生物工程实验指导-课件 11-生物分离工程实验

生物分离工程实验实验一

氨基酸的薄层层析法实验二

柱层析分离叶绿素实验三

凝胶色谱法分离蛋白质实验四

利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白实验五

纸电泳分离鉴定氨基酸实验一

氨基酸的薄层层析法1实验目的(1)掌握氨基酸的薄层层析法的一般原理。(2)掌握氨基酸的薄层层析法的基本操作技术。(3)掌握如何根据移动速率(Rf

值)来鉴定被分离的物质(氨基酸混合液)。2实验原理薄层层析法是色谱分析技术的一种。通常是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,而不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度也不一样,因此点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开溶剂的移动速率不同,从而可以彼此分开。(通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,可以将样品各组分分离。3实验材料及设备3.1实验材料①0.01mol/L精氨酸:精氨酸15.9mg溶于10mL90%异丙醇中。②0.01mol/L甘氨酸:甘氨酸7.5mg溶于10mL90%异丙醇中。③0.01mol/L酪氨酸:酪氨酸18.1mg溶于10mL90%异丙醇中。将上述三种溶液各取1mL混合均匀,作为氨基酸混合溶液。3.2仪器设备层析板(4cm×10cm)、小烧杯、量筒(10mL)、小尺子、毛细玻璃管、层析缸、烤箱、天平、药匙。3.3试剂及其配制方法①硅胶G。②0.2%羧甲基纤维素钠:称取羧甲基纤维素钠1g,溶于100mL蒸馏水中,在沸水浴中煮沸至无气泡,冷却,置于冰箱贮存,临用前稀释至0.2%。③展开剂:按体积比为4∶1∶1混合正丁醇、冰醋酸和水。临用时配制。④0.5%茚三酮丙酮溶液:称取茚三酮0.5g,溶于100mL无水丙酮中。4实验步骤4.1薄板的制备(1)称取硅胶G0.5g放入研钵中,加1.5mL0.2%羧甲基纤维素钠溶液,研磨成均匀的稀糊状。(2)将上述糊状物倾倒在层析板(图11-1)上,轻轻地晃动层析板,使硅胶G均匀分布,表面平坦、光滑、无水层及气泡,然后水平放置在空气中使其自然干燥。(3)待层析板上的硅胶G干燥后,放入105℃的恒温干燥箱内进行活化,0.5h后取出,冷却至室温后备用。4实验步骤4.2点样(1)在距离层析板一端约2cm处用细线向下压硅胶,压成一条点样线。(2)用直径约1mm的毛细玻璃管分别吸取甘氨酸、精氨酸、酪氨酸及混合氨基酸溶液,在点样线上每隔0.8cm点样一次,每次点样量约5μL,点样直径为2~3mm。待点样处干燥后,再在原点样处重复点样一次。4.3展层(1)将层析板的点样端向下,倾斜放入层析缸内,使其与缸底平面约呈30°角。(2)用长颈漏斗加入展开剂,使展开剂液面距离点样处1~2cm。(3)盖上层析缸盖,进行展开。(4)当展开剂前沿到达层析板全长的3/4处停止展开,取出层析板,记下展开剂前沿位置,并将层析板置于干燥箱中烘干。4.4显色(1)用0.5%茚三酮丙酮溶液均匀喷洒于层析板上。(2)将层析板置于105℃干燥箱内烘干,约2min后即可显出粉红色斑点。5结果与分析(1)计算

Rf

值6思考题①氨基酸的薄层层析法和纸层析法有何区别?②吸附实验中吸附剂的选择根据是什么?③硅胶的吸附力与含水量的关系。(2)分别测量甘氨酸、精氨酸、酪氨酸的

Rf

值,作为标准值。甘氨酸、精氨酸、酪氨酸的

Rf

值分别约为0.22、0.08、0.47。(3)测出混合液中分离出的各种氨基酸的

Rf

值,并与标准值对照,以确定混合液中的氨基酸种类。※注意事项:①层析板活化前必须干燥,否则硅胶易开裂。②第二次重复点样须待第一次点样处干燥后才能进行。③层析时缸盖一定要紧密盖好。实验二

