积3mol/LNaAc溶液,混匀,沉淀DNA。(5)洗涤用75%乙醇洗涤DNA3次。(6)溶解将DNA晾干或吹干后,溶于50μL双蒸水中。5结果与分析(1)记录离心管的编号及溶解DNA时的TE添加量。(2)拍摄样品在水浴前、水浴中和水浴后的照片并放在报告中,描述样品在消化细胞不同阶段的状态,并分析原因。6思考题①请说明在提取DNA过程中,溶菌酶、SDS、Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇和无水乙醇的作用分别是什么?②哪些试剂和操作是为了去除蛋白质?③为什么在离心后用大口Tip头吸取上清液?实验三

紫外吸收法测定核酸含量1实验目的掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理;掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量和检测核酸纯度的方法。

2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料自行提取的DNA样品或RNA样品。3.2仪器设备紫外分光光度计、

分析天平、pH计、

烧杯(100mL和500mL)、

试剂瓶(50mL和250mL)、量筒(100mL)、容量瓶(50mL和250mL)。3.3试剂及其配制方法①0.5mol/LNa2EDTA(pH=8.0):称取Na2EDTA46.527g,置于500mL烧杯中,加入200mL双蒸水,加热搅拌至完全溶解。用NaOH调节pH至7.6,定容至250mL,分装后121℃高温高压灭菌,常温保存。②1mol/LTris-HCl(pH=7.4):称取Tris30.275g,置于500mL烧杯中,加入200mL双蒸水,充分搅拌溶解。加入约10.5mL浓盐酸(11.6N)调节pH至8.0,定容至250mL。121℃高温高压灭菌,室温保存。③TE缓冲液:成分为10mmol/LTris-HCl、1mmol/LNa2EDTA。取1mol/LTris-HCl500μL和0.5mol/LNa2EDTA100μL,加双蒸水定容至50mL,灭菌后室温保存。4实验步骤(1)稀释核酸样品若提取核酸时溶解核酸的溶剂为TE缓冲液,用TE缓冲液对核酸样品进行稀释(10~100倍)。若用无菌双蒸水溶解核酸,则用无菌双蒸水稀释核酸样品。(2)测吸光度选择厚度为1cm、容量为1mL的石英比色杯,以TE缓冲液或无菌双蒸水作为空白对照。在紫外分光光度计上读取波长260nm和280nm处的吸光度。(3)测定核酸浓度计算公式如下(4)测定核酸纯度DNA样品:A260/A280

值应在1.7~2.0(1.8~1.9为好)。若比值小于1.7,可能有蛋白质污染;若比值大于2,可能存在RNA污染或DNA降解现象。注:pH和离子会影响吸光度,如稀释用TE缓冲液,A260/A280

比值会偏高。RNA样品:A260/A280

值应在1.9~2.1(2.0~2.1为好)。若比值小于1.8,表明蛋白质较多;若比值大于2.2,则表面RNA已经降解。5结果与分析(1)计算样品DNA的浓度。(2)计算样品DNA的纯度。6思考题①若A260/A280

