第十四章第二次

基因信息的传递第三篇授课教师：李晓坤生物化学与分子生物学教研室邮箱：lixiaokun0026@163.com电话物化学1GeneticRecombination&GeneticEngineering基因重组与基因工程第十四章2第一节：DNA的重组第二节：重组DNA技术第三节：重组DNA技术与医学的关系本章主要内容3回顾：DNA的重组：重组DNA技术相关概念：同源重组：最基本细菌的重组：接合、转化、转导、细胞融合特异位点重组：整合酶转座重组：插入序列、转座子DNA克隆工具酶：限制性内切酶目的基因基因载体4二、重组DNA技术的基本原理与操作基本原理

(基本过程)：目的基因的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选目的基因的表达5

SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS6DNA合成仪已知核苷酸序列目的DNA（合成的片段较小）1.化学合成法获取目的基因：91.化学合成法获取目的基因：由已知产物的氨基酸序列可以推测出基因可能的DNA序列。小分子活性多肽基因的合成，如：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。10基因组DNA文库：存在于转化细胞内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。2.从基因组DNA文库获取目的基因：组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌11限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因组文库

图14－11用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库123.从cDNA文库获取目的基因：逆转录酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ酶/碱水解

TTTT组织或培养细胞mRNA

cDNA载体

cDNA与载体DNA连接

导入大肠杆菌

鉴定cDNA文库的克隆数与特性13DNA利用了DNA的变性和复制的机制：加热退火、延伸单链DNA复制的DNA双链引物、dNTP聚合酶PCR（polymerase

chainreaction）:

即聚合酶链反应技术，是一种在体外利用酶促反应快速扩增特定核酸片段的技术。4.聚合酶链反应(PCR)获取目的基因：14PCR测序反应示意图变性(95℃)引物连接(Tm－5℃)半保留复制(72℃)反复循环15PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增

聚合酶链反应（PCR）16目的基因克隆载体重组体（二）克隆载体的选择和构建克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。选择和构建合适的载体是基因工程成功的关键步骤。载体的选择和构建要根据基因工程的目的。目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改进方法也不同。17（三）外源基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体（即DNA的体外重组），主要靠DNA连接酶。连接方式：1.粘性末端的连接2.平端连接

3.同聚物加尾连接4.人工接头连接18条件：末端碱基序列互补1.粘性末端连接：方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（三）外源基因与载体的连接19BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割DNA连接酶15ºC重组体同一限制酶切位点连接：20不同限制酶切位点(配伍末端)的连接：配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。MboⅠ切割位点

GATCCTAGBamHⅠ切割位点

GGATCCCCTAGGCTAGGATCCG

GATCC

CTAGG21不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接：EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切DNA连接酶15ºC重组体连接方向一定22限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：2.平端连接：23目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连平端连接24在末端转移酶

(terminaltransferase)

的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接：利用同聚物序列，比如多聚A与多聚T之间在退火作用下完成连接。属于粘性末端连接的一种特殊形式。这是人工提高连接效率的一种方法。255´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶

5´3´

3´5´

5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´

5´

3´

3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´同聚物加尾连接26由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。4.人工接头连接：对酶切产生的平端DNA片段，在连接前将磷酸化的接头连到平末端，使产生新的限制性核酸内切酶位点，再用识别新位点的限制性酶切除接头远端，产生粘性末端。也是粘性末端连接的一种特殊形式。27人工接头连接EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ28（四）重组DNA导入受体菌目的基因与载体在体外重组后要导入受体细胞才能进行扩增和表达。无性繁殖受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)29导入方式：

转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)感受态细胞：选择合适受体菌后，可采取一些适当方法处理受体细胞，使其处于最容易接收重组体的状态，称为感受态细胞。细菌

真核细胞

哺乳动物

30（五）重组体的筛选

筛选

(screening)

是从大量细胞克隆中，得到含有目的基因的阳性重组子细胞或菌落的过程。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞的表达情况不同，可采取相应的筛选方法。311.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选

32（1）抗药性标志选择

利用携带某种抗药性标志基因的克隆载体进行筛选;

只有含这种抗药基因的转化细菌才能在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落，从而区别转化菌和非转化菌。如质粒pBR322:含氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr

）。33(插入失活法)抗药性标记选择634（2）标志补救

是利用重组DNA和受体细胞之间基因产物的互补性来筛选重组体的方法。如:酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因、pUC质粒载体等

35组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救36依据蓝白菌落的出现筛选鉴定重组与非重组菌落。pUC质粒载体，含有为

-半乳糖苷酶N-端

-片段编码的基因突变型大肠杆菌可表达

-半乳糖苷酶C-端的

片段单独

-片段或

片段均无

-半乳糖苷酶活性

宿主细胞与克隆载体共表达时，才能形成完整的

-半乳糖苷酶

分解发色底物，形成蓝色菌落，称为

-互补。不能形成完整的

-半乳糖苷酶，形成白色菌落。α互补：37

α互补的检测38（3）分子杂交法

是利用探针与转移至硝酸纤维素膜上的

DNA片段进行分子杂交。探针：放射性如32P标记，且与目的基因同源如：原位杂交、Southernblot。39原位杂交40Southernblot41（4）免疫学筛选法