柱层析分离叶绿素1实验目的(1)通过绿色植物色素的提取和分离,了解天然物质分离提纯的方法。(2)了解柱层析的基本原理,掌握柱层析的操作技术。(3)通过柱层析分离操作,加深对微量有机物色谱分离鉴定的原理的理解。层析法是一种物理分离方法。柱层析法是层析方法中的一个类型,分为吸附柱层析法和分配柱层析法。本实验仅介绍吸附柱层析法。吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。它是根据混合物中各组分的分子结构和性质(极性)来选择合适的吸附剂和洗脱剂。通过利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异,以及各组分在洗脱剂中的溶解性能差异,实现混合物的分离。吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的多孔性或粉末状固体吸附剂(如氧化铝、硅胶等)。当混合物溶液流过吸附柱时,各组分同时被吸附在柱的上端,然后从柱顶不断加入溶剂(洗脱剂)洗脱。由于不同化合物吸附能力不同,随着溶剂下移的速度也不同,于是混合物中各组分按吸附剂对它们吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带(图11-2)。2实验原理2实验原理在洗脱过程中,柱中不断发生吸附与溶解的交替现象。被吸附的组分被溶剂溶解并带出,随后遇到新的吸附剂颗粒再次被吸附,而新流下的溶剂又将其溶解并继续向下移动。经过一段时间后,各组分得以完全分离。继续用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分首先随溶剂流出,依次收集各组分直至所有组分全部洗脱。绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式,即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg),是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是叶绿素b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团,但较大的烃基结构使其易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡

萝卜素(C40H56)是具有长链结构的共轭多烯。叶黄素(C40H56O2)是胡萝卜素的羟基衍生物,它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比,叶黄素较易溶于醇,而在石油醚中的溶解度较小。本实验是用中性氧化铝作吸附剂,分离叶绿体色素混合物。中性氧化铝是一种极性吸附剂,对极性较强的物质(如叶绿素a、叶绿素b)的吸附力强;对极性较弱的物质(如胡萝卜素、叶黄素)的吸附力较弱。因此,应选择极性小的洗脱剂(如石油醚)首先将胡萝卜素洗脱,叶绿素则留在层析柱的上部,叶绿素的洗脱则要用极性较大的洗脱剂(如乙醇)。洗脱的先后顺序为:胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a,叶绿素b。3实验材料及设备3.1实验材料新鲜的菠菜叶片。3.2仪器设备研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸、载玻片。3.3试剂硅胶G、中性氧化铝、石油醚(60~90℃)、丙酮、乙酸乙酯、无水硫酸钠、氯化钠溶液、羧甲基纤维素、无水乙醇、丁醇。4实验步骤(1)菠菜色素的提取①称取20g菠菜叶,加入少许石英砂,再加入20mL无水乙醇,用研钵研磨成浆。用脱脂棉过滤,保存滤液。滤渣再用无水乙醇提取一次,合并滤液。滤渣再加入30mL石油醚提取一次,过滤,合并滤液,转移至分液漏斗中。加入40mL饱和氯化钠溶液震荡,弃去下层溶液。分别加入20mL水震荡洗涤几次,直至下层无色,保留上层溶液,转移至三角瓶中。加入无水硫酸钠干燥5min,备用。②样品的浓缩将提取液放入蒸馏烧瓶中,蒸除多余的石油醚,至剩余液体5~8mL左右,以备加样使用。(2)薄层层析取四块显微载玻片,用硅胶G加0.5%羧甲基纤维素调制后制板。晾干后在110℃活化1h。展开剂a:石油醚-丙酮(体积比为8∶2);展开剂b:石油醚-乙酸乙酯(体积比为6∶4)。取活化后的层析板,点样后,小心放入预先加入选定展开剂的广口瓶内,盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时,取出层析板,在空气中晾干,用铅笔标记溶剂前沿和各斑点的位置,并进行测量,分别计算出Rf值。分别用展开剂a和展开剂b进行展开,比较不同展开剂系统的展开效果。观察斑点在板上的位置,并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的