值较低,判断为蛋白质较多,应如何对核酸进行纯化处理?②若DNA样品中含有RNA,应如何纯化DNA?实验四

琼脂糖凝胶电泳1实验目的学习并掌握琼脂糖凝胶电泳的原理,学会琼脂糖凝胶的制作,掌握水平式电泳仪的使用方法,掌握相关的技术和识读电泳图谱的方法。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。将DNA样品加入一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场中。由于DNA分子的双螺旋结构两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因此可以依据DNA分子的大小进行分离。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,还可以分离相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。在电泳过程中,可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物与样品一起进行电泳来进行检测。相对分子质量标准参照物可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量SuperRed,其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物。在254~365nm波长的紫外光照射下,该络合物会呈现橘红色荧光,因此也可以对分离的DNA进行检测。一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb~50kb范围内的DNA片段。本实验将介绍琼脂糖凝胶的制备,以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料在“实验一”中自行提取的DNA样品。3.2仪器设备水平电泳仪、电泳电源、Bio-Rad凝胶成像系统、分析天平、微波炉、微量移液器(量程:1μL~10μL),锥形瓶(250mL),量筒(50mL和500mL),容量瓶(1L),吸头(10μL)及吸头盒(注:吸头经121℃高温高压灭菌、烘干后备用)3.3试剂及其配制方法①50×TAE缓冲液(pH=8.5):称取Tris242.2g,先用300mL双蒸水加热搅拌溶解后,加入约57mL冰醋酸,再加入37.2gNa2EDTA·2H2O,用冰醋酸调节pH至8.5,然后加双蒸水定容至1L,121℃高温高压灭菌后4℃保存。②Marker:λ-HindⅢDigestDNAMarker和DL2000DNAMarker。③6×LoadingBuffer:40%蔗糖,0.25%溴酚蓝。④SuperRed(Gelred)10000×储液。⑤Agarose琼脂糖(Sigma)。4实验步骤4.1凝胶的配制制备0.8%或1%(m/v)的琼脂糖凝胶①称取琼脂糖:1%琼脂糖凝胶:大型胶板(40mL)称取0.4g琼脂糖;小型胶板(20mL)称取0.2g琼脂糖。0.8%琼脂糖凝胶:大型胶板(40mL)称取0.32g琼脂糖;小型胶板(20mL)称取0.16g琼脂糖。②加入缓冲液:将称好的琼脂糖置于锥形瓶中,加入1×TAE缓冲液。大型胶板:加入40mL1×TAE缓冲液。小型胶板:加入20mL1×TAE缓冲液。③加热溶解:使用微波炉或电炉加热,煮沸大约3次,直至琼脂糖完全溶解。每次煮沸后轻轻摇晃锥形瓶,避免液体溢出。④加入染料:向冷却后的琼脂糖凝胶溶液中加入SuperRed(Gelred)10000×储液。每20mL琼脂糖凝胶液加入2μLSuperRed(Gelred)10000×储液。轻轻摇动锥形瓶,避免产生气泡。⑤制胶方法:取出制胶槽内的凝胶托板,用蒸馏水冲洗干净并晾干,放入制胶槽中,固定好梳子。将琼脂糖凝胶液小心倒在凝胶托板上,使胶液缓慢展开,直到整个托板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,去掉托板底部的凝胶。将凝胶及其托板放入电泳槽中(加样孔一端靠近阴极),添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。4实验步骤4.2点样在点样板或塑料膜上混合DNA样品和6×LoadingBuffer(上样缓冲液)。上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。每取完一个DNA样品必须更换一个枪头,以防DNA污染。使用10μL微量移液器将样品分别加入胶板的点样孔内。点样时勿碰坏点样孔周围的凝胶面。应注意点样前要先记录下DNA模板的点样顺序,并在合适位置的点样孔中加入5μLMarker。4.3电泳点样后立即通电电泳,电压为80~100V,样品由负极向正极方向移动。电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿1/3处时,停止电泳。4.4观察照相在紫外灯下观察,DNA存在时会显示出红色荧光条带,利用凝胶成像系统拍照保存。5结果与分析(1)对λ-HindⅢDigestDNAMarker和DL2000DNAMarker,以及“实验一”中提取的DNA进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,并将电泳图放在报告中。要求在报告中对电泳图各泳道进行标号。两个Marker分别以M1和M2表示,样品编号与“实验一”结果中的各样品编号一致。(2)根据λ-HindⅢDigestDNAMarker的23kb条带分析样品DNA的完整性,要求对电泳图进行描述并分析原因。(3)以其中一个样品为例,根据DL2000DNAMarker中各条带的DNA量估计该样品DNA的浓度,并写出计算过程。(4)根据电泳结果,结合“实验一”中各样品所采用的DNA提取方法及实验材料,分析某DNA提取方法与实验材料的适应性。6思考题①如何根据λ-HindⅢDigestDNAMarker判断DNA的完整性?②如何根据DL2000DNAMarker估计DNA样品的浓度?实验五

细菌16SrDNA的PCR扩增1实验目的掌握PCR扩增目的DNA片段的原理和基本操作技术,熟悉PCR扩增体系中各组分的作用,通过PCR扩增目的基因并检测扩增结果。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR),是由KaryMullis在1986年发明的。PCR技术的原理基于DNA链的复制与扩增。PCR反应中需要的关键试剂包括DNA模板、rTaqDNA聚合酶、引物、dNTP、Mg2+

和反应缓冲液。其中,DNA模板是PCR反应的起始原料,rTaqDNA聚合酶是催化DNA链的复制与扩增的催化剂,引物是用于引导TaqDNA聚合酶在DNA链上进行复制与扩增的DNA片段,dNTP是合成新链的原料,Mg2+