适用于基因表达性载体的筛选原理：抗原（表达产物）与抗体的免疫反应优点：特异性强、灵敏度高。42重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交中文43重组DNA技术：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体表达44（六）克隆基因的表达表达体系的建立:表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化基因工程的表达系统包括原核和真核表达体系。45E.Coli表达体系的不足：

①不宜表达真核基因组DNA②不能加工表达真核蛋白质③表达的蛋白质常形成不溶性包涵体

④很难表达大量可溶性蛋白原核表达体系：

E.coli表达体系最为常用标准：①选择标志②强启动子③翻译调控序列④多接头克隆位点E.Coli表达体系的优点：培养方法简单、迅速、经济，适合大规模生产工艺。46

优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA

可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累

缺点：操作技术难、费时、经济

转染

——将表达载体导入真核细胞的过程。真核表达体系：

酵母、昆虫、乳类动物细胞方法：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染电穿孔、脂质体转染、显微注射47（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分。（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。（3）外源基因的导入。（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。（5）外源基因表达产物的生理功能的核实。（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析。（7）生态与进化安全保障机制的建立。（8）消费安全评价。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：48第三节

重组DNA技术与医学的关系非常密切并前景远大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective49一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。脆性X综合征：(CGG)n重复序列

Kallmann综合征：KALIG-1基因缺失突变

比如：5020世纪80年代，转基因微生物发酵，药用多肽；目前，转基因动物，人类活性多肽；转基因动物：

采用基因工程技术，通过受精卵或早期胚胎细胞的基因转移，将外源基因与动物染色体结合，在动物体内得以表达并稳定的遗传给后代的一类动物。51（二）生物制药动物药厂：通过转基因动物生产感兴趣的基因

把YFG放在β-乳球蛋白启动子下

↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕母羊

↓YFG在乳腺中表达

↓乳汁中提纯YFG蛋白利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界的一项重大产业；已有

50

多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态；2000

年我国基因工程药物和疫苗年销售额已达近

20

亿元。﹡YFG：“你所宠爱的基因”(yourfavoritegene)

52（二）生物制药英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊乳汁中含有能够治疗囊性纤维变性的人YFG蛋白。囊性纤维变性：53

重组DNA医药产品预防霍乱口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防乙肝乙肝疫苗(CHO，酵母)利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗单克隆抗体抗组织损伤超氧化物歧化酶激活、剌激各类白细胞白细胞介素抗病毒感染及某些肿瘤干扰素(

1b，

2a，

2b，

)治疗糖尿病胰岛素治疗侏儒症生长素刺激细胞生长与分化生长因子(bFGF，EGF)剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子促进凝血血液因子VIII抗凝组织胞浆素原激活剂功能产品54是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传病所涉及的基因置换、缺失或插入等突变，又称DNA诊断。（三）基因诊断(geneticdiagnosis)基本过程：区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断55基因诊断的特点：①针对性强：以基因作为检查材料和探查对象，属于病因诊断②特异性高：以分子杂交为基本原理，选用特定的基因序列为探针③诊断灵敏度高：pg水平，多种检测技术均有放大效应④适应性强、诊断范围广⑤早期诊断：往往在疾病出现前，或者患儿出生前就可确定（三）基因诊断(geneticdiagnosis)56美国前副总统

Humphrey，1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞，诊断为良性“慢性增生性囊肿”，未行手术治疗。九年后，诊断为“膀胱癌”，两年后死于该病。尿样：p53突变!（三）基因诊断(geneticdiagnosis)57（四）基因治疗

(genetherapy)1．定义：基因治疗是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。体细胞基因治疗

(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗

(germlinegenetherapy)2．方式：581990年，第一例腺苷脱氨酶缺陷患者治疗成功。遗传病、恶性肿瘤、心脑血管病以及病毒感染性疾病等疑难病的基因治疗方面进行了大量实验研究。如将固氮基因引入水稻，就不用再施氮肥591.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（五）遗传疾病的预防60基因重组与基因工程：DNA的重组：重组DNA技术：重组DNA技术与医学的关系：同源重组：最基本细菌的重组：接合、转化、转导、细胞融合特异位点重组：整合酶转座重组：插入序列、转座子相关概念：工具酶、基因载体等原理步骤：分、切、接、转、筛（表）目的基因的获取重组体的连接筛选克隆基因的表达61本章重点：基因重组，转化，转导，特异位点重组，转座重组，基因工程，重组DNA，DNA克隆，限制性核酸内切酶，基因载体