Rf

值的大小次序。注意更换展开剂时,须干燥层析瓶,以避免不同展开剂之间的交叉污染。4实验步骤(3)柱层析在层析柱中,加入3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉,先在小烧杯中用石油醚浸湿,挤压以驱除气泡,然后放在层析柱底部,轻轻压紧,塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝(150~160目),从玻璃漏斗中缓缓加入。小心打开柱下活塞,保持石油醚高度不变,使流下的中性氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻敲击层析柱的周围,使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制,既不能满溢,更不能干涸。装完后,上面再加一片圆形滤纸,打开下端活塞,放出溶剂,直到中性氧化铝表面溶剂剩下1~2mm高时关上活塞(注:在任何情况下,中性氧化铝表面不得露出液面)。将上述菠菜色素的浓缩液,用滴管小心地加到层析柱顶部。加完后,打开下端活塞,让液面下降到柱面以上1mm左右,关闭活塞,加数滴石油醚,打开活塞,使液面下降,经几次反复,使色素全部进入柱体。待色素全部进入柱体后,在柱顶小心加洗脱剂———石油醚-丙酮溶液(体积比为9∶1)。打开活塞,让洗脱剂逐滴放出,层析即开始进行,用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时,取另一锥形瓶收集,得橙黄色溶液,它就是胡萝卜素。用石油醚-丙酮溶液(体积比为7∶3)作洗脱剂,分离出第二个黄色带,即是叶黄素。再用丁醇-乙醇-水(体积比为3∶1∶1)洗脱,分离出叶绿素a(蓝绿色)和叶绿素b(黄绿色)。5结果与分析经过薄层层析分离后,叶绿素a为蓝绿色,叶绿素b为黄绿色,叶黄素为鲜黄色,胡萝卜素为橙黄色。色素带自上而下分别为:胡萝卜素,叶绿素a,叶绿素b,叶黄素。衡量各色素带在薄层中的位置的相对比移值(Rf

),计算公式为各色素带到原点的距离为展开剂前沿:_____________cm;胡萝卜素:_____________cm,Rf

=_____________;叶绿素a:_____________cm,Rf

=_____________;叶绿素b:_____________cm,Rf

=_____________;叶黄素:_____________cm,Rf

=_____________。事实上层析板上不止出现四种色素带,但与实验无关,故忽略。6思考题①柱层析分离是根据什么原理进行的?②柱层析和薄层层析主要应用在哪些方面?③薄层层析中常用展开剂的极性大小顺序是怎样的?展开剂极性对样品的分离有何影响?点样、展开、显色等操作步骤中,分别需注意什么?实验三

凝胶色谱法分离蛋

白质1实验目的(1)掌握凝胶色谱法的基本原理。(2)掌握凝胶色谱法的基本操作。(3)了解物质在色谱柱中的洗脱行为与分配系数的关系。本实验将蓝葡聚糖-2000(相对分子质量为2000kDa)、细胞色素c(相对分子质量17kDa)和DNFP-甘氨酸(二硝基氟苯-甘氨酸,相对分子质量为0.5kDa)的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50(SephadexG-50)的色谱柱,以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。蓝葡聚糖-2000的相对分子质量最大,全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中,而未进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最快,最先流出柱,其Ve=V0

即Kd

=0。DNFP-甘氨酸的相对分子质量最小,因不被排阻而可以完全进入凝胶颗粒内部,洗脱速度最慢,最后流出柱,其Ve=Vi+V0

即Kd=1。细胞色素c的相对分子质量在上述二者之间,其洗脱速度居中。可以通过蓝、红、黄三种不同颜色直接观察到三种物质分离的情况,并通过洗脱体积计算Vi、V0

和各自的Kd

。Kd

与Ve、V0

和Vi

的关系为2实验原理2实验原理式中

Kd———分配系数,表示其被排阻的程度,只与被分离物质相对分子质量的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关;V0———外水体积,色谱柱内凝胶颗粒间隙,这部分体积称为外水体积,亦称间隙体积;Vi———内水体积,因为凝胶为三维网状结构,颗粒内部仍有空间,液体可进入颗粒内部,即颗粒内间隙的总和为内水体积,又称定相体积(不包括固体支持物的体积Vg);Ve———峰洗脱体积,指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积。通常情况下,0<Kd