是TaqDNA聚合酶的激活剂,反应缓冲液是一种帮助维持PCR反应环境的缓冲液。PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物,经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。该方法由高温变性,低温退火和适温延伸三个步骤组成一个循环,然后反复进行,使目的DNA得以迅速扩增。将待扩增的DNA置于高温(94℃)下,使双链DNA解链成为单链DNA模板。在低温条件下,人工合成的两个寡核苷酸引物分别与目的片段两侧的两条链互补结合。在72℃下TaqDNA聚合酶从引物的3'端开始掺入单核苷酸,沿模板5'→3'方向延伸,合成DNA新链。由于每一循环所产生的DNA均可作为下一次循环的模板,因此PCR产物以几何级数扩增。一般经过30~35次扩增循环,可使目的DNA片段放大数百万倍。16SrRNA是原核生物核糖体小亚单位上的一个RNA分子,分子量为0.6×106Da,由1500多个核苷酸组成。16SrRNA的一级结构非常保守,而决定其一级结构的16SrDNA序列也非常保守。然而,这种保守性是相对的,在保守区之间存在9~10个变异区。利用变异区序列的差异,可以对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。利用保守区序列设计引物,可以扩增出16SrDNA片段。利用16SrDNA序列可以进行细菌的种类鉴定,并分析它们之间的进化关系。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料“实验二”中提取的细菌总DNA样品。3.2仪器设备PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳电源、Bio-Rad凝胶成像系统、电子分析天平、微波炉、微量移液器(量程:10~100μL,0.5~10μL)、吸头(100μL,10μL)及吸头盒、1.5mL离心管及离心管盒、200μLPCR薄壁管、锥形瓶(250mL)和量筒(100mL和500mL)。注:离心管、PCR薄壁管和吸头等器材经121℃高温高压灭菌、烘干后备用。3.3试剂及其配制方法①引物:由宝生物工程(大连)有限公司合成,通用引物序列如下:27F:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'该对引物预扩增的目的片段长度为1465bp。②酶:rTaqDNA聚合酶,由宝生物工程(大连)有限公司生产。包含10×Buffer(Mg2+plus)、dNTP(2.5mmol/L)和rTaq(5U/μL)。③50×TAE缓冲液(pH=8.5):称取Tris242.2g,先用300mL双蒸水加热搅拌溶解后,加入约57mL冰醋酸,再加入37.2gNa2EDTA·2H2O,用冰醋酸调节pH至8.5,然后加双蒸水定容至1L,121℃高温高压灭菌后4℃保存。④SuperRed(Gelred)10000×储液。⑤6×LoadingBuffer:40%蔗糖,0.25%溴酚蓝。⑥Marker:DL2000DNAMarker。⑦Agarose琼脂糖(Sigma)。4实验步骤将提取的细菌总DNA作为PCR的模板,采用通用引物27F和1492R对16SrDNA全序列进行PCR扩增。20μLPCR反应体系中各组分的终浓度见表10-1。4实验步骤PCR结束后,吸取5μLPCR产物,加入1μL6×LoadingBuffer,混匀。使用2%琼脂糖凝胶(用1×TAE电泳缓冲液溶解琼脂糖),在20mL琼脂糖凝胶液中加入2μLSuperRed(Gelred)10000×储液。在合适位置的点样孔中加入5μLDL2000DNAMarker,将PCR产物和Marker点样到凝胶上。使用80V电压进行电泳,使用凝胶成像系统观察并拍照,检查是否获得目的片段。※注意事项:①rTaqDNA聚合酶在使用时,要注意在冰上操作,并且可以将大包装分装成独立的小包装,减少污染机会。②PCR反应极其灵敏,痕量的DNA污染也可能造成非特异性扩增,因此避免外源DNA污染非常重要。③在PCR反应中,DNA扩增片段的增加随着循环次数的增加会出现停滞效应,即平台期。通常30个左右的循环即可达到平台期,超过该阶段后,DNA扩增片段的增加会停滞。5结果与分析(1)分别以不同浓度的几个样品DNA作为模板进行PCR扩增,对DL2000DNAMarker和PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,并将电泳图放在报告中。要求在报告中对电泳图的各泳道进行标号。(2)描述PCR产物的电泳结果,根据DL2000DNAMarker分析扩增产物是否为目的片段。(3)根据电泳结果确定细菌16SrDNA的PCR扩增的最佳DNA添加量。6思考题①如何通过DL2000DNAMarker判断PCR产物是否为目的DNA片段?②如果2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时出现了非特异性片段,应该如何调整PCR的反应条件?③琼脂糖凝胶电泳图谱中出现的smear现象,可能是由哪些因素导致的?实验六