重组DNA技术的基本原理及操作步骤获得目的基因的方法外源基因与载体的连接方法重组体的筛选方法62复习63蛋白质的生物学功能有哪些？蛋白质的基本结构单位是什么？有多少种？氨基酸是如何分类的？氨基酸的理化性质：两性解离、紫外吸收、茚三酮反应概念：肽键蛋白质结构与功能（1）64蛋白质一、二、三、四级结构的定义、维系稳定的化学键蛋白质二级结构的形式、主要特点及影响因素概念：肽平面、模体、结构域蛋白质结构与功能（2）65举例说明蛋白质结构与功能的关系。简述蛋白质溶液维持稳定的因素。引起蛋白质变性的因素有哪些?变性蛋白质有何变化？概念：蛋白质等电点、蛋白质变性蛋白质结构与功能（3）66DNA与RNA在化学组成上的区别DNA二级双螺旋结构的要点核酸结构与功能比较DNA和RNA在组成、结构、功能上的不同试述mRNA、tRNA、rRNA的结构特点和功能名词：帽子结构、核酶、DNA变性、增色效应、核酸分子杂交67酶的概念酶的分子组成名词：酶的活性中心、必需基团、同工酶酶促反应的特点思考为什么酶能更有效地降低反应的活化能？酶（1）68酶（2）影响酶促反应速度的因素米－曼氏方程式；曲线特点Km的大小、意义、双倒数作图求Km磺胺药抑菌的基本原理可逆性抑制的类型及特点69酶的调节方式有哪些？酶分为几类？概念：变构调节、共价修饰调节、酶原的激活、酶活性思考酶与医学的关系。酶（3）70糖酵解代谢小结（1）概念：在缺氧条件下，葡萄糖或糖原分解为乳酸的过程称为糖酵解。反应部位：胞浆三个关键酶催化三步不可逆反应产能的方式和数量方式：底物水平磷酸化净生成ATP数量：从G开始2×2-2=2ATP

从Gn开始2×2-1=3ATP意义缺氧时迅速提供能量；为红细胞及代谢活跃组织提供能量。71糖有氧氧化的概念反应部位三个阶段的关键酶三羧酸循环的要点、意义糖有氧氧化的意义及ATP的计算糖有氧氧化小结（2）1分子3-磷酸甘油醛彻底氧化后产生几分子ATP？72小结（3）磷酸戊糖途径的限速酶、主要产物、意义糖原合成与分解的概念、代谢器官、关键酶、意义糖原合成与分解调节的特点

乳酸循环糖异生的概念、器官、原料、关键酶、意义

血糖的来源和去路④胰岛素、胰高血糖素调节血糖的机制小结（4）73脂类代谢小结（1）1、脂类的种类及功能；必需脂酸2、脂肪动员的概念、限速酶、产物3、脂酸氧化分解的过程、限速酶；脂酸β氧化的步骤、直接产物4、软脂酸彻底氧化产生ATP的计算74小结（2）1、酮体的组成；合成的部位、原料、关键酶；酮体生成的意义。2、脂酸合成的部位、原料、关键酶；3、脂肪合成的部位、原料、两种途径75小结（3）1、磷脂的种类、合成原料、功能2、胆固醇合成的部位、原料、限速酶3、胆固醇的功能及代谢去路乙酰辅酶A的来源和去路有那些？3-磷酸甘油的来源和去路有那些？76小结（4）1、血浆脂蛋白的分类2、载脂蛋白的概念、功能3、血浆脂蛋白的合成部位、组成特点及功能简述糖代谢和脂类代谢的联系77小结

1.生物氧化的概念、生理意义。

2.呼吸链的概念、组成成分；两条呼吸链的排列顺序。

3.底物水平磷酸化、P/O的概念。

4.氧化磷酸化的概念、偶联部位。

5.NADH两种穿梭途径。78氨基酸代谢1、氮平衡、必需氨基酸、氨基酸代谢库2、氨基酸的脱氨基作用（类型）3、血氨的来源、去路；转运形式4、尿素的合成（器官、原料、酶）5、一碳单位（概念、载体、生理意义）79

1、嘌呤、嘧啶核苷酸从头合成的

原料、；分解产物；

2、脱氧核苷酸的生成。核苷酸代谢（出题较少）80肝的生物化学

①肝脏在物质代谢中的作用②生物转化的概念、主要器官、意义及生物转化反应的主要类型。③胆汁酸的肠肝循环及生理意义。④胆红素的生成、运输、肝脏转化、肠道转变和胆素原的肠肝循环；三种黄疸的胆色素代谢异常的特点81复制小结（1）DNA复制的基本规律：3个参与DNA复制的物质：模板、底物、酶、引物、其他蛋白因子名词：半保留复制、双向复制、复制叉、复制子、半不连续复制、领头链、随从链、冈崎片段、Klenow

片段思考题1、试述参与DNA复制的物质及其作用。2、原核与真核DNA聚合酶的比较。3、思考生物维持遗传信息稳定的机制。82小结（2）原核DNA复制起始、延长、终止过程的主要事件真核DNA复制的主要特点名词：引发体、端粒酶思考题1、简述原核DNA复制的过程。2、真核DNA复制与原核的不同之处？(起点、酶、复制因子、引物及冈崎片段长度、切除引物、末端复制、核小体装配、时