<1,当Kd>1时,说明凝胶对组分有吸附作用。在实践中,Vi

不易准确测定,常用有效分配系数

Kav(

Kav

是把整个凝胶相作为固定相,洗脱剂作为流动相)代替Kd,可表示为式中

Vt———柱体积,从柱的底板到凝胶沉积表面的体积,在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床。3实验材料及设备3.1实验材料交联葡聚糖G-50。3.2仪器设备电炉子、玻璃色谱柱1cm×25cm、蠕动泵、收集器、漏斗。3.3试剂及其配制方法①2mg/mL的蓝葡聚糖-2000溶液。②2mg/mL的细胞色素c溶液。③DNFP-甘氨酸:称取甘氨酸0.15g溶于1.5mL10%NaHCO3

溶液中,调节溶液pH至8.5~9.0。称取0.15g二硝基氟苯(DNFP),溶于3mL微热的95%乙醇溶液中,待充分溶解后,迅速倒入甘氨酸溶液中。将混合溶液置于沸水浴中加热5min(注意防止乙醇沸腾溢出)。冷却后,加入2倍体积的95%乙醇,可见黄色DNFP-甘氨酸沉淀,以2000r/min的速度离心1.5min,弃去上清液,用95%乙醇洗沉淀3~4次。最后,用1mL蒸馏水溶解沉淀,得到DNFP-甘氨酸液,备用。4实验步骤(1)凝胶的溶胀称取交联葡聚糖G-50约7g,置于100mL烧杯中,加入适量蒸馏水。平衡几次,倾去上浮的细小颗粒,将烧杯置于沸水浴中煮沸1h(此为加热法溶胀,如在室温溶胀,需放置3h)。取出烧杯,倾去上层液中的细颗粒,待冷却至室温后再进行装柱。(2)样品制备取配制好的蓝葡聚糖-2000、细胞色素c和DNFP-甘氨酸各0.3mL,混匀。(3)装柱将洗净的色谱柱保持垂直位置,关闭出口,柱内加入约2mL洗脱液。一次性将凝胶从色谱柱上方经漏斗加入柱内。打开色谱柱底部出口,接通蠕动泵,调节流速0.3mL/min。凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到色谱柱内部,最后使凝胶床沉降达20cm高。操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液体,以防色谱床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一圆形滤纸,以免加入液体时冲起凝胶。(4)加样用长胶头滴管吸取凝胶床表面的洗脱液,使洗脱液恰好到床表面,关闭出口。小心地把样品沿色谱柱壁加入并使其成一薄膜(切勿搅动床表面)。打开出口,使样品溶液渗入凝胶内并开始收集流出液,计量体积。(5)洗脱并收集样品全部进入凝胶层后,分三次加入少量洗脱液洗下柱壁上样品,最后接通蠕动泵,调节流速为0.3mL/min,用部分收集器收集,每管1mL。仔细观察样品在色谱柱内的分离现象,并以“-”“+”符号记录三种物质洗脱液的颜色及深浅程度。(6)绘制洗脱曲线以洗脱体积为横坐标,洗脱液的颜色度(-、+、++、+++)为纵坐标(相应指示出洗脱液内物质浓度的变化),在坐标纸上作图,即得洗脱曲线。5结果与分析(1)根据Vt、Vi、V0计算各组分的Kd。(2)分析洗脱曲线,讨论组分分离情况和实验注意事项。※注意事项:①在装柱过程中,凝胶悬液较稀有利于装柱,且要一次性倒入漏斗中,保证凝胶颗粒沉降均一和连续。②交联葡聚糖凝胶的商品名为Sephadex,不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯数字为凝胶吸水值的10倍。例如,G-25表示每克凝胶膨胀时吸水2.5g,同样G-200表示每克凝胶吸水20g。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。因此,“G”反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围。SephadexLH-20是SephadexG-25的羧丙基衍生物,能溶于水及亲脂溶剂,用于分离不溶于水的物质。6思考题①对于蛋白质的分离纯化,目前研究使用较多的还有哪些方法?②凝胶色谱法的主要原理是什么?③装柱的要点有哪些?怎样检查柱是否装的均匀?影响分离效果的主要因素有哪些?实验四