文蛤的ISSR-PCR扩增1实验目的掌握ISSR-PCR反应的原理及基本操作技术,熟悉PCR扩增体系中各组分的作用。通过ISSR-PCR扩增出微卫星之间的多态性DNA序列,并检测扩增结果。在真核生物基因组中均存在着由1~4个碱基对组成的简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR),又称为微卫星,例如(GA)n、(AC)n、(GAA)n等。同一类微卫星DNA可分布在整个基因组的不同位置,由于其重复次数不同或重复程度不完全而形成每个座位的多态性。微卫星两端有一段保守的DNA序列,通过这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物。ISSR是Zietkiewicz等人于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术。该技术检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。其原理是根据真核生物基因组中广泛存在的简单重复的SSR序列,设计出各种能与SSR序列结合的PCR单一引物,对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16~18个碱基序列,由1~4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基构成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5'或3'末端结合,促使位于反向排列且间隔不大的重复序列之间的基因组节段进行PCR扩增。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料自行提取的文蛤基因组DNA。3.2仪器设备PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳电源、Bio-Rad凝胶成像系统、电子分析天平、微波炉、微量移液器(量程:10~100μL,0.5~10μL)、吸头(100μL,10μL)及吸头盒、1.5mL离心管及离心管盒、200μLPCR薄壁管、锥形瓶(250mL)和量筒(100mL和500mL)。注:离心管、PCR薄壁管和吸头等器材需经121℃高温高压灭菌、烘干后备用。3.3试剂及其配制方法①酶:rTaqDNA聚合酶包含10×Buffer(Mg2+free)、MgCl2(25mmol/L)、dNTP(2.5mmol/L)和rTaq(5U/μL)。②引物:通用引物序列见表10-2。3实验材料及设备3.3试剂及其配制方法③50×TAE缓冲液(pH=8.5):称取Tris242.2g,先用300mL双蒸水加热搅拌溶解,然后,加入约57mL冰醋酸,再加入37.2gNa2EDTA·2H2O,用冰醋酸调节pH至8.5,最后加双蒸水定容至1L,121℃高温高压灭菌后4℃保存。④SuperRed(Gelred)10000×储液。⑤6×LoadingBuffer:40%蔗糖,0.25%溴酚蓝。⑥Marker:DL2000DNAMarker。⑦Agarose琼脂糖(Sigma)。4实验步骤将提取的文蛤基因组DNA作为聚合酶链式反应(PCR)的模板,采用ISSR通用引物进行PCR扩增。20μLPCR反应体系中各组分的终浓度见表10-3。反应程序:94℃

预变性5min94℃

变性30s低温

退火45s72℃

延伸90s

72℃

延伸7minPCR结束后,吸取加入5μLPCR产物,加入1μL6×LoadingBuffer混匀。在2%琼脂糖凝胶上点样(用1×TAE电泳缓冲液溶解琼脂糖,20mL琼脂糖凝胶液中加入2μLSuperRed(Gelred)10000×储液)。在合适位置的点样孔中加入5μLDL2000DNAMarker。通入80V电压进行电泳,使用凝胶成像系统观察并拍照,检查PCR扩增结果。循环35次5结果与分析(1)对DL2000DNAMarker和PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,并将电泳图保存在报告中。要求在报告中对电泳图中各泳道进行标号。(2)描述不同DNA样品的PCR产物的电泳结果,分别对不同引物扩增同一个DNA样品和同一个引物扩增不同DNA样品的结果进行分析。6思考题①为什么ISSR-PCR扩增的产物是多个条带?②用同一个引物扩增不同DNA样本,为何凝胶电泳检测结果显示不同个体间的DNA条带个数和条带位置存在差异?实验七

细菌16SrDNAPCR-RFLP多态性分析1实验目的了解限制性内切酶的酶切作用原理,掌握酶切的反应条件,学会分析0/1数据。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)指限制性片段长度多态性,依据一个生物体的基因组的独特特征和能被某些限制性酶识别的特殊碱基序列的特有分布方式。因此,RFLP对生物种类的鉴别具有高度的