利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白1实验目的掌握盐析和等电点沉淀法的基本原理和操作。乳蛋白主要包括酪蛋白、乳清蛋白、乳白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白等,它是牛奶及其他乳制品中重要的营养成分。牛奶中主要含有酪蛋白,酪蛋白在pH为4.8时会沉淀,而乳清蛋白则在pH等于3左右才会沉淀。利用这一性质,可以先将牛奶的pH降至4.8,或者在加热至40℃的牛奶中加入硫酸钠,使酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇,因此可以利用乙醇去除杂质。将除掉酪蛋白的溶液pH调至3左右,使乳清蛋白沉淀析出,从而得到乳清蛋白。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料脱脂牛奶。3.2仪器设备烧杯、玻璃试管、离心管、磁力搅拌器、pH计、离心机等。3.3试剂及其配制方法①无水硫酸钠、盐酸、氢氧化钠、滤纸、浓盐酸、乙醇、0.2mol/LpH为4.8醋酸-醋酸钠缓冲液。②缓冲溶液的配制0.2mol/LpH为4.8醋酸-醋酸钠缓冲液(先配A液与B液):A液(0.2mol/L醋酸钠溶液):称取NaAc·3H2O54.44g,定容至2000mL。B液(0.2mol/L醋酸溶液):取醋酸(含量>99.8%)12mL,定容至1000mL。取A液1770mL,B液1230mL混合,即得pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。4实验步骤4.1盐析法制备酪蛋白(1)将50mL脱脂牛奶倒入烧杯中,40℃搅拌。(2)第一种方法:在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠,之后继续搅拌10min。第二种方法:在搅拌下慢慢加入100mL预热至40℃、pH为4.8的醋酸缓冲液。用pH计调节pH至4.8。(3)用细布过滤,分别收集沉淀和滤液。将沉淀放入30mL乙醇中,然后倾倒于布氏漏斗中过滤,去除乙醇溶液,抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出,在表面皿中展开,去除乙醇,干燥后得到酪蛋白,准确称量。4.2等电点沉淀法制备乳清蛋白(1)将操作4.1中所得到的滤液置于烧杯中,一边搅拌,一边利用pH计测量酸度,并用盐酸调节pH至3。然后倒入离心管中,6000r/min离心15min,倒掉上清液。在离心管中加入10mL去离子水,振荡,使管内下层物质重新悬浮,并用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0,此时大部分蛋白质均会溶解。(2)将上述溶液以6000r/min离心10min,将上层液倒入50mL烧杯中,将烧杯置于磁力搅拌器中搅拌,并调节pH至3.0。(3)将上述溶液以6000r/min离心10min,倒掉上层液。取出沉淀,干燥后称量。5结果与分析(1)计算每100mL脱脂牛奶制备出的酪蛋白数量,并与理论产量3.5%相比较。(2)求出实际获得的百分数。(3)计算每100mL脱脂牛奶所制备的乳清蛋白数量。6思考题①讨论影响得率的因素。②制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?③试设计另一种提取酪蛋白的方法。实验五

纸电泳分离鉴定氨基酸1实验目的(1)了解纸电泳法分离带电颗粒的原理。(2)掌握氨基酸纸电泳分离鉴定的方法。氨基酸是两性物质,其带电荷情况与溶液的pH有关,当溶液的pH低于其等电点时,氨基酸带正电荷;反之,则氨基酸带负电荷。谷氨酸的等电点为3.22,甘氨酸为5.97,赖氨酸为9.47。在pH为5.97的缓冲溶液中,谷氨酸带负电荷,赖氨酸带正电荷,甘氨酸基本不带电荷。在电场的作用下,谷氨酸向正极移动,赖氨酸向负极移动,而甘氨酸则停留不动,从而使三种氨基酸的混合物得到分离。将标准物质与样品在同一张滤纸上按相同的操作条件进行电泳,显色后根据组分的迁移距离和方向与标准物对照,可进行定性分析,根据组分斑点的大小和颜色的深浅,可进行初步定量分析。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料①赖氨酸溶液(6g/L):称取120mg赖氨酸,加水溶解后定容至20mL。②甘氨酸溶液(8g/L):称取160mg甘氨酸,加水溶解后定容至20mL。③谷氨酸溶液(6g/L):配制方法同①。④混合氨基酸溶液:将上述三种氨基酸溶液等体积混合。3.2仪器设备Dy-1型电泳仪、10μL微量注射器、喷雾器、吹风筒、新华1号滤纸条或层析滤纸条(60